Abstract

cromossomos duplos hora (DMS) têm implicações importantes para a progressão do câncer, porque oncogenes frequentemente amplificados sobre eles . Nós previamente detectado um gene funcionalmente indefinido amplificado em DMs Ribossômico L22-Gosto1 (

RPL22L1

). A relação entre o

RPL22L1 Comprar e progressão do câncer é desconhecida. Aqui,

RPL22L1

foi caracterizada por seu papel no câncer de ovário (OC) metástase e seu mecanismo subjacente foi examinada. número de cópias de DNA e expressão de mRNA de

RPL22L1

em células OC foi analisada usando dados obtidos do Cancer Genome Atlas eo banco de dados Omnibus Gene Expression. Uma análise imuno-histoquímica de espécimes clínicos OC foi realizada e as relações entre nível de expressão e fatores clínico-patológicos foram avaliados. Além disso,

in vivo

e

in vitro

ensaios foram realizados para compreender o papel da

RPL22L1

no OC. RPL22L1 expressão foi maior em amostras de CO do que em tecidos normais, e o seu nível de expressão estava altamente correlacionada positivamente com a invasão e metástase de nódulo linfático (

P

0,05).

RPL22L1

sobre-expressão significativamente melhorado o desenvolvimento do tumor xenoenxerto intraperitoneal em ratinhos nus e promoveu a invasão e migração

in vitro

. Além disso,

RPL22L1

knockdown células UACC-1598 significativamente inibida invasão e migração. Além disso,

RPL22L1

sobre-expressão-regulada a marcadores mesenquimais vimentina, fibronectina e α-SMA, redução da expressão de marcadores epiteliais E-caderina, α-catenin e β-catenina.

RPL22L1

expressão inibição reduzida de vimentina e N-caderina. Estes resultados sugerem que

RPL22L1

induz epitelial-mesenquimal-a transição (EMT). Nossos dados mostraram que as DMs gene amplificado

RPL22L1

é fundamental na manutenção do fenótipo agressivo de OC e no desencadeamento de metástase celular através da indução de EMT. Pode ser empregado como um novo marcador de prognóstico e /ou alvo terapêutico eficaz para OC

Citation:. Wu N, Wei J, Wang Y, Yan J, Qin Y, Tong D, et al. (2015) Ribossômico L22-Gosto1 (

RPL22L1

) Promove Ovarian Cancer Metástase induzindo transição epitelial-a-mesenquimal. PLoS ONE 10 (11): e0143659. doi: 10.1371 /journal.pone.0143659

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 05 de agosto de 2015; Aceito: 06 de novembro de 2015; Publicação: 30 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: número de cópias do DNA os dados da análise podem ser obtidas a partir de oncomine.org (https://www.oncomine.org/resource/main.html) e todas as etapas detalhadas estão dentro do papel. Todos os outros dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa Inovativa em University (Grant No. IRT1230 para YJ), o Natural Nacional Science Foundation da China (Grant No. 81.371.617 para YJ), a fundação Outstanding Juventude da Província de Heilongjiang da China (Grant No. JC201215 para YJ)

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer de ovário (OC) é a segunda neoplasia ginecológica mais comum e a primeira causa de morte [1]. metástase do cancro, em vez de tumores primários, são responsáveis ​​pela maioria das mortes de cancro [2]. Devido a uma falta de sintomas precoces definitivos e os marcadores apropriados para diagnóstico OC, numa fase inicial, a maioria dos pacientes são diagnosticados com OC de fase tardia acompanhada com metástases, que, tipicamente, tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos de 30% [3]. É fundamental para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na metástase OC, e determinar alvos moleculares eficazes, específicos e sensíveis que podem ser aplicadas ao diagnóstico de metástases, prognóstico e tratamento individual.

cromossomas duplos hora (DMS) são características citogenéticos de amplificação do gene [4]. DMS aparece em vários tipos de células cancerosas humanas, mas não em células normais [5]. Como elementos extra-cromossómicos que transportam amplificações de sequências de ADN genómico, DMS contribuir para a formação e progressão do cancro, oncogenes estão frequentemente presentes nas sequências amplificadas e as proteínas que eles codificam forem frequentemente sobre-expressa [6]. Exemplos de genes amplificados em DMs incluem

