Abstract
Muitos tumores são mais rígidos do que o seu tecido circundante. Este aumento de rigidez tem sido atribuído, em parte, a uma elevação dependente da Rho-miosina II fosforilação da cadeia leve. Para caracterizar este mecanismo ainda mais, estudamos miosina quinase da cadeia leve (MLCK), a principal enzima que fosforila a miosina II cadeias leves. Nós antecipado que os aumentos na expressão e actividade MLCK iria contribuir para o aumento da rigidez das células cancerosas. No entanto, descobrimos que MLCK ARNm e os níveis da proteína são substancialmente menos em células e tecidos de cancro do que em células normais. Consistente com esta observação, as células cancerosas colagénio 3D contrato matrizes muito mais lentamente do que células normais. Curiosamente, inibindo MLCK ou Rho-quinase não afetou as contrações gel 3D enquanto blebbistatin parcialmente e citocalasina D contrações maximamente inibidos. imagem de células vivas de células em géis de colagénio mostraram que citocalasina D inibiu projecções filopodia, como que se formam entre células enquanto um inibidor MLCK teve nenhum efeito sobre estas projecções. Estes dados sugerem que a fosforilação da miosina II é dispensável em regular as propriedades mecânicas dos tumores
citação:. H-Yu J, Serebryannyy LA, Fry H, H Greene, Chernaya O, Hu W-Y, et ai. (2013) Tumor Rigidez não está relacionado com miosina Luz fosforilação Chain em células cancerosas. PLoS ONE 8 (11): e79776. doi: 10.1371 /journal.pone.0079776
Autor: Michael F Olson, Instituto Beatson para Cancer Research Glasgow, Reino Unido
Recebido: 11 de junho de 2013; Aceito: 25 de setembro de 2013; Publicação: 04 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Compatível com parte por doações da Northwestern University Ciências físicas Oncology Center (CA143869) sub-prêmio para PdeL, do National Institutes of Health para SG (CA113975), GP (ES018758, ES02207 e CA172220) e ZS (ARRA HD044713), a Sociedade linfoma e leucemia (White Plains, Nova Iorque, Estados Unidos da América), a American Gastroenterological Association e UIC Gastrointestinal e doença hepática fundo para SG, um Áreas de Excellence Award do Gabinete do vice-chanceler para a Investigação, UIC para NM e um American Heart Association comunhão (13PRE17050060) para LAS. Os autores comprovar que não têm interesses financeiros concorrentes. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Muitos tipos de tumores podem ser detectados por palpação, porque eles são mais rígidos ou mais dura do que o tecido circundante. As propriedades mecânicas de um tumor são determinadas pelos efeitos e interacções de múltiplos parâmetros [1] combinadas. O estroma, a composição e a rigidez da matriz extracelular, a integrina de ligação, aumento da vascularização, a acumulação de fluido e a presença de células imunes tais como macrófagos contribuem para a rigidez global do tumor [1-3]. As características físicas das células transformadas, que podem ser afectadas pela assinatura genética das células [4] e o microambiente do tumor [5,6] desempenham um papel importante na determinação da rigidez do tumor. rigidez celular é determinada principalmente pela actina-miosina II interacções [7,8]. A interacção actina-miosina II em células não musculares é regulada pela fosforilação de cadeias leves de miosina (MLC) [9]. Actina e fosfo-miosina II compreendem o motor molecular que converte ATP em trabalho mecânico em células de músculo liso e não-musculares [9-11] e um aumento na MLC fosforilação tem sido implicado na determinação da rigidez do tumor [1,2].
Existem duas vias principais que regulam MLC fosforilação. Uma via envolve miosina quinase da cadeia leve (MLCK). MLCK é uma enzima dependente de cálcio-calmodulina que fosforila a cadeia leve reguladora de músculo e não músculo liso miosina II [9,10]. Ao contrário de outras proteínas quinases que fosforilam substratos múltiplos, MLC pareceu ser o único substrato para MLCK. MLC fosforilação /desfosforilação regula a contração do músculo liso [9] e muitos outros processos dependentes de energia, incluindo a divisão celular [10] e a motilidade celular [11,12]. Uma vez que a proliferação celular e colonização metastático são dois dos aspectos mais perniciosos do cancro, é razoável prever um papel importante para MLCK no crescimento do tumor e colonização metastático. Em apoio a esta ideia, MLCK tem sido implicada na sobrevivência celular [13,14] e inibição da MLCK foi mostrado para induzir apoptose [13,15] e para diminuir o crescimento do tumor [15]. A diminuição da fosforilação MLC também tem sido implicado na insuficiência citocinese em células cancerosas [16].
