Abstract
JKA97, um análogo de benzilideno de harmine , foi encontrado para ser um candidato a droga promissora para a terapia do cancro humano, embora os mecanismos moleculares subjacentes não foram totalmente demonstrada. Neste estudo, foram avaliados os efeitos de JKA97 em células de cancro da mama humano
in vitro
e
in vivo
. JKA97 inibiu o crescimento e proliferação de células MCF7 (p53 de tipo selvagem), MCF7 (p53 knockdown), e MDA-MB-468 (mutante p53) as células de uma forma dependente da dose. O tratamento com JKA97 preso células de cancro da mama em fase G1 e apoptose induzida. JKA97 também suprimiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de tumores MCF-7 e MDA-MB-468. Ele regulamentou os níveis de reguladores em fase G1, tais como p21, p27, ciclina, e cylinD1 expressão. JKA97 activado transcrição de p21, independente da p53, mas teve pouco efeito sobre a proteína p21 de estabilidade /degradação. Em resumo, os nossos resultados sugerem que JKA97 inibe o crescimento de células de câncer de mama humano através da activação de p21, independente da p53, que fornece uma base para o desenvolvimento deste composto como um novo medicamento para o tratamento do cancro da mama humano
Citation:. Yang X , Wang W, Qin JJ, Wang MH, Sharma H, Buolamwini JK, et al. (2012) JKA97, um romance Benzilideno Analog de Harmine, Exerce Anti-Cancer Efeitos induzindo Detenção G1, apoptose e p53-independente-regulação de p21. PLoS ONE 7 (4): e34303. doi: 10.1371 /journal.pone.0034303
editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 19 Janeiro, 2012; Aceite: 28 de fevereiro de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. R.Z. foi apoiado pelo NIH concede R01 CA112029 e R01 CA121211 e uma bolsa da Susan G. Komen for the Cure (BCTR070731). M.H.W. foi apoiado pelo NIH conceder R01 CA91980. J.K.B. foi apoiado pelo NIH conceder R15 CA100102. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro da mama é um dos cânceres mais comumente diagnosticados e as principais causas de morte por câncer em mulheres no mundo. De acordo com dados estatísticos do GLOBOCAN, cerca de 1,38 milhões de novos pacientes foram diagnosticados com câncer de mama e cerca de 458.400 morreram em todo o mundo com a doença em 2008 [1]. Nas últimas duas décadas, as taxas de mortalidade por câncer de mama caíram devido à detecção precoce, aumento da consciência e melhoradas ou novas terapias. No entanto, certas formas de cancro da mama são particularmente agressivo e apresentar um mau prognóstico. Os pacientes com estágio avançado ou do cancro da mama recidivado frequentemente mostram uma resposta modesta para terapias existentes clinicamente e pode mesmo exibir resistência a agentes quimioterapêuticos convencionais [2] – [4]. A escassez ea ineficácia da terapêutica praticáveis faz o sucesso do tratamento do cancro da mama um desafio e requer a descoberta de medicamentos quimioterápicos alternativos com mecanismos anti-câncer inovadoras.
derivados sintéticos orientados para os produtos naturais têm desempenhado um papel importante na anti- descoberta de drogas câncer [5], [6]. Vários agentes quimioterapêuticos amplamente utilizados, tais como paclitaxel e actinomicina C foram originalmente desenvolvidos a partir de produtos naturais. Harmina, um alcalóide β-carbolina obtida a partir das sementes da planta venenosa
arruda síria,
tem sido utilizado clinicamente para algum tempo como uma droga anti-hipertensiva; actuando por inibição reversível da monoamina oxidase A. Estudos na década passada revelou que harmina também possuía propriedades anti-proliferativas e citotóxicos potentes [7], [8].