MYC

no câncer de cólon [7],

MYCN

no neuroblastoma [8],

EGFR

em gliomas [9], e

EIF5A2

[10, 11] no cancro do ovário [12]. Como DMs são veículos de genes amplificados incluindo muitos oncogenes, estudos funcionais de genes que são amplificados em DMs é uma boa maneira de explorar oncogenes candidatos.

A nossa equipa 3q26.2 previamente identificado como uma origem de DMs no ser humano a linha celular de cancro do ovário UACC-1598, e uma série de genes foram co-amplificado nas mesmas DMS ovarianos, incluindo o

MYCN,

EIF5A2

, e

RPL22L1

[13 ]. Ambos

MYCN

e

EIF5A2

desempenham um papel importante na progressão do cancro. No entanto, a relação entre o

RPL22L1

e câncer não é conhecido.

Neste estudo, nós mostramos que o

RPL22L1

é comumente sobre-expressos em indivíduos OC clínica e sua expressão nível está fortemente relacionada à invasão tumoral e metástase. Um

in vivo

experimento mostrou que a expressão forçada de

RPL22L1

promove o desenvolvimento do tumor xenoenxerto intraperitoneal em ratinhos nus, e aumenta a migração e invasão celular

in vitro

. Além disso, derrubando-a com pequena interferência RNA (siRNA) inibe a migração e invasão

in vitro

. Durante este processo,

RPL22L1

sobre-expressão resultou em elevada expressão dos marcadores de mesenquimais, tais como vimentina e α-SMA, e a diminuição da expressão de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, α-catenina, e β-catenina , indicando que a indução de epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) pode explicar os aumentos observados na motilidade e invasão por metástases capacidade. Nossos dados mostraram que

RPL22L1

desempenha um papel importante no processo de metástase OC.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade médica Harbin com o seguinte número de referência, HMUIRB20150023. Os microarrays de tecido de cancro do ovário (TMAs) para imuno-histoquímica foram adquiridos de US BIOMAX (ov951, ov1912, ov6161; Rockville, MD, EUA) e Xin Chao (Hova-Can90PT-01; Xangai, China). Ambas as empresas fornecidas declarações éticas para confirmar que os comités de ética locais aprovaram seus processos de aprovação, todos os participantes desde que os seus consentimentos informados por escrito e todos os esforços foram feitos para proteger a privacidade do paciente e do anonimato. As demonstrações éticos fornecidos pelas empresas e o protocolo de experiência tinha sido cuidadosamente verificada e aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade Médica Harbin (HMUIRB20150023). fêmeas de quatro semanas de idade BALB /c (específico à livre de patógenos) foram adquiridas da SLAC (Xangai, China) e alojados no Laboratório animal Harbin Medical University. Os ratinhos foram alojados em condições controladas de luz padronizadas à temperatura ambiente (24 ° C) e 50% de humidade, com livre acesso a comida e água. Experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações contidas nas Diretrizes de Uso de Animais de Laboratório da Universidade Médica Harbin. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Médica Harbin (HMUIRB20150023) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

linhas de células e cultura de células

Human linha de células de cancro do ovário UACC-1598, SKOV3, HO-8910, e HO-8910PM foram adquiridos a partir Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as células foram cultivadas seguindo os métodos descritos pela ATCC (Manassas, VA, EUA), e foram autenticadas em 2012 na Genetics Empresa Micro-ler (Pequim, China), utilizando uma análise em tandem repeat curta.