A segunda via envolve a Rho GTPase Um mediada a activação de Rho-quinase ROCK ou. Embora a fosforilação da MLC por pedra tem sido relatado, ROCK parece aumentar MLC fosforilação principalmente por fosforilação e inactivação de uma fosfatase de miosina [17]. Uma vez que o nível de fosforilação MLC representa um balanço entre as enzimas que fosforilam e desfosforilar MLC, inibir a fosfatase de miosina aumenta o nível de fosforilação intracelular de MLC [17]. A via de Rho /ROCK desempenha um papel crucial na comunicação de sinais extracelulares que afectam a natureza do citoesqueleto, especialmente sinais a partir da matriz extracelular, que resultam em aumento da tensão da célula [18]. Esta via também é central na regulação da motilidade celular e a metástase de cancros [12]. Bloqueio de pedra tem sido mostrado para inibir o crescimento tumoral e progressão [2] e, ainda que Rho A não é um oncogene, um aumento em Rho A expressão é detectada no cancro e da via de Rho A /ROCK está implicada na transformação de Ras-mediada [ ,,,0],4].
Assim, existe uma grande quantidade de dados que demonstram que MLC fosforilação é um ponto focal no processo de transformação, a resposta das células de cancro para a matriz extracelular e a proliferação e migração de células cancerosas. Para compreender a importância das duas principais vias de sinalização que regulam o MLC fosforilação, foi investigada a expressão de MLCK em células cancerosas. A nossa hipótese era um aumento na expressão em células de cancro MLCK resultaria no aumento da tensão do citoesqueleto e respostas contrácteis celulares. Para nossa surpresa, verificou-se que os tecidos e as células cancerosas expressam menos MLCK do que as suas contrapartes normais e géis de colagénio 3D células contratuais normais mais rapidamente do que as células cancerosas. Além disso, o bloqueio MLCK ou ROCK não tem efeito sobre as contrações gel 3D enquanto citocalasina D, o que perturba os filamentos de actina, bloqueou essas contrações.
Métodos
Células e de Tecidos A cultura
mononuclear células (MNC) ( 1,077 g /mL) foram obtidas por centrifugação de densidade em Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia) tal como descrito anteriormente [19]. fibroblastos uterino humano (células HUF) foram isoladas como descrito anteriormente [20]. A seguir as células humanas, obtidas comercialmente (fonte e número de catálogo incluídos), também foram utilizados: HeLa cancro cervical (ATCC, CCL-2), ECC-1 endometriais células de adenocarcinoma epitelial (ATCC, CRL-2923), células epiteliais da próstata primário (1 ° de próstata) de homens livres da doença, células cancerosas da próstata LNCaP (Lonza, CC-25555), as células cancerosas HCT116 do cólon (ATCC, CCL-247), MCF10A não transformada células epiteliais mamárias (ATCC, CRL-10317), MCF-7 (ATCC, HTB-22) e T47D (ATCC, CRL-2865), as células cancerígenas mamarias, células de carcinoma escamoso do pulmão H520 (ATCC, HTB-182), HEC-1A células endometriais de adenocarcinoma (ATCC, HTB-113), HEK293T imortalizada células renais (ATCC, CRL-11268), Beas-2B pulmonares transformadas células epiteliais brônquicas (ATCC, CRL-9609), células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (Lonza, CC-2517), as células endoteliais da artéria pulmonar humana ( HPAEC) (Lonza, CC-2530), artéria pulmonar células humanas normais de músculo liso (HPASMC) (Lonza, CC-2581) e células endoteliais da microvasculatura pulmonar normais humanos (HLMEC) (Lonza, CC-2527). Utilizou-se células MCF10A e Beas-2B como controlos, porque, enquanto que crescem em cultura contínua, eles não formam tumores quando injectadas em ratinhos imunodeficientes [21,22]. Cinco pares de tecidos humanos (cancerosas da bexiga, do cólon, do pulmão, dos ovários, e do útero) e o tecido circundante normal foram obtidos a partir da rede Cooperative Human Tissue, Midwest Divisão (Columbus, OH) e armazenadas congeladas a azoto líquido. Cada par de tecidos era do mesmo paciente.