JKA97, também referido como metoxi-1-styryl- 9H-pirido [3,4-b] indole (PM:. 286,35; Figura 1A), é um análogo de benzilideno harmina [9], [10]. Um relatório recente mostrou que JKA97 poderia induzir a apoptose de células do cólon e câncer de fígado
in vitro
e
in vivo
por um mecanismo Bax-dependente e independente de p53 [10]. No entanto, as actividades anti-cancro de JKA97 sobre outros tipos de cancro e os mecanismos moleculares precisos do composto não são bem compreendidos. No presente estudo, nós exploramos as actividades anti-tumorais de JKA97 contra células cancerosas da mama com diversas origens genéticas, e tentou elucidar os possíveis mecanismos de ação, fornecendo uma base para o desenvolvimento futuro deste agente como terapia de câncer de mama humano.
(A) estrutura química da JKA97. (B) As concentrações de JKA97 induzindo a inibição de crescimento de 50% (IC
50) em células de cancro da mama, relativamente aos controlos correspondentes, com base no ensaio com MTT. MCF7, MDA-MB-468, MCF7 e p53KD células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 72 horas. efeitos (C) anti-proliferativas de JKA97 em células de cancro da mama. As células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 48 horas, seguindo-se o ensaio de incorporação de BrdUrd. O índice de proliferação foi calculada por comparação com células de controlo não tratadas (* P 0,05). (D) indução de apoptose em células de cancro da mama por JKA97. As células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 24 horas, seguido de medição de apoptose pelo ensaio de Anexina V. O índice apoptótico foi calculada por comparação com células de controlo não tratadas (* P 0,05). (E) Efeitos da JKA97 sobre a distribuição do ciclo celular das células cancerosas da mama. As células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 24 horas, seguido por medição do conteúdo de DNA por citometria de fluxo. A distribuição do ciclo celular foi avaliado por comparação com a das células de controlo (* P 0,05). Todos os ensaios foram realizados em triplicado. Os resultados foram de pelo menos três, repetidas experiências separadas.
resultados
JKA97 diminui o crescimento de células do cancro da mama
in vitro
JKA97 foi avaliada por seus efeitos sobre a viabilidade das células do cancro da mama
in vitro
por utilização do ensaio MTT. Três linhas de células de cancro da mama humano que representam três fundos genéticos diferentes (MCF7 /p53 de tipo selvagem; knockdown MCF7 /p53, e MDA-MB-468 /p53 mutantes) foram expostas a várias concentrações do composto de ensaio (0, 1, 2,5, foram determinados 5, 10, 25, e 50 uM) durante 72 horas, e as percentagens de sobrevivência celular. Como pode ser visto na Fig. 1B, o composto demonstrou IC
50 valores inferiores a 20 uM (6,6-19,0 pM). As células MDA-MB-468 e MCF7 p53KD apareceu a ser mais sensíveis ao composto de células MCF-7.
JKA97 inibe a proliferação de células do cancro da mama
in vitro
Semelhante a os efeitos sobre a sobrevivência celular, JKA97 inibiu a proliferação celular de um modo dependente da dose (Fig. 1C). efeitos anti-proliferativos significativos foram observados em todos os três tipos de células com diferentes origens p53. A uma concentração de 20 uM, JKA97 inibiu a proliferação em cerca de 35%, 35%, e 45%, em MCF7, células MDA-MB-468, MCF7 e p53KD, respectivamente.
JKA97 induz apoptose de mama células cancerosas
in vitro
Além de inibir a proliferação, JKA97 também induziu apoptose em células de cancro da mama. Como ilustrado na Fig. 1D, todas as três linhas de células de cancro da mama analisados apresentaram um aumento significativo (P 0,05) em apoptose após a exposição a uma concentração de 20 uM do composto. No células MCF7 p53KD MCF7, MDA-MB-468, e, a cerca de 20 uM JKA97 aumentou o índice apoptótico 3,9-vezes, 5 vezes e 4,2 vezes, respectivamente, em comparação com a que nas células de controlo.