Preparação dos spreads metáfase e fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) análise

as células foram colhidas para a preparação metáfase propagação de acordo com os métodos descritos em estudos anteriores [14, 15] e foram coradas com Giemsa. Dois clones BAC, GFP-RP11-355H10, que cobre especificamente, a

MYCN

(amplificado em UACC-1598 e localizado na DMs [13]), e Cy3-RP11-726H11 para

RPL22L1

, foram seleccionadas como sondas de ADN e hibridado com metáfase de células como descrito previamente [16]. Os cromossomas foram contrastadas com DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindole). As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência Leica DM5000 B (Wetzlar, Alemanha), e analisados ​​utilizando o Imaging System Metamorph (Universal Imaging Corporation, West Chester, Nova Iorque, EUA).

número de cópias de DNA e análise de expressão gênica

O DNA Oncomine copiar o número de conjuntos de dados (https://www.oncomine.org/resource/main.html) inclui dados depositados no Cancer Genome Atlas (TCGA ovário 2 Dataset, http: //TCGA-data. nci.nih.gov/tcga/) foi usada para determinar as diferenças no número de cópias de ADN entre OC e os tecidos ovarianos de sangue /normais. 607 cystadenocarcinoma ovário seroso, 431 sangue normal, e 130 amostras de tecido de ovário normais foram analisados. Os dados foram obtidos por meio das seguintes etapas: nome do tipo de gene:

RPL22L1

na caixa de pesquisa e na árvore de navegação selecionar filtros primário Conjuntos de dados Tipo de DNA copiar o número de conjuntos de dados. O resultado de TCGA ovário 2 é directamente no primeiro, e foi gráfico à esquerda. Clique no botão histograma no canto superior esquerdo do título do gráfico para obter um gráfico de histograma. Sobre os filtros do grupo acima do título do gráfico, clique no símbolo de triângulo, no menu selecionado “Câncer e Tipo Normal” para fazer a análise agrupada por câncer e amostras normais. acesso a dados requer uma conta de e-mail acadêmico. Os autores deverão ser contactado para obter informações de login, se necessário.

Foram utilizados dois conjuntos de dados de expressão de genes microarray independentes. Ambos os conjuntos de dados foram gerados utilizando o Affymetrix Human Genome U133 Além disso plataforma 2.0 Array (Santa Clara, CA, EUA). Os arquivos raw.CEL para os dois conjuntos de dados foram baixados da Expressão Gênica Omnibus (GEO) website (GSE27651 e GSE28450) [17, 18], e normalizados utilizando o RMA (robusta média multi-array) algoritmo [19].

qRT-PCR

o ARN total de cada linha celular foi extraído utilizando o kit de alta Pure RNA Isolation (Roche, Basileia-Cidade, Suíça) seguindo as instruções do fabricante. PrimeScript

® RT Reagente Kit Perfeito Tempo Real (Takara, Dalian, China) foi utilizado para a transcrição reversa do RNA total. O cDNA foi quantificada utilizando LightCycler

® 480 SYBR Green I Master (Roche) em um LightCycler

™ 480 II Sistema de Tempo Real (Roche). Os primers específicos para o homem

RPL22L1

e

GAPDH

foram os seguintes:

RPL22L1

iniciador directo, 5′-AGAAGGTTAAAGTCAATGG-3 ‘e iniciador inverso, 5’-ATCACGAAGATTGTTCTTC- 3 ‘;

GAPDH

iniciador directo, 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3 ‘e iniciador inverso, 5’TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3’. Expressão de

RPL22L1

em amostras foi normalizado ao do

GAPDH

ea dobra-mudança na expressão foi calculada usando a 2

-ΔΔCt método.

Western blot análise

As células foram lisadas a 4 ° C em RIPA (8990, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Os lisados ​​celulares contendo 40 � de proteína total de cada amostra foram carregadas em geles de poliacrilamida a 12% de dodecilo e sódio e transferida para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA). Após bloqueio em solução de bloqueio de 10% (Roche), as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários seguido de 1-h de incubação com o anticorpo anti-murganho /anti-coelho secundário (200-332-263 /610-132-007 , Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, EUA), à temperatura ambiente. As imagens foram obtidas usando o Infrared Imaging System Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA) e cortadas usando o Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, EUA), representativo de cinco experimentos independentes. GAPDH foi usada como um controlo. Os detalhes dos anticorpos primários são fornecidos na complementar materiais S1 Texto