Isolamento de RNA e PCR
O ARN total foi isolado a partir de células e tecidos utilizando Trizol, tal como recomendado pelo fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). O ARN foi transcrito de forma inversa com SuperScript III transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) e RT-PCR foi realizada usando 2 ul de ADNc e 0,5 uM, cada um, do iniciador directo 3BF e o 3aR iniciador para trás descrito por Marca-Arpon et ai . [23]. Quantitative PCR foi realizada utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers para o total MLCK P4610 (5 ‘AGG AGC CCG AGG TTG ATT AC 3’) e R4762 (5 ‘ACT TCC CTG CCC AGA CTT TT 3’) exons alvo 26 e 27. A especificidade dos primers foi validado por uma curva de dissociação análise e a mudança vezes na expressão de cada gene foi calculada utilizando o método ΔΔCt, com H3F3A como um controlo interno.
Western Blot as análises
peças de cada do tumor congelado e tecido normal foram excisado enquanto congelado, homogeneizado em 10X w /v de tampão de amostra de SDS quente e aqueceu-se num banho de água a ferver durante 5 min. Os sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação e 10 ul de cada amostra foram aplicados a 4-20% de gel de poliacrilamida de gradiente de SDS e transferidos para nitrocelulose. A metade superior de cada mancha foi sondada com um anticorpo de coelho, purificado por afinidade para MLCK [24] e o fundo foi sondada com um anticorpo para GAPDH. As células foram colhidas, suspensas em PBS, incubadas com fluorofosfato de diisopropilo 2 mM durante 10 minutos à temperatura ambiente e extraiu-se em ureia 9M, DTT 50 mM, Tris 50 mM, pH 6,8. Os sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação, as concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio de Bradford e 10 ug de proteína por amostra foram aplicados em géis de gradiente de 4-20% de SDS-poliacrilamida e transferidos para nitrocelulose.
Medição da fosforilação MLC
MLC foi quantificada a fosforilação nas células HeLa e HUF utilizando géis de ureia /glicerol tal como descrito por Chew et al. [25] com ligeiras modificações. As células foram tratadas com inibidores durante 2 horas, lavadas em 2X isotónica de sacarose e extraiu-se em ureia 9M, DTT 5 mM, Tris 20 mM, pH 6,8. Os sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação, as concentrações de proteína foram determinadas e 100 ug de extracto celular florins e 225 ug de extracto de células HeLa foram separados utilizando glicerol-ureia PAGE. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose, as formas fosforiladas de un- e MLC foram identificadas usando um anticorpo de MLC e a estequiometria de fosforilação (mol PO
4 /mol MLC
20) foi calculada como previamente descrito [26] .
colágeno gel Contração Ensaio de drogas e de tratamento
Para preparar a solução de gel de colágeno, meio de crescimento celular foi suplementado com 1 mg /ml colágeno tipo colagem cauda 1 de rato (BD Biosciences), neutralizada com 1 N de NaOH a pH 7,5 e tamponada com HEPES a 10 mM, foi combinado com meio de cultura de tecidos e mantidas em gelo. As células foram colhidas, contadas e 5X10
5 células foram ressuspensas em 200 ul de solução de colagénio e aplicada a poços individuais de uma placa de 48 poços (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Os géis foram incubados a 37 ° C num CO
2 incubadora durante 15-20 minutos, até que solidificou e, em seguida, separada das paredes dos poços com as pontas das pipetas. O meio de crescimento (200 ul) foi adicionado a cada poço e os géis foram deixados a contactar durante 18 horas ou como especificado. Todos os géis foram fotografados antes e após a contracção. As áreas dos géis foram medidos em Image J e a percentagem do tamanho do gel após a contracção, normalizado para a área da secção transversal do poço, foi calculada.
tratamentos com drogas de células de colágeno
ML-7, Y 27632 e blebbistatin foram adquiridos da Merck Biosciences e citocalasina D foi comprado de Enzo Life Sciences. As drogas foram diluídas em meio de crescimento e adicionou-se os geles. As concentrações de droga foram calculadas com base no volume total do material e gel de colagénio. As células não tratadas e células tratadas com DMSO foram utilizados como controlos.
