Abstract
Fundo
epigenética e alteração genética desempenha um papel importante ao desenvolvimento de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP). O consumo de tabaco (de fumar /mascar) e vírus do papiloma humano (HPV) também estão associados com um aumento do risco de carcinoma epidermóide. Promotor hipermetilação dos genes de supressão tumoral está relacionada com inactivação da transcrição e da perda da expressão do gene. Nós investigamos alteração epigenética (metilação do promotor de genes relacionados ao tumor /loci) em tecidos tumorais no contexto da alteração genética, infecção viral, e exposição ao tabaco e status de sobrevivência.
Metodologia
O estudo incluiu 116 amostras de tecido (71 tumor e 45 tecidos normais) da população indiana Nordeste. Metilação polimerase específica reação em cadeia (MSP) foi utilizado para determinar o estado de metilação de 10 genes relacionados ao tumor /loci (
p16
,
DAPK
,
RASSF1
,
BRAC1
,
GSTP1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
). Polimorfismos de
CYP1A1
,
GST
(
M1 Restaurant
T1
),
XRCC1
e
XRCC2
genes foram estudados por meio de polimerase em cadeia reação restrição polimorfismo de fragmento (PCR-RFLP) e multiplex-PCR, respectivamente.
principais conclusões
a análise de agrupamento hierárquico não supervisionado com base no padrão de metilação tinha identificado dois clusters de tumor, que diferem significativamente em CpG ilha methylator fenótipo (CIMP), tabaco,
GSTM1
,
CYP1A1
, HPV e status de sobrevivência. Analisando metilação dos genes /loci individualmente, encontramos maior metilação significativo de
DAPK
,
RASSF1
,
p16 Comprar e
MINT31
genes (
P =
0,031, 0,013, 0,031 e 0,015, respectivamente) em HPV (+) em comparação com os casos de HPV (-). Além disso, uma CIMP de alta e Cluster-1 característica também foi associada com a sobrevivência pobre.
Conclusões
perfis de metilação do promotor refletindo uma correlação com o tabaco, HPV, status de sobrevivência e alteração genética e pode agir como um marcador para determinar subtipos e resultado para o paciente em HNSCC
Citation:. Choudhury JH, Ghosh SK (2015) hipermetilação do promotor de perfil Identifica subtipos câncer de cabeça e pescoço com Distinct Viral, ambiental, características genéticas e sobrevivência. PLoS ONE 10 (6): e0129808. doi: 10.1371 /journal.pone.0129808
Editor do Academic: Dajun Deng, Peking University Hospital do Câncer e do Instituto, CHINA
Recebido: 20 Março, 2015; Aceito: 13 de maio de 2015; Publicação: 22 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Choudhury, Ghosh. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Globalmente, câncer de cabeça e pescoço é o quinto câncer mais comum e é responsável por mais de 550.000 novos casos por ano [1]. Consumos de tabaco infecção pelo HPV (tabagismo e mastigação), álcool e são fatores de risco bem conhecidos em direção ao desenvolvimento e progressão do carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) [2, 3]. Na Índia, HNSCC tem profunda fumar, quid betel e tabaco de mascar perfil e comparativamente pobres sobrevida [4-6]. No entanto, HNSCC HPV positivo (+) teve perfil de risco distinta e associada a uma melhor sobrevida em comparação com HPV negativo (-) HNSCC [7]. alteração genética, tais como mutações e polimorfismos genéticos são também desempenham um mecanismo-chave para CECP [8-11]. Além disso, a modificação epigenética (variação da expressão de genes, sem afectar a sequência primária de ADN) pode alterar a expressão de genes fundamentais relacionados com o tumor e, assim, considerado como um jogador crucial para o desenvolvimento de vários cancros [12-14].