JKA97 provoca prisão fase G1 em células de cancro da mama
in vitro
também observamos que JKA97 inibiu a progressão do ciclo celular, levando a prender na fase G1 do ciclo celular em uma dose modo dependente em todas as três linhas de células (Fig. 1E). Em ambas as células MCF7 e MCF7 p53KD, mesmo na concentração de 5 | iM, JKA97 levou a uma redução significativa (P 0,05) aumento do número de células na fase G1. Na concentração de 20 mM, a maioria das células foram presos na fase G1 (P 0,05).
JKA97 diminui o crescimento de tumores xenoenxerto
in vivo
Para determinar se o composto também pode exercer efeitos anti-cancro
in vivo
, JKA97 foi administrado a ratinhos nus portadores ou MCF7 MDA-MB-468 tumores de xenoenxerto. No modelo de xenoenxerto de células MCF7, a dose elevada de JKA97 (25 mg /kg) inibiu o crescimento do tumor em cerca de 60% (P 0,05) no dia 18, com a dose baixa (5 mg /kg), conduzindo também a inibição do crescimento tumoral significativa (50%, p 0,05; Fig 2A1.). O
in vivo
atividade anticancerígena de JKA97 foi investigado no modelo de xenoenxerto MDA-MB-468. Este modelo parecia ser um pouco menos sensível ao fármaco, com a dose baixa (5 mg /kg) e dose elevada (10 mg /kg), o crescimento do tumor diminuir em cerca de 45% e 52%, respectivamente (P 0,05; Fig. 2B1). Além disso, não houve diferenças significativas nos pesos corporais entre os controlos e os animais tratados com JKA97, ou quaisquer anormalidades de órgãos no momento da necropsia bruta em qualquer dos grupos (Fig. 2A2 e B2).
JKA97 foi administrada por injecção i.p. injecção de ratinhos nus portadores de MCF7 (A1) ou tumores de xenoenxerto MDA-MB-468 (B1). Para ratinhos portadores do tumor de xenoenxerto de células MCF7, os grupos de tratamento receberam JKA97 em doses de 5 mg /kg /dia ou 25 mg /kg /dia, 5 dias /semana, durante 6 semanas; para ratinhos portadores do tumor de xenoenxerto MDA-MB-468, os grupos de tratamento receberam doses de 5 mg /kg /dia ou 10 mg /kg /dia, 5 dias /semana, durante 18 dias. grupos de controlo receberam apenas veículo. Os animais também foram monitorados para alterações no peso corporal como um marcador substituto para toxicidade quando foi administrado a ratinhos nus portadores de (A2) MCF7 ou (B2) tumores de xenoenxerto MDA-MB-468. No final dos experimentos, os tumores xenoenxerto foram removidos e levados uma fotografia (A3 e B3).
JKA97 up-regula a expressão da p21 em um independente de p53 maneira
A seguir, investigaram o mecanismo (s) de acção de JKA97 examinando os seus efeitos sobre os níveis de várias proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular de expressão. Todas as três linhas de células foram tratadas com várias concentrações de JKA97 durante 24 horas, as células tratadas mostraram um aumento da expressão de p21 de um modo dependente da dose. Além disso, CyclinD1, ciclina, e E2F1 diminuíram, enquanto que P27 foi aumentado, muito provavelmente devido à activação de p21 (Fig. 3A). Nós ainda tratados todas as três linhas celulares com 10 uM JKA97 durante tempos que variam, como se mostra na fig. 3B. Os níveis de proteína p21 foram aumentadas de um modo dependente do tempo em todas as células testadas, independentemente do estado de p53.
(A), MCF7, MDA-MB-468, MCF7 e p53KD células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 24 horas, e a expressão das proteínas p53 e p21 foi determinada por análise de Western blot. (B) As células foram expostas a 10? M de JKA97 durante o tempo indicado, e a expressão das proteínas p53 e p21 foi determinada por análise de Western blot. β-actina foi usado como um controle de igual carregamento de amostras.