Imaging ao vivo de Células de colagénio Géis 3D
células HeLa foram transitoriamente transfectadas por electroporação utilizando um BioRad Gene Pulser Xcell com quer com pLL7. 0 mCherry-LifeAct (oferta do Dr. Robert Wysolmasky) ou pEGFP-LifeAct (presente de Alexander Bershadsky), que se liga a F-actina [27]. Resumidamente, uma placa de 10 cm das células HeLa de 95% confluentes foi tripsinizadas e ressuspensas em 10 ml de meio de crescimento. As células foram centrifugadas a 2000 xg durante 5 minutos e ressuspensas em 400 ul de Opti-MEM® I Soro Reduzido meio suplementado com 4 ul de Hepes 1 M, 1 ug de plasmídeo quer LifeAct e 10 ug de ADN de esperma de salmão cortados. A electroporação foi realizada numa cuvete de 4 mm (BioRad usando a seguinte configuração (Tensão = 240 V, capacitância = 950uF, resistência = ∞) A 1:. Relação de 1 de mCherry-LifeAct e EGFP-LifeAct transfectadas células HeLa foram misturados em conjunto e um total de 2,5 x 106 células foram misturadas com 1 ml de 1 mg /mL de colagénio [28]. colagénio células solução foi adicionada a um poço de uma parte inferior de vidro Mat Tek prato de imagem (P35G-1,5-14-C), durante 20 solidificou minutos à temperatura ambiente e 2 ml de meio de crescimento foi adicionado para cobrir a célula-matriz do gel e colocado na incubadora de CO2 a 5%. os inibidores apropriado foi adicionado ao meio e as células foram fotografadas em Nikon A1 confocal de varrimento laser microscópio, utilizando Apo 100×1. 45 objectivo nA, equipado com Tokai câmara ambiental.
Declaração de Ética
os tecidos foram obtidos a partir da Rede Cooperativa Human Tissue, Centro-Oeste Division (The Ohio State University, Columbus, OH), um NCI financiado repositório de tecido (https://htrn.osu.edu). Outros pesquisadores podem ter recebido amostras dos mesmos assuntos. sangue do cordão umbilical humano foi obtido a partir do Centro de Sangue de Nova Iorque (Nova Iorque, Nova Iorque, http: /nybloodcenter.org) de acordo com as orientações Institutional Review Board (IRB). Os protocolos para isolamento de CB humana células CD34 + por NM foram aprovadas pelo IRB, da Universidade de Illinois em Chicago. células HUF foram isolados das peritalis decídua dissecados a partir de membranas da placenta após o parto vaginal normal a termo, ZS, com a aprovação prévia do IRB na Universidade de Illinois em Chicago. Não foram utilizados animais.
Resultados
O gene mylk está localizado no cromossomo 3q21 (número de acesso GenBank U48959) em seres humanos. Os vãos gene mylk 272 kb, contém pelo menos 34 exões e códigos por 3 proteínas [29]: nmMLCK (~ 210 kD), smMLCK (~ 150 kD), e uma pequena proteína denominada telokin. nmMLCK humana e smMLCK são transcritos por exons 1-34 [23] e 18-34 [30], respectivamente. A análise da estrutura exão-intrão no gene mylk humano revelou variantes de splicing de nmMLCK que possuem padrões únicos de localização em células epiteliais [30]. Pelo menos quatro isoformas musculares não-MLCK (MLCK2, 3A, 3B e 4) que são o resultado de variantes de splicing alternativo de um precursor de ARNm foram descritos [31]. Em contraste, smMLCK, codificada pelos exões 18-34 [29], é expresso principalmente nas células musculares lisas e os baixos níveis de smMLCK são detectados em células epiteliais e endoteliais (ver abaixo). Embora smMLCK e nmMLCK são estruturalmente diferentes, ambos aparentemente, apenas fosforilar a cadeia leve reguladora do músculo liso e não-muscular miosina II [9].