Tissue microarray

The OC microarrays de tecido (TMAs) foram adquiridos de US BIOMAX (ov951, ov1912, ov6161;. Rockville, MD, EUA) e Xin Chao (Hova-Can90PT-01; Xangai, China). Aprovação para este estudo foi obtida antes de ser iniciada a partir do comitê de ética regionais local. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica estudos (IHC) foram realizadas utilizando PowerVision

™ Two-Step Histostaining Reagente (Zhongshan Golden Bridge, Beijing, China) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, secções de TMA foram desparafinizadas e reidratadas. Para a recuperação de antigénio, as lâminas foram TMA em tampão citrato 10 mM tratados com microondas (pH 6,0) durante 8 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. As lâminas TMA foram incubadas com uma diluição 1:50 de monoclonal contra RPL22L1 humana (01:50) durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram então incubadas sequencialmente com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-anticorpo conjugados de peroxidase de rábano, durante 30 min a 37 ° C, e diaminobenzidina 3′-3 ‘foi utilizado como o substrato de cromogénio. Finalmente, todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina de núcleos, desidratados, e montado. Para o controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído com IgG de coelho normal. RPL22L1 imunorreactividade em amostras de TMA foi avaliado por três patologistas. A intensidade da imunorreatividade em TMAs foi graduada em uma escala de 0 a 3 com base em um consenso dos três investigadores.

Vectors

RPL22L1

-ORF foi amplificado por PCR e clonado no vector de expressão de pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O siRNA (h) e ARNsi de controlo foram adquiridos a RiboBio (Q000200916-1-B, Cantão, China). O plasmídeo repórter luciferase pGL4.17 foi gentilmente cedido pelo Dr. ZH Zhong (Departamento de Microbiologia, Harbin Medical University, Harbin, China).

A transfecção

Todos os plasmídeos e siRNAs foram transfectados em células usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

tumor Nude rato modelo de xenotransplante

as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê da Universidade médica Harbin (HMUIRB20150023) Ética e realizado de acordo com o diretrizes de uso de animais de Laboratório da Universidade médica Harbin. Quatro semanas de idade BALB /c ratos fêmeas nu foram randomização atribuído em cada grupo, de cinco ratinhos por grupo. Cada rato foi injectado com 1 × 10

6 células (em 200 ul de solução salina tamponada com fosfato [PBS]). O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana através de imagem de bioluminescência. Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com 150μg /g de D-luciferina (Biosynth, Naperville, IL) em PBS e anestesiados com 2,5% de isoflurano. Fótons emitidos a partir dos ratos foram gravadas por IVIS Lumina (Advanced Visão Molecular, Lincolnshire, UK) e apresentados como imagens pseudo-cores sobrepostas na imagem do corpo na escala de cinzentos. Todos os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação 30 dias depois injectado. Para garantir a morte na sequência de CO

2 asfixia, foi realizada deslocamento cervical.

Ensaios

migração e invasão celular

ensaios de migração e invasão celular Transwell foram realizadas utilizando inserções Corning de 8,0 mm Transwell (8 tamanho dos poros -μm, placa de 24 poços) e BD BioCoat

™ Matrigel

™ Invasion Chambers (Corning Incorporated Ciências da Vida, Tewksbury, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

a cicatrização de feridas ensaio

A monocamada de células foi riscada com uma ponta de pipeta 10 ul (em uma placa de 6 poços). Fotografias (ampliação, × 40) foram tomadas imediatamente e em cada 24 h após o ferimento até que as feridas estavam obviamente curado. Para cada ensaio, os experimentos foram realizados em nove diferentes posições e todo o ensaio foi repetido três vezes.