JKA97 tem poucos efeitos sobre a estabilidade da proteína p21
Os efeitos da JKA97 sobre regulação p21 também foram determinados no ao nível pós-transcricional. Todas as três linhas celulares foram expostas a 10? M de JKA97 ou solvente durante 24 horas seguida por adição do inibidor de síntese de proteínas, ciclo-heximida (CHX, 10 uM). Como mostrado na Fig. 4A, não houve diferença apreciável na estabilidade da proteína p21 entre as células expostas a JKA97 e aqueles expostos apenas ao solvente.
(A1) MCF7, MDA-MB-468, MCF7 e p53KD células foram expostas a várias concentrações de JKA97 ou veículo durante 24 horas, seguido por exposição a ciclo-heximida inibidor de síntese de proteínas (CHX, 10 ug /mL). a expressão da proteína p21 foi detectada por transferência de Western em momentos diferentes após a exposição de CHX. (A2) O gráfico mostra a quantificação dos dados de Western blotting. MCF7 (B1), MDA-MB-468 (B2) e MCF7 p53KD (B3) As células foram expostas a várias concentrações de JKA97 ou veículo durante 24 h, e o ARN total foram extraídos seguido de transcrição inversa, e o nível de ARNm de detecção de p21 pela quantificação de PCR em tempo real e a quantificação de RT-PCR, normalizada pelo nível de ARNm de GAPDH. (C) As células foram transfectadas com o promotor de p21 da luciferase do plasmídeo repórter e um repórter de luciferase de Renilla em conjunto durante 12 horas, seguido de um tratamento de 10 uM JKA97 ou veículo para um período adicional de 24 horas. A actividade repórter foi normalizada para o repórter de luciferase de Renilla correspondente. O ensaio de luciferase foi realizado em triplicado. A significância estatística foi determinada em comparação com o controlo (* P 0,05).
JKA97 p21 induz a transcrição
Para determinar se a p21 sobre-regulação por JKA97 resultou de um aumento do mRNA ao nível da transcrição, todos três linhas celulares foram tratadas com várias concentrações de JKA97 durante 24 horas, e os níveis de expressão de ARNm de p21 foi determinada por PCR em tempo real. Adicional semi-quantificação de RT-PCR foi utilizado para a consistência. Como ilustrado na Fig. 4B, a expressão do ARNm de p21 foi aumentada por JKA97 de uma forma dependente da dose.
Para demonstrar ainda mais como JKA97 afecta a transcrição de p21, uma de comprimento completo repórter promotor p21 humana foi transfectada em todas as três linhas de células, e estas células foram então expostas a JKA97 (10 uM). Como mostrado na Fig. 4C, as actividades da luciferase do repórter p21 foram significativa aumentou 7,1 vezes, 13,4 vezes e 6,6 vezes na MCF7, MDA-MB-468, e MCF7 p53KD células, respectivamente.
Discussão
estudos anteriores indicam que JKA97 apoptose de células do cólon e câncer de fígado induzida por uma via independente de p53 e Bax-dependente [10]. No entanto, outros mecanismos possíveis e o potencial do composto para tratar outros tipos de câncer ainda não foram completamente elucidados. Para o melhor de nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro a investigar tanto
in vitro
e
in vivo
efeitos anti-tumorais do romance analógico harmine benzilideno em células de câncer de mama humano. O estudo destaca vários pontos importantes: 1) JKA97 inibe significativamente o crescimento de células de câncer de mama; 2) JKA97 induz apoptose celular; 3) a inibição da proliferação celular e na progressão do ciclo celular parece ser importante mecanismo pelo qual JKA97 exerce os seus efeitos anti-cancro; 4) JKA97-regula a expressão da p21 ao nível da transcrição, em vez de nível pós-transcricional, independente da p53; e 5) JKA97 diminui o crescimento de tumores de xenoenxerto de cancro da mama humano em ratinhos, de uma forma dependente da dose.