Foram utilizados os primers descritos por Brand-Arpon et al. [23] para analisar a expressão de mylk em tecidos e células humanos. Nós obtivemos tecidos de tumores humanos e do tecido circundante para que pudéssemos comparar a expressão de mylk. PCR quantitativa, utilizando iniciadores que têm como alvo sequências de exões 26 e 27 e reconhecem todas as formas de MLCK, os níveis de mRNA revelaram MLCK são marcadamente diminuída na bexiga, cólon, pulmão, ovário e tecidos de cancro uterino em comparação com o tecido normal (Figura 1A). Da mesma forma, qPCR em uma ampla gama de (células mononucleares fibroblastos uterino humano, células endoteliais, células do epitélio da próstata e) humano normal, as células não transformadas ou transformadas também revelaram níveis mais baixos de ARNm MLCK total (Figura 2A) em células cancerosas. Os dados na Figura 2A foram normalizados para o nível de expressão mylk em células HeLa. A maioria das células normais (HUF, HPAEC, HUVEC, 1 ° da próstata) e não-tumorigénico Beas-2B células são acima enquanto a maioria das células cancerosas, com a excepção de as células ECC-1, encontram-se abaixo do nível de expressão mylk em células HeLa.
Quantitative PCR (A) e western blot (B) as análises dos tecidos normais e cancerosas. O ARN foi isolado a partir de vários tecidos normais e de cancro eo total MLCK (a), incluindo todas as variantes de splicing de nmMLCK e smMLCK, foi detectado utilizando iniciadores de segmentação exões 26 e 27. O gene para H3F3A foi usada como um controlo interno em todas as experiências. Os dados no painel A representam as médias de qPCR análises realizadas em triplicado e as barras de erro mostram o desvio padrão. O Painel B mostra uma análise de mancha de Western utilizando anticorpos purificados por afinidade para MLCK. GAPDH foi usada como um controlo de carga.
PCR quantitativa para detectar MLCK total de (A) e Western blot (B) as análises de células normais e cancerosas em cultura. ARN e proteínas foram isolados a partir de várias células e analisados como descrito na Figura 1. Os dados no painel A representam as médias de qPCR análises realizadas em triplicado.
próxima determinado se a expressão da proteína correlacionada com os níveis de ARNm . a expressão da proteína MLCK nos tecidos e células normais e cancerosas foi determinada através da realização de transferências de Western, utilizando um anticorpo purificado por afinidade para MLCK [24]. normal da bexiga, do cólon e tecidos uterinos expressa ambas as isoformas de músculo liso de MLCK não-muscular e enquanto que o tecido de pulmão normal apenas expressa smMLCK (Figura 1C). Uniformemente, todos os tecidos de cancro expressos principalmente smMLCK nmMLCK e era difícil de visualizar nestes tecidos. Curiosamente, o padrão de expressão da proteína MLCK é muito semelhante em tecidos de cancro do pulmão normais e, embora o nível de ARNm é diminuída em tecido de cancro do pulmão (Figura 1). A análise das células de cultura de tecidos demonstraram que os fibroblastos humanos (células uterinas HUF) expressar grandes quantidades de ambas as formas de MLCK enquanto que as células não musculares humanas (endoteliais, células mononucleares do sangue do cordão umbilical) e epiteliais expressam principalmente a maior, nmMLCK (Figura 2B). O padrão de expressão em células de cancro, no entanto, é complexo. As células cancerosas (células de câncer cervical HeLa, células T47D cancro da mama, cancro da próstata células LNCaP e células promielocítica HL60), expressa smMLCK. Curiosamente, o aumento da expressão em células de cancro smMLCK aparece para acompanhar uma diminuição na expressão de nmMLCK em comparação com as suas contrapartes normais (por exemplo: comparar LNCaP e 1 ° da próstata). Consistente com os dados PCR, é evidente a partir da figura 2B que o nível total de expressão MLCK é diminuída em células cancerosas em comparação com o controle.: Células (isto é normal)
Nós exploramos as consequências funcionais da diminuição da expressão MLCK pelo crescimento de células normais e cancerosas em géis 3D e comparando a sua capacidade de contrair os géis. colagénio líquido contendo números iguais de células foram aplicadas a placas de 24 poços e deixou-se endurecer à temperatura de 37 ° C. Eles foram depois libertadas a partir dos lados das cavidades e fotografada em intervalos definidos. A Figura 3 mostra que florins e 1 ° células da próstata contrair os géis rapidamente. O aumento da concentração de colagénio a 2 mg /ml diminuiu a taxa e a extensão da contracção e 3 mg /ml de contracção impedido (Figura S1). As células HeLa e células MCF10A contratada géis para nível intermediário enquanto que as células MCF7, T47D e LNCap mal contratou os géis (Figura 3 e Figura S1).