Imunofluorescência coloração

As células foram fixadas em metanol e bloqueadas durante 1 h com 10% normais soro de cabra, 0,3% de albumina de soro de bovino, 0,05% de saponina, e 0,3% de Triton X-100 em PBS. Os anticorpos primários foram adicionados e incubados a 4 ° C durante a noite. As células foram depois lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo secundário marcado por fluorescência. Um microscópio de fluorescência (Leica) foi utilizado para capturar as imagens.

Estatísticas

Os RPL22L1 níveis de TMAs expressão da proteína foram analisadas por testes de sinais com posto de Wilcoxon. A χ

2 teste foi usado para examinar a associação entre a expressão do gene e parâmetros clínicos. Outros dados foram expressos como médias ± DP, e a significância estatística das diferenças entre os dois grupos foi avaliada por meio de duas caudas de Student independente

t

-Testes. A significância estatística foi declarada se

P Art 0,05. Os cálculos foram realizados com o programa SPSS 13.0. (IBM; Armonk, NY, EUA)

Resultados

RPL22L1

foi amplificado através de DMs e sobre-expressos em células UACC-1598

a linha de células OC UACC-1598 continha amplificados genes na forma de DMs. amplificação do oncogene em DMS é representativa de tumorigénese, mas não ocorre em células normais (Fig 1A). Usando uma análise FISH, detectamos as regiões do

RPL22L1 amplificado

que co-localizada com

MYCN

em DMs (Fig 1B). Além disso, detectamos a amplificação do

RPL22L1

em tecidos ovarianos normais, os linfócitos humanos, e UACC-1598 células usando PCR (Fig 1C). Também examinamos a amplificação do

RPL22L1

em outros três linhas celulares de cancro do ovário (S1 FIG). RT-PCR confirmou a expressão de

RPL22L1

em amostras diferentes (figura 1D). Estes resultados indicaram que

RPL22L1

foi amplificado através de DMs em células UACC-1598.

(A) imagens representativas dos cromossomas em metafase de UACC-1598 e linfócitos humanos normais. As setas indicam DMs em células UACC-1598 (ampliação, × 1.000). (B) Imagens representativas de análise peixe. cromossomas da metafase de UACC-1598 e os linfócitos humanos foram detectados com sondas de ADN. (A) sonda Vermelho indica

RPL22L1 Comprar e (b) sonda verde indica

MYCN

; (C) ambas as sondas foram localizados no mesmo locus em DMS como indicado pelas setas, (d) sonda vermelho indica

RPL22L1

em linfócitos humanos normais (ampliação, × 1000). (C) os níveis de amplificação de DNA de

RPL22L1

detectado por PCR, (D) resultado RT-PCR dos níveis de expressão de mRNA de

RPL22L1

em diferentes amostras.

número de cópias de DNA e nível de

expressão RPL22L1

em amostras OC clínica

Para determinar a amplificação da

RPL22L1

na clínica, foi utilizado o banco de dados Oncomine (https: //www .oncomine.org) para analisar os perfis no número de cópias de DNA do

RPL22L1

em um conjunto de dados de ovário TCGA (TCGA ovário 2, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [20 , 21]. Este conjunto de dados indicaram claramente um aumento significativo no número de cópias de ADN de

RPL22L1

em OC comparado a normal do sangue e tecidos ovarianos, limite pelo

P Art 10

-4 (Fig 2A).

(A) cópias de ADN perfis número de

RPL22L1

em um conjunto de dados cystadenocarcinoma seroso do ovário registado na base de dados Oncomine (TCGA ovário 2 Dataset) . Dois conjuntos de dados de expressão gênica por microarrays independentes (B) GSE29405 e (C) GSE27651 do site GEO foram usadas para examinar o nível de

RPL22L1

em OC expressão. Os arquivos raw.CEL para os dois bancos de dados foram baixados e normalizado pela RMA.

RPL22L1

foi mais altamente expresso em OC do que em tecido ovariano normal (*

P Art 0,05, de Student independente

t

-teste). imagens representativas da expressão da proteína RPL22L1 em ​​(D) OC e (E) combinado tecido normal adjacente por IHC (ampliação, × 400).