hipermetilação de ilhas de CpG na região promotora de genes (aqueles que estão envolvidos na regulação do ciclo celular, apoptose, e reparação de danos do ADN via de desintoxicação) estão associados com a progressão e desenvolvimento do cancro. Assim, a metilação aberrante de ilhas de CpG é uma das modificações epigenética promissores biomarcador molecular potencial enorme para a previsão e a detecção de uma variedade de cancros [15, 16]. CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) tumores associados são um grupo distinto definido por hipermetilação do promotor CpG-rica em genes múltiplos e têm uma epidemiologia distinta e características moleculares [17-20]. O conceito de CIMP foi proposta pela primeira vez em cancro colo-rectal como um marcador molecular [21], mais tarde, também foi estudado em outros tipos de tumores. No entanto, o papel da via CIMP na tumorigênese de HNSCC ainda é desconhecido. A maior confronto em estudar e explorar tumores associados CIMP é definir loci metilado específica que deve ser utilizado como painel CIMP. metilação aberrante de ilhas de CpG normalmente não metiladas está associada com a inactivação da transcrição e, assim, a perda de expressão do gene. Investigações recentes realizados em diferentes genes relacionados ao tumor também mostraram padrão de metilação diferencial no HNSCC [22-26]. Para avaliar e tela de status CIMP de cânceres, Parque et al [27] propôs um painel de genes consistindo
de p16 /CDKN2A
,
MINT1
,
MINT2
,
MINT31
e
MLH1
(referido como o painel CIMP clássica) freqüências .As de hipermetilação em um painel de seis genes (
ECAD
,
p16
,
DAPK
,
MGMT
,
RASSF1
e
TIMP3
) foram encontrados muito elevado no câncer de cabeça e pescoço [28]. Em outro estudo, a metilação aberrante de
MINT1
e
MINT31
foi encontrado para ser associado com mau prognóstico [29]. Estudos anteriores também relataram que
p16
e
DAPK
aberrantes de metilação foi associada com mau prognóstico no câncer oral [30, 31]. Por isso, propusemos um painel CIMP de sete genes, incluindo;
DAPK
(proteína quinase associada à morte),
RASSF1
(Ras domínio associação family-1),
BRCA1
(cancro da mama 1),
MLH1
(mutL homologia 1),
p16
(2A inibidor da quinase dependente da ciclina),
ECAD
(caderina epitelial),
GSTP1
(glutationa S-transferase pi-1 ), e três loci metilado tais como
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
(metilado no tumor 1, 2 e 31, respectivamente). estudos epigenéticos recentes sobre vários tipos de câncer focada principalmente na abordagem multigênica, associações com infecção pelo HPV e dados clinicpathological e com alterações genéticas [32-34]. As oncoproteínas de HPV E6 e E7 são conhecidos por estarem associados com a instabilidade genómica por inactivação de p53 e proteínas supressores do tumor Rb de percurso do ciclo celular [35], para além deste, o HPV também modula a metilação de ADN aberrante do genoma do hospedeiro [36] e causar carcinogénico processos. Nos últimos anos, muitos estudos tinham conduzido para explicar associação de CECP com alternância de genes de reparo da via xenobióticos e de DNA, bem como gene-gene e interação gene-ambiente [37, 38]. Tahara et al. [39] mostraram factores genéticos, relacionados com a reparação do ADN ou xenobióticos vias pode ter um papel na carcinogénese gástrica relacionadas com a hipermetilação CpG ilha. No entanto, não houve tais estudos realizados com foco perfil específico promotor metilação em CECP com uma combinação de fatores de risco genéticos relacionados com a xenobióticos e via de reparo de DNA. Assim, a variação no padrão de hipermetilação do promotor de HNSCC baseado em hábitos, alteração genética e infecção pelo HPV permanece obscuro.
Para entender os mecanismos subjacentes de diferenças nos padrões de hipermetilação específicos do tumor, analisamos o perfil de metilação do promotor aberrante de HNSCC usando sete genes de vias relacionadas com tumores importantes, incluindo
DAPK
,
RASSF1
(via de apoptose),
BRCA1
,
MLH1
(reparo de DNA pathway),
p16
(percurso do ciclo celular),
ECAD
(adesão célula-célula),
GSTP1
(via xenobióticos) e três loci metilado (
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
) na zona de alta incidência de câncer do Nordeste da Índia. Para o melhor de nosso conhecimento, nós somos os primeiros a explorar; a correlação de características CIMP com genéticas (polimorfismos de
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1 Comprar e
genes XRCC2
) e ambientais (tabagismo, quid betel e tabaco de mascar) e também com HPV e sobrevivência status dos pacientes com CECP. Além disso, foi realizada a análise de agrupamento hierárquico para identificar subconjuntos distintos de CECP com base no perfil promotor metilação.