HeLa, LNCaP, MCF7, MCF10A, HUF e células da próstata primários foram semeadas em placas de 24 poços em colagénio líquido. Após o colagénio endurecido, os géis foram libertados a partir dos lados das cavidades e deixou-se contrair durante 24 horas. Os poços foram fotografados de cima nos momentos indicados. Note-se que o florins e células da próstata primários contrair os géis a uma maior extensão do que as células HeLa e LNCaP e células MCF 10A que contrato mais do que as células MCF-7. Barra de escala = 2 mm.
Em seguida, investigaram se as contrações poderia ser bloqueado por pequenas moléculas inibidoras do citoesqueleto. Estudamos células HUF e HeLa porque contratou os géis. As células foram tratadas com ML-7, um inibidor da MLCK [32], Y27632, um inibidor da Rho quinase [33], blebbstatin, um inibidor da miosina II [34] e citocalasina D, que bloqueia a polimerização da actina [35]. ML-7 não teve nenhum efeito sobre a contracção de géis contendo florins ou células HeLa (Figura 4). Y27632 e blebbistatin tinha mínimo, embora estatisticamente significativas, efeitos sobre a contracção de géis contendo células HUF. Y27632 não têm um efeito estatisticamente significativo sobre a contracção de células HeLa, enquanto blebbistatin tiveram um efeito mais pronunciado, estatisticamente significativo em geles feitos de células HeLa. Curiosamente, citocalasina D teve o efeito mais pronunciado sobre as contracções gel e contracções quase completamente inibida por ambos os tipos de células (Figura 4). Lavar a citocalasina D resultou numa contracção rápida dos géis por ambos os tipos celulares (não mostrado).
florins (esquerda) e (direita), as células HeLa foram crescidas em culturas em 3D e tratados com inibidores como descrito. Os géis foram fotografados 24 horas mais tarde e a área de superfície dos géis individuais foi quantificada. Os dados representam a média + SEM. Uma maneira ANOVA * = p valor 0,05, *** = p valor 0,001.
Para estabelecer que ML-7 e Y27632 eram de fato inibir MLCK e Rho-quinase e diminuindo MLC fosforilação, foi utilizado gel de glicerol para quantificar as mudanças na MLC20 fosforilação. Eles mostraram que a fosforilação MLC20 é diminuída na célula em comparação com células de HeLa e HUF que ML-7 e Y27632 diminuição MLC20 fosforilação (Figura 5). Surpreendentemente, blebbistatin e citocalasina D também diminuir a fosforilação tanto MLC20.
O MLC fosforilada e não fosforilada foram separados por electroforese em gel de ureia-glicerol, transferidas para nitrocelulose e identificados utilizando um anticorpo a 20 kD MLC.