Além disso, obteve-se publicamente disponíveis conjuntos de dados de expressão GEO analisar a expressão de

RPL22L1

em amostras de CO. Foram utilizados dois conjuntos de dados GEO com base no 2.0 Matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus para avaliar

RPL22L1

níveis de expressão de mRNA em OC e tecidos ovarianos normais. Em cada um dos dois conjuntos de dados,

RPL22L1

expressão foi significativamente maior no OC do que os tecidos ovarianos normais (Fig 2B e 2C,

P Art 0,05, teste t de Student).

para examinar ainda mais o nível de

RPL22L1

em amostras clínicas expressão da proteína, quatro OC TMAs foram utilizados para análises de IHC. intensidade da coloração foi estimada utilizando um índice de 0-3 no núcleo da célula e no citoplasma (Fig S2). RPL22L1 foi claramente expressa mais altamente no citoplasma OC do que na dos tecidos adjacentes normais (Fig 2D e 2E) (

P

= 0,008, teste de sinais com posto de Wilcoxon).

Foi examinada a associações entre os níveis de expressão de proteína RPL22L1 e variáveis ​​clínico-patológicas. expressão RPL22L1 no citoplasma das células OC foi fortemente associada com o estágio, invasão e metástases em linfonodos (

P Art 0,05, χ de Pearson

2 teste, Tabela 1). Estes resultados indicaram que a expressão de

RPL22L1

é geralmente maior em espécimes clínicos OC, e o seu nível de expressão está associado com a progressão do tumor, especialmente com a invasão e metástase de gânglio linfático.

RPL22L1

desenvolvimento do tumor xenoenxerto reforçada intraperitoneal

in vivo

Para detectar o papel de alto nível

RPL22L1

na progressão tumoral, selecionamos uma linha de células OC com baixa expressão RPL22L1, SKOV3, em estudos funcionais (Fig 3A). células SKOV3 foram transfecção estável com luciferase anteriormente e, em seguida, transfecção estável com

RPL22L1

(Fig 3B e 3C). Para explorar o papel da

RPL22L1

na progressão tumoral

in vivo

, nós intraperitoneal injetaram células de controlo SKOV3-RPL22L1 e em ratinhos nus. Os tumores xenoenxertados foram medidos usando a bioluminescência no 30

° dia após a injecção, a área de tumor de xenoenxerto em ratinhos com células SKOV3-RPL22L1 injectados era maior do que a de células de controlo injectados (Fig 3D). O resultado sugeriu que o alto nível de

RPL22L1

contribuir para o desenvolvimento do tumor.

(A) A expressão de RPL22L1 em ​​células SKOV3 UACC-1598 e foi examinada por Western blot. Expressão de

RPL22L1

em células SKOV3-RPL22L1 e controlo foi analisada por (b) manchas de Western e (C) de qRT-PCR. (D) ratinhos nus com quatro semanas de idade foram injectados intraperitonealmente com células SKOV3-RPL22L1 ou de controlo e bioluminescência imagens foram tiradas após 30 dias. (Bar: média ± SD; *

P Art 0,05, Student independente do

t

-teste).

RPL22L1

promovido OC migração e invasão celular

Para confirmar o papel da

RPL22L1

em células OC, as células UACC-1598 foram tratados com três siRNAs específicos contra o

RPL22L1

(siRNA-1, siRNA -2, e-3 siRNA). Desde siRNA-2 exibiu o knockdown mais eficiente de endógena

RPL22L1

, foi escolhido para análises posteriores (S3 FIG). Exceto as células testemunha SKOV3-RPL22L1 e, usamos mais duas linhas de células OC HO-8910 e HO-8910PM com menor

RPL22L1

expressão transitória transfectadas com

RPL22L1 Compra de um estudo mais aprofundado funcional (S3 FIG). O efeito da

RPL22L1

na motilidade celular foi caracterizado por cicatrização de feridas, a migração transpoço e ensaios de invasão de Matrigel. Knockdown de

RPL22L1

em células UACC-1598 (1598-siRPL22L1) causou ression clara de células migração e invasão. Sobre-expressão de

RPL22L1

em células SKOV3-RPL22L1, HO-8910 (8910-RPL22L1) e HO-8910PM (8910PM-RPL22L1) poderia melhorar significativamente as células migração e invasão (

P

0,05, Figura 4). taxa de crescimento celular foi analisado através de um ensaio MTA,

RPL22L1

teve nenhuma influência sobre a proliferação celular (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que o alto nível de

RPL22L1

melhora células OC migração e invasão.