Materiais e Métodos
Recolha de HNSCC tecidos
No presente estudo, examinamos 116 amostras de tecido, incluindo 71 amostras de tumores de CECP e 45 tecidos normais adjacentes, coletados em diferentes hospitais do nordeste da Índia a partir de 2009-2013. Os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito antes da coleta das amostras. dados demográficos básicos, como idade, sexo, tabagismo (fumar /mascar) consumo, hábitos alimentares etc. foram coletadas através de um questionário padrão.
Declaração de Ética
Collection, formulário de consentimento e análise de amostras de tecido foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional (IEC), Universidade de Assam, Silchar, Assam, na Índia.
DNA extração
O DNA genômico foi extraído de amostras de biópsia, tecidos de câncer cirurgicamente excisadas e tecidos normais adjacentes utilizando um protocolo de extracção com fenol /clorofórmio e também por Bioline isolar ADN genómico minikit (Bioline, UK) seguindo as instruções do fabricante. O DNA extraído foi, em seguida, dissolvido em TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM), solução tampão e armazenado a -80 ° C para análise posterior [40].
detecção do HPV
as amostras de tecido foram rastreadas utilizando conjunto de iniciadores de consenso MY9 /MY11 para amplificar fragmentos de gene L1 de HPV, que pode detectar estirpes de alto risco de HPV [32]. A amplificação foi realizada em 20 misturas ul de reacção contendo 2X Biomix (Bioline, Reino Unido), para a frente e inverter primers, amostra 2 mL de água e livre de nuclease. A mistura de reacção de PCR foi submetido a desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 45s, 47 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 1 min. O prolongamento final foi realizado a 72 ° C durante 10 min. Todas as precauções possíveis, incluindo controlos negativos foram tomadas para minimizar a contaminação cruzada. Os produtos de PCR foram observadas em gel de agarose a 2% com brometo de etídio.
polimorfismos genéticos da substância cancerígena metabolizar (
GSTM1
,
GSTT1
e
CYP1A1
) e reparação de DNA (
XRCC1
e
XRCC2
) genes
Os polimorfismos de
CYP1A1
(T3801C),
XRCC1
( Arg399Gln) e
XRCC2
(Arg188His) genes foram analisados por polimorfismo em cadeia da polimerase comprimento de fragmentos de reacção de restrição (PCR-RFLP) método. O sítio polimórfico de
CYP1A1
,
XRCC1
e
XRCC2
foi amplificada utilizando publicados direta e inversa primers [37, 41] em 20 reacções de PCR ul. Cada mistura de RCP contém 10-100 ng de DNA genômico, 20 pmol de cada iniciador, tampão de reacção 10X, mistura dNTP,
Pfu
DNA polimerase, MgCl
2 e água livre de nuclease (NFW). A mistura de reacção de PCR foi ajustado com uma desnaturação inicial a 94
° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94
° C para desnaturação durante 45 s, 62
° C /58
° C /60
° C (para
CYP1A1
,
XRCC1
e
XRCC2
respectivamente) para 45s para emparelhamento do iniciador e extensão a 72
° C durante 1 min. O prolongamento final foi realizado a 72
° C durante 10 min. Os produtos de PCR de
CYP1A1
,
XRCC1
e
XRCC2
foram digeridos separadamente com a enzima de restrição
msp1
,
HpaII
e
HphI
enzimas (New England BioLabs, EUA), respectivamente. Os produtos digeridos foram então resolvidos em gel de agarose a 3% para avaliar o tamanho dos produtos de PCR-RFLP [37]. A genotipagem do
GSTM1
e
GSTT1
foi feita por PCR multiplex, utilizando
CYP1A1
gene como um controlo interno, em um volume total de 10 ul mistura de reação de 2X Biomix (Bioline, Reino Unido) e 10 pmol de cada um dos para a frente (F) e os iniciadores para trás (R) (S2 tabela). Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio.