Os nossos resultados indicaram que não havia diferenças significativas na sobrevivência das células após tratamento JKA97, tal como determinado pelo MTT ensaio, com células MDA-MB-468 sendo as mais sensíveis (Fig. 1B). ensaio MTT representa a sobrevivência celular total, o que pode ser afectada por vários factores, incluindo, pelo menos, a proliferação celular, apoptose, e a progressão do ciclo celular. Portanto, determinou-se ainda mais os efeitos de JKA97 sobre a proliferação celular, apoptose, e a distribuição do ciclo celular. Usamos ensaio de incorporação de BrdU para determinar o índice de proliferação celular. Embora houvesse efeitos dependentes da dose sobre a proliferação de células em cada uma das linhas celulares testadas utilizados neste estudo, não houve diferenças notáveis entre MCF7 (p53 WT) e MDA-MB-468 (mutante p53) as células, indicando que as JKA97 efeitos sobre a proliferação celular é independente de p53. Curiosamente, p53 KD células MCF-7 foram mais sensíveis que outras duas linhas celulares (Fig. 1C). No entanto, MDA-MB-468 células foram mostrados para ser mais sensível em apoptose (Fig. 1D) e ensaio de distribuição de ciclo celular (Fig. 1E). Por exemplo, à dose mais elevada utilizada (20 uM), MCF7 e MCF7 células KD p53 aumento da apoptose de modo semelhante, mas as células MDA-MB-468 foram mais sensíveis. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a indução da apoptose e paragem do ciclo celular têm maior probabilidade de estar relacionada com as diferenças no ensaio de sobrevivência de células entre as três linhas de células. Os mecanismos detalhados precisam ser exploradas nos estudos futuros.
No presente estudo, nós também demonstraram que JKA97 tinha
na actividade anti-tumoral significativa vivo
em dois modelos de xenotransplante do cancro da mama. No nível de dose /kg 5 mg, observou-se as respostas semelhantes para a terapia de entre os dois modelos. Uma vez que utilizaram doses mais elevadas diferentes em células MCF7 e MDA-MB-468 modelos, é difícil comparar as curvas de resposta. A dose utilizada em MDA-MB-468 modelo (10 mg /kg) foi menos de metade da dose no modelo de MCF7 (25 mg /kg), mas gerado taxas de inibição do crescimento tumoral semelhantes. Especula-se que as células MDA-MB-468 são mais sensíveis. Considerando que existem outros fatores que afetam o
in vivo
resposta ao tratamento JKA97, não podemos tirar conclusão firme sobre a diferença entre os dois modelos. Mais estudos são necessários para demonstrar essas diferenças e os mecanismos subjacentes.
A obstrução da progressão do ciclo celular em células cancerosas é considerado como uma das estratégias mais eficazes para o controle do crescimento do tumor [11]. A passagem de uma fase dormente de repouso (G0) a um estado em crescimento activo é um pré-requisito para a entrada no ciclo celular na maioria das células e um passo crucial para as células cancerosas. a progressão do ciclo celular é modulada pelas autoridades reguladoras conhecidas como quinases dependentes de ciclina (CDK) inibidores. A primeira destas proteínas a ser identificado e clonado de p21 é [12] – [14]. A proteína p21, um inibidor do ciclo celular universal, liga-se a complexos de ciclina-CDK e antígeno nuclear de proliferação celular, induzindo, assim, prisão celular em G1 e bloqueando a entrada nas células para a fase S. Tendo isso em mente, fizemos as relações entre a paragem em G1 e ciclo celular proteínas reguladoras afins, incluindo p53, p21 e p27, após o tratamento de drogas. Nossos resultados revelaram que a prisão G1 JKA97 mediada em células de câncer de mama foi ligado com p21, independentemente do status de p53 (tipo selvagem, mutante, ou knockdown). A sobre-regulação de proteínas p21 e p27 aumenta a formação de complexos com os G1-S CDKs e ciclinas, inibindo assim a sua actividade [15] – [17]. Esta acredita-se ser o primeiro relatório de demonstrar o mecanismo de paragem do ciclo celular G1 independente de p53 induzida por JKA97 em células de cancro da mama. O nosso estudo mostrou ainda que a sobre-regulação de p21 induzida por JKA97 foi principalmente dependente de um mecanismo de transcrição em vez de uma alteração pós-translacional. Estudos futuros devem examinar os mecanismos subjacentes a respeito de como JKA97 up-regula a transcrição p21 e influencia as vias a jusante.