(A-D) imagens representativas de ensaio de cicatrização das células (ampliação, × 40). (E-H) migração das células foi detectada por ensaio Transwell migração, e (I-G) a invasão de células foi avaliada utilizando a câmara de invasão de Matrigel. Exemplos de células que migraram através da membrana (painel esquerdo), colunas indicam experiências em triplicado (Ampliação, x 100, Bar: média ± SD *

P Art 0,05, de Student independente

t Restaurant – teste).

o nível de expressão

RPL22L1

influências OC linha de células EMT

é cada vez mais claro que a EMT é um componente integral da progressão da epitelial tumores -derived [22, 23]. Descobrimos que as células SKOV3-RPL22L1 exibiu uma morfologia fusiforme e fibroblástica enquanto que as células 1598-siRPL22L1 expostas formas de encolhimento e aumento da adesão célula-célula (Fig S4). Portanto, nós examinamos se

RPL22L1

EMT induzida poderia explicar o

RPL22L1

mediada por alterações nas células motilidade e invasão. características bioquímicas de EMT incluem a perda da expressão de proteínas marcadoras epiteliais e concomitante aumento na expressão do marcador mesenquimais [22, 24]. As transferências de Western e análise de imunofluorescência foram usadas para avaliar a expressão de marcadores epiteliais e mesenquimais. Após ectópica sobre-expressão de

RPL22L1

em células SKOV3, a expressão de fabricantes epiteliais, como a E-caderina, β-catenina e α-catenina diminuiu, ao passo que a expressão de vimentina, α-SMA, e fibronectina aumentou (Fig 5A e 5B). Em 1598-siRPL22L1 células, os níveis de marcadores a vimentina mesenquimais e N-caderina de expressão foram degradados (Fig 5C). Estes resultados sugeriram que o nível de

RPL22L1

influências nas células EMT OC.

(A) Western blots expressão mostraram níveis mais baixos de marcadores epiteliais (E-caderina, β-catenina, e α- catenina) e níveis mais elevados de marcadores mesenquimais (vimentina, α-SMA, e fibronectina) em SKOV3-RPL22L1 em ​​comparação com células de controlo no. (B) Se a análise mostrou diminuição dos níveis de marcadores epiteliais (α-catenin e β-catenina) e aumento dos níveis de marcadores mesenquimais (fibronectina e vimentina). (C) análise de Western blot mostrou que knockdown de

RPL22L1

por siRNA resultou em uma diminuição do nível de marcadores mesenquimais (vimentina e N-caderina) em células UACC-1598.

Discussão

DMs são marcadores citogenéticos malignas e estão estreitamente correlacionados com a progressão do tumor [4]. Anteriormente, nós determinamos que

RPL22L1

amplificado em DMs, mas a sua função não é clara. Muitos oncogenes são amplificados via DMs em células tumorais malignas [34.38.39], tais como

EIF5A2

e

MYCN

, sendo que ambos estão localizados no mesmo locus como

RPL22L1

em DMs. Nós inferir que

RPL22L1

podem estar envolvidos na progressão OC, e verificou isso em uma série de

in vitro Comprar e

In vivo

ensaios.