análise Promotor de hipermetilação e avaliação de CIMP-status
status de metilação do promotor de genes relacionados ao tumor (
RASSF1
,
DAPK
,
ECAD
,
BRCA1
,
MLH1
,
p16
e
GSTP1
) e três loci metilado (
MINT1
,
MINT2
, e
MINT31
) foram analisados utilizando primers específicos de metilação PCR (MSP) (S2 tabela). Para o ensaio de MSP, as amostras de ADN foram sujeitas a modificações, utilizando o kit de ADN Imprint1 modificação (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguindo as instruções tal como descrito pelo fabricante do [18]. Neste procedimento, a desnaturação do ADN e a modificação com bissulfito são realizadas simultaneamente. Bissulfito reage com o ADN de cadeia simples para desaminar a citosina (C) e transforma a citosina não metilada (C) para o uracilo (U) e citosina folhas 5-metil inalterada e, portanto, cria sequências diferentes de ADN metilado e não metilado. Em seguida, foram utilizados dois conjuntos diferentes de iniciadores para cada gene, um conjunto específico de iniciadores para o ADN metilado e o outro para o ADN unmetyhlated. Nós também utilizado o ADN a partir de linfócitos de sangue periférico de indivíduos saudáveis, sem infecção pelo HPV, como controlo negativo, e o ADN a partir de linfócitos de sangue periférico tratadas com SSSI methyltranferase foi utilizado como controlo positivo (para ADN metilado). Toda a reacção de PCR foi realizada no termociclador de gradiente (Applied Biosystems, Inc, CA, EUA) e os produtos amplificados de ADN metilado e não metilado foram corridos lado a lado em gel de agarose para comparação. Neste estudo, o painel CIMP foi classificada em três grupos: CIMP-alta (pelo menos 5 genes /loci metilados de 10), CIMP-baixa (menos 5/10 genes /loci metilado), e CIMP-negativas (0/10 genes /loci metilado). Esta classificação foi feita com base nos critérios anteriormente utilizados para o estado CIMP em outros tipos de tumores [19, 42]. índice de metilação (MI) também foi calculado para cada caso através da divisão do número de genes metilados /loci pelo número total de genes /loci em estudo.
Survival análise
A sobrevida foi calculado em meses desde o início do tratamento para o mês de deathusing curvas de sobrevida de Kaplan-Meier no software SPSS, versão 18 (Windows). Mortes por doenças /complicação que não o câncer foram expulsos do estudo. A associação entre diferentes características (HPV, CIMP e fragmentação) e caso de morte foram analisados utilizando testes de Log-Rank (Mantel-Cox).
A análise estatística
A análise estatística foi realizada usando SPSS software versão 18 e dois lados
P
-valor 0,05 (bicaudal) foi considerado estatisticamente significativo. Foi utilizado o teste de soma de postos de Wilcoxon para comparar os níveis de metilação do promotor de amostras de tumores CECP e amostras normais, que permitem a comparação de dois grupos de amostras independentes [43]. Os valores significativos foram ainda ajustados para testes múltiplos pelo método de Bonferroni (
P
-VALOR multiplicada pelo número de comparações). Além disso, para reforçar a associação entre diferentes fatores e CIMP no risco de CECP,
P
-Valores foram calculados após o ajuste fatores de confusão, tais como idade, sexo, HPV, tabagismo, betel-quid e tabaco de mascar de status conforme o caso. Teste de tendência linear também foi realizado para o estado CIMP ordinal múltipla. agrupamento hierárquico não supervisionado foi feito usando JMP 12 pacote de SAS, que identificam subgrupos entre pacientes com CECP com base na frequência de metilação do promotor software.