Muitos pesquisadores têm sugerido que a paragem do ciclo celular e apoptose pode estar ligada. Moléculas que atuam sobre as células em fase G1 são normalmente pensado para afetar a apoptose; inibidores de CDK foram sugeridos para ser indirectamente envolvidos na apoptose através da regulação das CDK. p21, um inibidor de CDK importante, é induzida por ambos os mecanismos dependentes de p53 e independentes de-seguindo o stress [18]. Além disso, é relatado que a sobre-expressão de p21 resulta numa indução de Bax e promove a apoptose [19]. Considerando-se que
Luo et al.
[10] demonstraram que JKA97 pode induzir apoptose em células de cancro do cólon de uma forma dependente da Bax-p53 mas independente, é necessário mais trabalho para correlacionar a relação entre a paragem do ciclo celular e vias de apoptose regulados pelo composto.
as observações do presente estudo proporciona evidência racional para o uso de JKA97 como um agente anti-tumoral para a terapia do cancro da mama humano. Nossos resultados, tomados em conjunto com os resultados anteriores para este composto, indicam que a atividade anti-câncer do JKA97 está intimamente ligado com a modulação da p21. Novos estudos envolvendo p21 sistemas deficientes seria necessário para avaliar plenamente a extensão do envolvimento desta importante proteína. O presente estudo, em conjunto com os achados anteriores [10], com certeza vai melhorar a nossa compreensão dos mecanismos de ação dos JKA97, fornecendo uma base para posterior avaliação pré-clínica e clínica do composto como um agente anti-câncer romance.
Materiais e Métodos
composto de teste, produtos químicos e reagentes
O composto de teste JKA97, metoxi-1-estiril-9H-pirido [3,4-b] indole, foi sintetizado e purificado como relatado anteriormente [10], e a estrutura foi confirmada por UV, IV, MS e espectroscopia de RMN [10]. A pureza do composto de teste foi determinada como sendo superior a 95% por HPLC e MS análises. Todos os produtos químicos e solventes utilizados foram de grau analítico ou de grau mais elevado disponível. fontes de cultura de células, tais como meios de cultura, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), soro bovino fetal (SBF), piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais, e penicilina-estreptomicina foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA). Os anticorpos contra p21 humana (C-19), p27 (C-19), ciclina D1 (DCS-6), ciclina E (HE12), e E2F1 (KH95) eram de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) . O anticorpo anti-humano p53 (Ab-6) foi de EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ). O anticorpo β-actina anti-humano (T5168) foi da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
linhas de cultura de células e
e MCF7 do cancro da mama humano MDA-MB-468 as células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). MCF7 e de células MDA-MB-468 foram crescidas em meio MEM contendo mM aminoácidos 1 não essenciais e BSS de Earle, piruvato de sódio 1 mM e 10 mg /l de insulina bovina, e meios de DMEM /F-12 de Ham (DMEM /F- 12 01:01 mistura). células MCF7 p53KD foram gerados usando o método descrito anteriormente [20], [21] e foram cultivadas no mesmo meio como células MCF7, mas suplementado com 0,5 ug /ml de puromicina (Sigma; St. Louis, MO). Todos os meios de cultura celular continha 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina, a menos que especificado de outra forma.
celular Ensaio de sobrevivência
Os efeitos de JKA97 no crescimento das células do cancro da mama humano foram determinadas usando o MTT ensaio e expressa como a percentagem de sobrevivência celular de controlo [22] – [25]. As células foram cultivadas em placas de 96 poços, a sementeira, a uma densidade de 4-5 x 10
3 células por poço, e expostos a várias concentrações do composto de teste (0 a 50 iM) durante 72 horas. 10 ul da 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) brometo (MTT) solução de tetrazólio -2,5-difenil (5 mg /ml; Sigma; St. Louis, MO) foram então adicionados. A absorvância a 570 nm foi registada usando um leitor de microplacas SINERGIA Mx (BioTek, Winooski, VT). As taxas de sobrevivência celular (%) foram calculadas dividindo a OD média de poços contendo composto por que de poços de controlo.