Nós também utilizamos imagens de células vivas para observar as células dentro dos géis. Estes géis não foram libertados a partir do lado das cavidades, porque o movimento introduzido pela contracção do gel tornou impossível a imagem das células. Figura 6 e o filme S1 mostram que células não-tratadas estão bem distribuídos e estender filopódios, que são ricos em actina, que chegar e tocar o outro. As células tratadas com ML-7 ou Y27632 permaneceu espalhar e continuou a estender filopios. As células tratadas com citocalasina D manteve-se espalhou e estendeu estruturas muito maiores, pseudópodos-like em vez de filopódios. Importantemente, os filamentos de actina nestas células parece fundir-se em grandes agregados no interior das células.
células HeLa foram transfectadas com Lifeact mCherry (vermelho) ou Lifeact-GFP e cultivadas em géis de colagénio. Estes géis não foram liberados das paredes dos poços para evitar artefatos de movimento. O painel A mostra células controlo (não tratados) que se estendem filapodia que o contato células vizinhas (também ver o filme na figura S2). Painéis B C mostram as células que foram tratadas com 20? M ML-7 (B) ou 6 uM citocalasina D (C). As células tratadas com ML-7 continuar a estender ativamente filopódios. As células tratadas com citocalasina D parar estendendo filopódios ea actina nessas células aparece para recolher em grandes agregados. As inserções são ampliações das áreas em caixa. bar size = 10 mm.
Discussão
Os tumores podem ser palpada, porque eles se sentem mais difícil do que o tecido circundante e muitos fatores, como descrito na Introdução, pode contribuir para a rigidez da um tumor. Um destes factores é o estado contráctil das células cancerosas no interior de um tumor. Uma das nossas premissas fundamentais quando começamos estes estudos foi que as células cancerosas se up-regular componentes do aparelho contrátil. Isto foi baseado em relatórios que contractilidade actomiosina [2], e a expressão de proteínas Rho [4], [36,37] miosina II e MLCK [38] são aumentados em tumores humanos em relação a controlos normais. Além disso, quando as células tumorais metástase eles têm de fazer o seu caminho através de uma floresta das fibras de colágeno e é razoável que eles precisam proteínas contráteis mais ativados para empurrar através da matriz extracelular.
No entanto, uma análise mais aprofundada da literatura sugerem o contrário. Experimentos usando microscopia de força de tração encontraram uma relação inversa entre a produção de força e capacidade metastática [39]. fenotipagem mecânico por meio de microscopia de força atômica [40-42] e outros métodos [43,44] têm consistentemente mostrado que as células cancerosas são mais suaves do que as células normais. Além disso, um estudo recente sugeriu que a diminuição da rigidez pode melhorar a sobrevivência de células cancerígenas na circulação [45]. Mostrámos anteriormente que sobre-expressam uma forma activa do MLCK aumenta a fosforilação de MLC e rigidez nos fibroblastos [46]. Assim, a nossa observação de uma diminuição na expressão MLCK é muito consistente com uma diminuição na rigidez em células transformadas relatada por outros laboratórios [39-44].
A Figura 2 mostra que a expressão é diminuída MLCK em células de tumor cultivadas em cultura. No entanto, os tumores não são homogéneas e, em adição a células de tumor, células imunes conter, miofibroblastos e outros tipos de células do estroma que poderia ter aumentado os níveis de MLCK e, assim, contribuem para a rigidez total do tumor. No entanto, tecidos tumorais foram analisados na Figura 1 e os dados refletem as contribuições de todos os tipos de células dentro de cada tumor. Embora os dados demonstram claramente diminuições na expressão MLCK em comparação com o tecido normal circundante, que não pode eliminar a possibilidade de que o aumento da contractilidade de não tumor, as células contribuem para a rigidez de tumores. Uma abordagem para resolver esta possibilidade é a manchar o tecido do tumor com anticorpos para MLCK e para quantificar o nível de coloração em células cancerosas em comparação com as células do tecido circundante e não cancerosas normais no interior da massa do tumor. Estamos estabelecendo atualmente os métodos para realizar tais experimentos.