Resultados
Características dos pacientes
Os dados clínico-patológico dos 71 estudados HNSCC pacientes estão resumidos na Tabela 1, composto 20 (28,2%) do sexo feminino com idade entre 23-86 anos (77,5% pertencem ao grupo etário 45-86) 51 (71,8%) do sexo masculino e. Dos 71 pacientes com CECP; 38 (53,5%) de câncer oral (incluindo face, base da língua, da língua, gingivam e mucosa bucal) 16 (22,6%) tiveram câncer de laringe, 8 (11,2%) tinha câncer de faringe e 9 (12,7%) tiveram outro câncer tipos na região da cabeça e pescoço. De acordo com a classificação TMN, a maioria dos doentes tinha estado avançado (III /IV) (67,3%) no momento do diagnóstico. Entre os pacientes com CECP, fumantes, chewers betel quid e mastigadores de tabaco eram 71,8%, 66,2% e 74,6%, respectivamente.
Frequências de hipermetilação do promotor em amostras de tumores de pacientes com CECP e tecidos normais
status de Promotor de hipermetilação do
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
RASSF1
,
BRCA1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
genes de 71 CECP e 45 amostras de tecidos normais foi mostrado na Tabela 2 . Os tecidos tumorais tinha genes muito mais elevados /loci frequência hipermetilação em comparação com amostras de tecidos normais (32,4% vs. 13,3% para
p16
, 29,6% vs. 11,1% para
DAPK
, 18,3% vs . 8,9% para
BARC1
, 31% vs. 15,6% para
GSTP1
, 32,4% vs. 8,9% para
ECAD
, 50,7% vs. 22,2% para
RASSF1
, 5,6% vs. 2,2% para
MLH1
, 43,7% vs. 13,3% para
MINT1
, 52,1% vs. 11,1% para
MINT2
e 46,5% vs. 17,8% para
MINT31
). No entanto, observou-se significativamente elevado nível de hipermetilação em
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
(
P
= 0,02, 0,02, 0,04, 0,02, 0,01, 0,01, e 0,01, respectivamente) em comparação com tecidos CECP amostras de tecidos normais . O índice de metilação (IM) (razão entre o número de promotores metilados, o número total de promotores em estudo) variou 0-0,9 dos 71 pacientes. Dos 71 pacientes com CECP 14 (19,7%) teve 0 MI (zero), 33 (46,5%) tiveram MI de 0,1-0,5 e 24 (33,8%) pacientes tiveram MI de 0,6-0,9. pacientes com CECP com diferentes hábitos e perfis genéticos foram encontrados para exibir índice de metilação diferencial (MI). A média de MI de chewers tabaco /fumantes foi maior do que mastigadores não /fumadores. Da mesma forma, pacientes com
GSTM1
null,
CYP1A1
CC genótipo e HPV (+) também mostraram maior índice de metilação (Fig 1).
Cada parcela caixa representa índice de metilação diferencial (MI) entre os fumantes /mastigadores e não fumantes /mastigadores ou genótipo selvagem versus genótipo variante ou HPV (+) vs. HPV (-). pacientes com CECP
estatuto
Promotor de metilação em HPV positivo (+) e HPV negativo (-) HNSCC
no estudo, o HPV foi detectado em 37 dos 71 casos (52,11%), utilizando os iniciadores de consenso. A correlação entre a metilação dos genes relacionados ao tumor e HPV foi resumida na Tabela 3. Os resultados mostraram que a metilação do promotor de
DAPK
,
RASSF1
,
p16
e
MINT31
foram significativamente maiores em (+) pacientes com CECP HPV positivos em comparação com HPV negativo (-) pacientes (
P
= 0,031, 0,013, 0,031 e 0,015) (Fig 2B). A associação altamente significativa foi encontrada entre (+) tumores HPV positivos e CIMP de alta grupo (
P
= 0,028). No entanto, não houve correlação entre HPV HNSCC (+) CIMP-baixa e (
P
= 0,477), quando comparado com o HPV (-). Tumores CECP
(A) de Kaplan-Meier parcelas de sobrevivência: (i) HPV (+) tumores CECP mostrando melhor sobrevida em relação ao HPV (-) tumores. (Ii) CIMP de alta grupo de tumores CECP que mostra a sobrevivência mais pobre em relação ao outro. (Iii) Dois conjunto epigenética também mostrou sobrevivência diferencial com o conjunto-1 teve uma sobrevida. (B) Freqüência de metilação do promotor de 10 genes relacionados ao tumor /loci em HPV (+) e HPV (-) HNSCC [* P 0,05 (Mantel-Cox Log-rank)]. (C) índice de metilação (MI) em três CIMP-grupos de tumores CECP.