Usando disponível publicamente TCGA e geo conjuntos de dados de expressão encontramos tanto do número de cópias de DNA e expressão de mRNA de

RPL22L1

foi significativamente maior nos tecidos OC do que em tecidos ovarianos normais. a expressão da proteína de

RPL22L1

foi examinado por IHC utilizando quatro OC TMAs. Descobrimos que a expressão RPL22L1 era frequentemente mais elevados em tecidos OC comparação com tecido ovariano normal adjacente (

P

= 0,008, teste de Wilcoxon). Além disso, encontramos o nível de expressão foi significativamente correlacionada com o estágio da doença (81,7% no estágio 2-4 ante 64,5% no estágio 1) profundidade de invasão (81,9% em T2-T4 contra 64,5% em T1), e metástases em linfonodos (86,6 % contra 70,3% com sem metástases), sugerindo que o nível elevado de RPL22L1 em ​​células OC pode facilitar o fenótipo invasivo /metastático. Estes dados reforçam um papel potencialmente importante de

RPL22L1

como um mecanismo biológico subjacente no desenvolvimento e progressão da OC.

Os resultados da análise IHC indicou que

RPL22L1 o mundo Mai ser envolvido na patogénese da progressão OC especialmente na metástase. Para confirmar esta hipótese, xenotransplante tumoral ratinho nu, cicatrização de feridas, a migração transpoço e ensaios de invasão Matrigel foram realizados para investigar o papel da

RPL22L1

na regulação células OC motilidade, invasão. Sobre-expressão de

RPL22L1

obviamente promovido o desenvolvimento do tumor

in vivo

e aumentou a capacidade de migração e invasão de três linhas celulares OC

in vitro

. migração Além disso, o knockdown de endógena

RPL22L1

por siRNA em células UACC-1598 inibiu a invasão e

in vitro

. Migração e invasão são duas etapas importantes na metástase de tumor [25], e esses ensaios funcionais sugeriu fortemente que

RPL22L1

desempenha um papel importante na promoção da metástase de tumor via reforço migração e invasão celular.

Muitos processos biológicos estão associadas com a migração e invasão incluindo EMT, um acontecimento chave na invasão tumoral e metástase [26]. A sobre-expressão de

RPL22L1

reduzida a expressão de proteínas marcadoras epiteliais (E-caderina, β-catenina, e α-catenina) e aumentou a expressão de marcadores mesenquimais (vimentina, α-SMA, e fibronectina), que são características bioquímicas da EMT [24, 27, 28]. No entanto, após knockdown de

RPL22L1

em células UACC-1598, a vimentina marcadores mesenquimais e N-caderina foram obviamente regulada para baixo. EMT desempenha um papel crítico na promoção da metástase e durante este processo de células obter capacidades de migração e invasão, que promovem a metástase [29, 30]. Por conseguinte, inferiu-se que a sobre-expressão de EMT de

RPL22L1

provavelmente induzido a promover a invasão celular e metástase.

RPL22L1 é um parálogo de RPL22, que é um componente de proteína de ligação a ARN da 60S subunidade ribossômica. proteínas ribossomais são os principais componentes de ribossomas, onde as proteínas celulares são sintetizados. Até à data, a cerca de 80 proteínas ribossomais foram identificados. Além de seus papéis fundamentais na síntese de proteínas, algumas proteínas ribossomais estão envolvidos em funções extra-ribossômica, como reparação do DNA, apoptose, regulação da transcrição e regulação tradução [31-36]. Um número crescente de relatórios sugeriram que as proteínas ribossomais têm um potencial oncogénico [37-39]. Recentemente,

RPL22

foi encontrado para ser mutado ou regulada para baixo em vários cancros, incluindo leucemia linfoblástica aguda T-, carcinoma da mama invasivo, e adenocarcinoma do pulmão. Além disso,

RPL22

reprime diretamente a expressão de

RPL22L1

mRNA, e uma falta de RPL22 provoca um aumento compensatório na RPL22L1 [40, 41]. Estes estudos ort nossa conjectura sobre o papel da

RPL22L1

na progressão do cancro.

Em conjunto, nossos resultados sugerem que o

RPL22L1

desempenha um papel importante na progressão OC, aumentando celular invasão e metástase via indução de EMT. Como

RPL22L1

é um gene amplificado DM realizado, nossos dados podem ajudar a explicar a função das DMs no câncer.