Ensaio de Proliferação Celular
Os efeitos de JKA97 sobre a proliferação celular foram determinados por o ensaio de incorporação de BrdUrd (Oncogene, La Jolla, CA), seguindo o protocolo do fabricante. As células foram semeadas em placas de 96 poços (10 × 8
3-1,2 x 10
4 células por poço) e incubadas com várias concentrações de JKA97 (0, 5, 10 e 20 iM) durante 48 horas. BrdUrd foi adicionado ao meio 10 horas antes da terminação da experiência. O BrdUrd incorporado nas células foi determinada pelo anticorpo anti-BrdUrd, e a absorvância foi medida a dois comprimentos de onda de 450/540 nm com um leitor de microplacas SINERGIA Mx (BioTek, Winooski, VT).
A detecção de apoptose
As células em etapas precoces e tardios de apoptose foram detectados utilizando um kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC de BioVision (mountain View, CA). Em breve, 4-5 × 10
5 células por poço foram expostas ao composto de teste (0, 5, 10 e 20? M) e incubou-se durante 24 horas antes da análise. As células foram recolhidas e lavadas com meio isento de soro, em seguida, re-suspensas em 500 uL de tampão de ligação de anexina V, seguido por adição de 5 uL de anexina V-FITC e 5 mL de iodeto de propídio (PI). As amostras foram incubadas no escuro durante 5 min à temperatura ambiente e analisadas com um citómetro de fluxo FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA).
Medições com o ciclo celular
Para determinar os efeitos de JKA97 sobre a distribuição do ciclo celular, 4-5 × 10
5 células por poço foram expostas ao composto (0, 5, 10, e 20 im) e incubadas durante 24 horas antes da análise. As células foram colhidas e fixadas em etanol a 75% a 4 ° C durante a noite, seguido de incubação com ARNase e coloração com iodeto de propídio (Sigma). O conteúdo de DNA foi determinada por citometria de fluxo, como indicado acima.
Mouse Xenoenxerto Modelo de câncer humano de mama
O protocolo de uso de animais e cuidados foi aprovado pelo uso e cuidados Comitê Institucional Animal do Texas tech University Ciências da Saúde Center (IACUC # 10032, PHS Assurance # A 3056-01, USDA Registro nº 74-R-0050, REF # 039461). ratinhos nus atímicos isentos de agentes patogénicos fêmeas (nu /nu, 4-6 semanas) foram adquiridos a Charies River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA). Para estabelecer o modelo de tumor de xenoenxerto de cancro da mama humano MCF7, cada um dos ratinhos nus do sexo feminino foi implantada em primeiro lugar com uma via subcutânea pelete 60-dias de libertação lenta de estrogénio (SE-121, 1,7 mg 17β-estradiol /pelete) obtido a partir de Innovative Research of America (Sarasota , FL). No dia seguinte, as células MCF-7 de células colhidas a partir de culturas de monocamada foram lavadas duas vezes com meio isento de soro, re-suspensos no meio, e, em seguida injectados s.c. (5 × 10
6 células, o volume total de 0,2 mL) para a área inguinal esquerda dos ratos. Para o modelo de xenoenxerto MDA-MB-468, foi utilizado o mesmo procedimento que acima, mas sem o sedimento estrogénio. Todos os animais foram monitorizados quanto a actividade, a condição física, peso corporal, e o crescimento do tumor. O tamanho do tumor foi determinada todos os outros dias por medição da pinça de dois diâmetros perpendiculares do implante. massa tumoral (em g) foi calculado pela fórmula, 1/2
um
×
b
2, onde “
a
” é o diâmetro de comprimento e ”
b
“é o diâmetro de curta duração (em cm).