CIMP em tecidos tumorais CECP
Neste estudo, a situação CIMP foi classificada como CIMP -high (cinco ou mais genes metilados), CIMP-baixas (menos de cinco genes metilados) e CIMP-negativas (não há genes metilados). Das amostras CECP 71, 39,4% (28/71) foram CIMP de alta, 42,3% (30/71) foram CIMP-baixa e 18,3% (13/71) foram CIMP-negativo.
Correlação entre fatores ambientais e CIMP
Quando analisamos os dados sobre os factores ambientais, como tabagismo, betel de mascar quid e com CIMP e encontrou fumo e tabaco de mascar teve forte correlação com CIMP-alta (
P
= 0,008 e 0,034, respectivamente) em comparação com CIMP-negativo. No entanto, betel de mascar quid não teve correlação significativa com CIMP marcadores. Nós também não tinha encontrado qualquer diferença significativa entre CIMP de baixa Vs CIMP-negativo e CIMP de alta Vs CIMP de baixa em termos de consumo de tabaco ou mastigar (Tabela 4).
Correlação entre fatores genéticos e CIMP
Nós também se correlacionou os dados alteração genética de metabolizar cancerígena (
GSTM1
,
GSTT1
e
CYP1A1
) e reparo do DNA (
XRCC1 Comprar e
XRCC2
) genes com dados em painel CIMP. Os tumores CIMP-altos tinham significativamente maior frequência de
GSTM1
nulo, quando comparado com os tumores CIMP-baixa e CIMP-negativas (
P
= 0,004 e 0,023, respectivamente). No entanto, não houve correlação significativa entre o
GSTT1
(null),
CYP1A1
(T3801C),
XRCC1
(Arg /Gln) e
XRCC2
(ARG /HIS) genótipos variantes e diferentes marcadores CIMP (Tabela 4).
Survival correlaciona-se com CIMP e HPV
Survival foi examinado com relação a marcadores CIMP usando curvas de sobrevida de Kaplan-Meier (Fig 2A). A análise revelou que o tempo médio de sobrevida global de 47 pacientes fora de 71 era de 15 meses [IC95% = 10,97-19,03], eo tempo médio de sobrevivência em CIMP de alta, CIMP-baixa e CIMP-negativos foram de 11 meses [95% IC = 7,71-14,28], 18 meses [95% IC = 13,73 a 22,26] e 19 meses [IC 95% = 5,14 a 32,85], respectivamente (
P
tendência
= 0,011). outra vez médio de sobrevivência para Cluster-1 e Cluster-2 característica eram 13 e 18 meses, respectivamente (
P
= 0,026) (S1 Tabela). O CIMP de alta e Cluster-1 foram significativamente associados com pior sobrevida em pacientes com CECP. Considerando que, o tempo de sobrevida para os pacientes com CECP HPV (+) foi melhor (17 meses) do HPV (-) pacientes com CECP (13 meses) (
P
= 0,041)
aglomerados tumorais identificadas. e correlação com características ambientais, genéticos e epigenéticos
no presente estudo, foi realizada agrupamento hierárquico não supervisionado e identificou duas classes ou sub-grupos com base em dados de metilação do promotor em amostras de tumor (Fig 3). Nós tínhamos construído agrupamentos hierárquicos usando sete genes /loci, como após o ajuste de sete genes /loci de dez encontrado para ser significativamente hipermetilado. Os dois clusters identificados tinham características ambientais, genéticos e epigenéticos distintos e estão resumidos na Tabela 5. A freqüência de tabagismo (86,2%) e fumo de mascar-(89,7%),
GSTM1
nula (82,8%) e
CYP1A1
(31,05%),
XRCC1
(27,6%) e
XRCC2
(48,3%) genótipos variantes foi maior em Cluster-1 em comparação com Cluster-2. No entanto, apenas fumar, mastigar tabaco e