O mecanismo responsável pela expressão MLCK-regulação para baixo em células cancerosas não é clara. Brand-Arpon et al. [23] relataram a presença de um pseudogene (pMYLK) no local cromossomo 3p21 encontrado apenas em humanos, chimpanzés, gorilas e orangotangos, mas não gibões ou babuínos ou outras espécies. Eles também mostraram que a pMYLK contém uma deleção de 73 pb e utilizado PCR para diferenciar entre a expressão de mylk (667 pb) e pMYLK (594 pb). Usando os mesmos iniciadores, Han et ai. [47] relataram que a expressão de pMYLK é aumentada em células cancerosas e o aumento da expressão de pMYLK é responsável pela diminuição da expressão da MLCK. Foram utilizados os mesmos iniciadores para analisar a expressão de MLCK e pMYLK em tecidos e células humanas. Enquanto nós ver claramente uma diminuição no ARNm MLCK e a expressão da proteína nas células e tecidos de cancro, que não foram capazes de detectar de forma consistente a expressão em células de cancro pMYLK ou a ausência de expressão, em células normais. Consequentemente, a regulação da expressão MLCK em células transformadas ainda não está claro atualmente.
A observação de que as contrações do gel 3D não são bloqueados pela ML-7 e Y27632 também garante comentários. Um aumento na MLC fosforilação é essencial para ativar o actin- activado ATPase de músculo e não-musculares lisas myosins [9-11]. A inibição parcial por blebbistatin sugere que a miosina II pontes cruzadas desempenham um papel nestas contracções. No entanto, a incapacidade de ML-7 e Y27632 para bloquear estas contracções sugere que MLC fosforilação é dispensável. Em contraste, a dinâmica de actina parece desempenhar um papel central nas contracções de gel 3D. Esta observação é consistente com o relatório de que a interrupção dos blocos citoesqueleto de actina todos os tipos de contracções gel de colagénio [48]. Além disso, a característica mais proeminente da imagem de células vivas de células em géis de colagénio (Figura 6) representa a presença de filopios actina altamente dinâmico. Vonna et ai. [49] estudaram a captura patógeno por macrófagos e estimou que filopódios pode gerar centenas de PN da força de mais de 10 mm distâncias. Outro estudo caracterizado filopódios como “tentáculos fagocíticas” que retraem partículas em direção ao corpo celular [50]. Esses autores encontraram o tamanho do passo das contrações foi de 36 + 13 nm, o que exclui a miosina II como a possível motor [50]. Embora eles não foram capazes de implicar qualquer miosina em retração filopoidais, despolimerização dos filamentos de actina com latrunculin A também bloqueou as contrações filopoidais [50]. Tomados em conjunto, a literatura e os nossos dados sugerem que as contrações de gel de colágeno 3D são mediadas por actina via filopódios independentemente da miosina II.
Em resumo, os nossos dados demonstram inequivocamente que a expressão MLCK, MLC fosforilação e contração gel 3D são mais baixos em células cancerosas e tecidos do que nos seus equivalentes normais. Além disso, descobrimos que a diminuição MLC fosforilação, por inibição da MLCK ou Rho cinase, não tem efeito sobre as contracções de gel 3D por células normais ou transformadas. Em contraste, a inibição da miosina II teve um efeito parcial e despolimerização da actina virtualmente abolida a contracção. Além disso, a imagem de células vivas sugeriu que filopios desempenham um papel central nas contracções 3D. Estes dados sugerem fortemente que a rigidez do tumor, a base subjacente de auto-detecção de tumores, é independente da fosforilação da miosina II. As nossas observações são consistentes com estudos recentes que mostraram que as células cancerosas são menos rígidas do que as células não transformadas [40-44]. Por fim, demonstrámos anteriormente que a inibição da MLCK induz apoptose in vitro e potencia os efeitos das drogas anti-cancro para induzir a apoptose e inibem o crescimento do tumor in vivo [17]. Nossa demonstração corrente que a expressão MLCK é diminuída em células tumorais sugere uma janela de segmentação para induzir especificamente apoptose em células cancerosas e provoca uma investigação mais aprofundada da MLCK como um potencial alvo terapêutico.
Informações de Apoio
Figura S1.
Resumo de ensaios de contracção do gel de colagénio. Os géis foram incubados durante 24 horas, a partir de cima e fotografado área superficial calculada conforme descrito nos métodos. O painel A mostra que florins e células da próstata primários contrair os géis mais do que as células HeLa e LNCap. MCF10A células de câncer de mama também contratar os géis mais do que as células cancerosas MCF7 e T47D mais agressivas.