In vivo
quimioterapia com JKA97
os animais com tumores de xenotransplante de cancro humano foram divididos aleatoriamente em vários grupos de tratamento e um grupo controle (7-10 ratos /grupo). Os grupos de controlo para ambos os modelos receberam apenas o veículo. Para o modelo de xenoenxerto de células MCF7, JKA97 foi dissolvido no veículo, PEG400: etanol: solução salina (57.1:14.3:28.6, v /v /v), e foi administrada por injecção i.p. injecção em doses de 5 e 25 mg /kg /d, 5 dias /semana, durante cerca de 3 semanas. Para o modelo de xenoenxerto MDA-MB-468, JKA97 foi administrada por injecção i.p. injecção em doses de 5 e 10 mg /kg /d, 5 dias /semana, durante 6 semanas. No final das experiências, os tumores de xenoenxertos foram removidos, pesados, e fotografados para registos.
Análise Western Blot
Os níveis de proteína em lisados celulares foram avaliadas utilizando transferência de Western como descrito anteriormente [20 ], [21]. Em resumo, as células foram expostas a várias concentrações de JKA97 durante 24 horas e os lisados celulares foram fraccionados com quantidades idênticas de proteína por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de Bio-Rad trans-transferência para nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que foram em seguida incubadas em tampão de bloqueamento (solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 e 5% de leite desnatado) durante 1 h a temperatura do quarto. Em seguida, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários apropriados durante a noite a 4 ° C ou 2 horas a temperatura ambiente, com agitação suave. As membranas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (solução salina contendo 0,1% de Tween 20 com Tris) durante 15 min e depois incubadas com o /-rabbit anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho-peroxidase de rábano conjugada (Bio-Rad) durante 1 h a temperatura do quarto. Após lavagem, três vezes, as proteínas de interesse foram detectadas por utilização de reagentes de quimioluminescência aumentada da PerkinElmer LAS, Inc. (Boston, MA).
extracção de ARN, e semi-quantitativa e em tempo real quantitativa de RT-PCR
o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol de Invitrogen (Carlsbad, CA). Da primeira cadeia de ADNc foi sintetizado com 1 mg de extracto de RNA total usando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação de genes foram os seguintes: p21 para a frente, 5′-AGC AGC GGA ACA AGG AGT-3 ‘, reverso, 5′-TGG AGA AAC AAC CAG GGG-3′; GAPDH para a frente, 5’-GGA GTC TGG CAC CGT CTT CAC-3 ‘, reverso, 5′-GAG GCA TTG CTG TTG ATG ATC AGG-3’. Semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada com a mistura do produto de ADNc, os iniciadores, dNTP e ADN-polimerase Taq (Invitrogen), utilizando ciclos de 95 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s, seguido por uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. PCR em tempo real foi realizada durante 40 ciclos consistindo de 95 ° C durante 20 s, 57 ° C durante 20 s e 72 ° C durante 20 s utilizando uma máquina IQ5 (Bio-Rad, EUA). Todas as amostras foram analisadas pelo ciclo comparativo limiar (
T C) método e normalizada para o controle de ARNm de GAPDH.
Luciferase Assay
As células foram co-transfectadas com vectores de promotor p21 humana de comprimento completo com
Renilla
repórter de luciferase (como controlo interno; Promega, Madison, WI) durante 24 horas, seguido por incubação com JKA97 durante 24 horas. A actividade de luciferase repórter do promotor de p21 foi determinada com o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. A atividade de repórter p21 foi normalizada para o correspondente
Renilla
atividade repórter luciferase.
Análise Estatística
Os dados de diferentes grupos de tratamento são apresentados como médias ± erros padrão. One-way ANOVA seguido por teste post-hoc de S-N-K foi utilizado para determinar a significância das diferenças entre grupos de tratamento e controlos. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando P . 0,05
Reconhecimentos
Agradecemos Drs. X. Zhang, H. Xu, X. Zhang, L. Ao, E. Rayburn, e D. Chen para excelente assistência técnica e discussão útil, e o Sr. S. Voruganti e Ms. S. Nag para a leitura do manuscrito.