GSTM1
genótipo nulo havia mostrado variação estatisticamente significativa entre os grupos (
P
= 0,048, 0,034 e 0,002, respectivamente). Além disso, a freqüência de HPV tumores positivo (+) CECP foi significativamente maior (
P
= 0,009) em Cluster-1 em comparação com Cluster-2. CIMP de alta grupo (93,1%) é significativamente maior em de Cluster-1 (
P Art 0,001) em comparação com Cluster-2, enquanto que, Cluster-2 caracterizada por CIMP-baixa (66,7%) e CIMP grupos -negative (30,9%)
Os diferentes fatores em heatmap foram representados por variação de cor:. consumidores de tabaco, presença do HPV e
GSTM1
null,
GSTT1
nula (escuro cor vermelha); não-consumidores de tabaco e ausência HPV
GSTM1
presente e
GSTT1
presente (cor amarelo claro). Para
CYP1A1
,
XRCC1
e
XRCC2
status: tipo selvagem (vermelho escuro); heterozigotos (vermelho laranja) e alelo variante homozigoto (laranja claro) e para o status CIMP: CIMP-alta (vermelho escuro), CIMP-baixa (vermelho alaranjado) e CIMP-negativo (cor clara)
Discussão
O desenvolvimento e progressão da CECP é um processo multi-passo modulado por fatores genéticos, epigenéticos e ambientais [2, 44, 45]. Os principais fatores ambientais tais como o fumo do tabaco e mastigar, bem como a infecção pelo HPV pode levar a uma ampla gama de processos genéticos e epigenéticos que promovam a instabilidade genômica e endossar o desenvolvimento do tumor [3, 5, 9]. perfil de hipermetilação do promotor de genes relacionados ao tumor foi antecipado para ser crucial e frequente em diferentes tipos de câncer. Muitos eventos epigenéticos em vias cancerígenas têm sido recentemente estudados e revelou os métodos de detecção de CpG padrão promotor ilha metilação para estratificar grupos de alto risco entre os cânceres diferentes [15, 17, 18, 34]. Isto ajuda na detecção do aparecimento precoce de cancro, e prevê resultados clínicos. Portanto, é indispensável para estudar o estado de metilação de um painel de genes representativas em CECP. Aqui, neste estudo, foram analisados o perfil de metilação do promotor aberrante de HNSCC usando sete genes importantes vias relacionados ao tumor (
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
ECAD
,
RASSF1
,
MLH1
e
BRCA1
) e três loci metilado (
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
) na zona de alta incidência de câncer do Nordeste da Índia. Em nosso estudo, nós também correlacionar estado de metilação aberrante de pacientes com genéticas (polimorfismos de
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1
e
XRCC2
) e fator ambiental (tabagismo, quid betel e tabaco de mascar), bem como com dados de sobrevivência.
Nós encontramos um significativamente alto nível de
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
hipermetilação em tecidos CECP em comparação com amostras de tecidos normais, refletindo o possível envolvimento de alteração epigenética para o desenvolvimento e progressão da CECP. A nossa investigação presente cobria um amplo grupo de genes da via relacionados ao tumor, incluindo
p16
(controle do ciclo celular),
DAPK
,
RASSF1
(apoptose),
BRCA1
,
MLH1
(reparo do DNA),
ECAD
(adesão célula-célula),
GSTP1
(metabolismo carcinogênico),
MINT1
,
MINT2
e
MINT31
(loci metilados em tumores).
Muitos estudos epigenéticos anteriores existência elucidado de DNA-HPV metilação mediada em HNSCC [46, 47] . estudo recente do nordeste da Índia utilizando um painel de 10 genes, explicou o papel do HPV e do tabaco na gênese do câncer VADS [32]. No entanto, foram analisados mais hipermetilação de genes individuais /loci separadamente em HPV (+) e HPV (-) casos. Encontramos metilação do promotor de
DAPK
,
p
16,
RASSF1 Comprar e
MINT31
foi significativamente associada com o HPV (+) tumores do CECP. Portanto, o HPV parece ser um agente causador de alterações da metilação de CpG ilha de genes de tumor-supressor em HNSCC. Em geral, HPV (+) HNSCC está associada a uma sobrevivência mais favorável [9], o nosso estudo também explorou HPV (+) pacientes de HNSCC melhor taxa de sobrevivência em comparação com HPV (-). Pacientes, refletindo um possível papel no prognóstico
em muitos tipos de câncer, especialmente no cancro colorectal, CpG Ilha Methylator Fenótipo (CIMP) foi utilizado para identificar clínica e patológica subconjuntos relevantes de tumores. Toyota et ai. introduzido CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) para classificar o câncer com base no estado de metilação de um painel de genes [21]. No cancro colorectal, tumores CIMP tinha características epidemiológicas distintas, microsatélites instabilidade (MSI) mutações BRAF perfil e sobrevivência, em comparação com tumores não-CIMP [48, 49]. CIMPs foram relatados por uma série de tipos de câncer, incluindo trato aerodigestivo superior (VADS) [32], o cancro oral [50], e carcinoma de células escamosas esofágico [51] e cancro da mama [19]. No entanto, apenas um único estudo foi o carcinoma epidermóide, que explicam CIMP no sub-grupo de HPV (+) de tumor de carcinoma epidermóide [33]. O perfil de hipermetilação dos promotores de genes é diverso para cada tipo de cancros e também do método de detecção e selecção de genes múltiplos para CIMP-painel varia entre os estudos. Com base no padrão hipermetilação de 10 genes relacionados ao tumor /loci, classificamos CECP em três grupos: CIMP de altura, CIMP-baixa e CIMP-negativos. Observamos características distintas de tumor no seio dos grupos CIMP-alto e CIMP-negativos. Frequências de fumar, mastigar tabaco e
GSTM1
genótipos nulos dos pacientes foram significativamente maiores nos grupos CIMP-altos em comparação com CIMP-negativo. características genéticas e ambientais podem dirigir às características CIMP de tumores CECP. Observou-se também uma taxa de sobrevivência pobres inclinação em tumores CIMP-elevado em comparação com grupo CIMP-negativo; indicam CIMP de alta pode ser um preditor de mau prognóstico do CECP em população indígena do Nordeste. Talvez não seja inesperada que encontramos correlações entre o mau resultado CIMP de alta e paciente, se comparamos os nossos dados sobre a CIMP e sobrevida em CECP com outros cancros descritos anteriormente [52, 53]. A compreensão profunda da CIMP pode permitir a concepção de melhores estratégias de tratamento para CECP.
agrupamento epigenética de pacientes com CECP foi feito com base em perfis de metilação de DNA em amostras de tecido do tumor. análise de agrupamento hierárquico identificou dois subconjuntos distintos, um subconjunto de pacientes com CECP com alta freqüência de tabagismo, hábitos de tabaco de mascar,
GSTM1
nula e
CYP1A1
(CC) genótipo variante. O cluster-1 também caracterizada por casos de HPV (+), e continha CIMP de alta grupo, refletindo uma possível correlação entre a metilação do DNA e de fatores genéticos e ambientais na HPV associado HNSCC. Assim, epigenética e juntamente com alteração genética, com uma combinação de factores ambientais podem também desempenhar um papel em um subconjunto de HNSCC. Em nosso estudo anterior, encontramos forte interação entre genes cancerígena metabolizar (
GSTM1
e
GSTT1
) e fatores ambientais em HNSCC [2]. A interação da Fase-I (
CYP1A1
) e Fase-II (
GSTM1 Art
GSTT1
) carcinógenos do tabaco que metabolizam genes podem elucidar a acumulação de maior quantidade de substâncias tóxicas dentro do corpo que pode desempenhar o papel importante durante o desenvolvimento do carcinoma epidermóide. Além disso, um dos nosso outro estudo explorou a interação entre tabaco e reparo do DNA (
XRCC1 Comprar e
XRCC2
) polimorfismos do gene e conversas cruzadas entre esses genes de reparo de DNA de dois em direção a susceptibilidade de HNSCC [37] . estudo recente de Tahara et al. [39] associação encontrada entre
GSTM1
genótipo nulo e aumento da susceptibilidade à CpG hipermetilação, no entanto, encontraram sensibilidade reduzida ao CpG hipermetilação do
DAPK
gene com
XRCC1
códon 399 Gln