Abstract

Fundo

adrenomedulina (AM) é altamente expressa em câncer de pâncreas e estimula as células cancerígenas pancreáticas que conduzem a crescimento tumoral e metástase aumentada. O presente estudo examina o papel dos receptores AM específicas sobre tumor e células que se assemelham o microambiente tumoral (estreladas humano pancreático – HPSC, veia umbilical humano – células HUVEC e endoteliais do mouse pulmão – MLEC).

métodos e resultados

AM receptores ADMR CRLR e estavam presentes em HPSC, HUVEC e MLECs enquanto as células PDAC possuía apenas receptores ADMR como avaliado por RT-PCR e transferência de western. Todas as linhas de células expressa e segregada AM, tal como indicado por ELISA. O crescimento de cada uma das linhas celulares foi estimulada por exógeno AM e inibida pela AMA antagonista. AM também estimulou

in vitro

angiogênese avaliada pela formação de polígono de linhas de células endoteliais. silenciamento mediado por SiRNA de ADMR, mas não CRLR, reduziu o crescimento basal de todas as células examinadas e reduziu a formação de polígono de células endoteliais

in vitro

. tumores ortotópicos desenvolvidos com células cancerosas rolamento shADMR tinha reduzido dramaticamente o volume do tumor primário ( 90%) e do pulmão e metástases do fígado em comparação com células portadoras de shControl. Para validar ADMR como um potencial alvo terapêutico, i

n vivo

estudos foram conduzidos utilizando nanoliposomes neutros para entregar sistemicamente siRNA humano para ADMR para silenciar células cancerosas humanas e rato siRNA para ADMR para silenciar células do estroma tumorais mouse. silenciamento sistêmica de ambos ADMR humana e do rato não teve efeitos adversos óbvio, mas o desenvolvimento do tumor fortemente reduzida.

Conclusão

ADMR medeia os efeitos estimulantes da AM em células cancerosas e em células endoteliais e estreladas dentro do microambiente do tumor. Estes dados suportam o desenvolvimento da ADMR como um tratamento alvo útil de câncer pancreático

Citation:. Ramachandran V, Arumugam T, Langley R, Hwang RF, Vivas-Mejia P, Sood AK, et al. (2009) O ADMR receptor medeia os efeitos da adrenomedulina em células de câncer de pâncreas e nas células do microambiente do tumor. PLoS ONE 4 (10): e7502. doi: 10.1371 /journal.pone.0007502

editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 04 de junho de 2009; Aceito: 15 de setembro de 2009; Publicação: 22 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Ramachandran et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo NIH DK052067, MD Anderson apoio central CA16672 concessão, MD Anderson pancreáticas Programas especializados de Investigação de Excelência CA101936 (SPORE) P20 concessão, e pela Lockton Endowment, e apoio de um projeto de Grant Programa de Desenvolvimento do Fundo de Investigação do cancro do ovário. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos e estima-se que em 2008 cerca de 37.680 americanos foram diagnosticados e 34.290 morreram desta doença [1]. Apesar de avanços significativos estão começando a ser feitos na gestão da doença, a taxa de sobrevida em 5 anos não tem melhorado ao longo dos últimos 25 anos [1]. A taxa de mortalidade elevada é devido à elevada incidência de doença metastática no momento do diagnóstico inicial, o curso clínico agressivo e a falha de terapias sistémicas [2]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente para uma melhor compreensão da biologia molecular da doença que pode ser utilizado para desenvolver novas terapias para o cancro pancreático.

que anteriormente mostraram que a adrenomedulina (AM) é sobre-expresso em cancro do pâncreas e tem um papel autócrino forte nesta doença [3]. AM é um péptido de 52 aminoácidos originalmente isolado a partir de feocromocitoma humano [4], que funciona como um péptido regulador multifuncional [5]. Um problema com AM como um alvo para terapia do câncer é que AM tem várias funções fisiológicas cuja inibição pode ser prejudicial. AM é expressa em células de ilhéus pancreáticos normais, com expressão predominante nas células M, que também contêm o polipéptido pancreático [6]. AM reduz a secreção de insulina em condições fisiológicas [6]. AM também tem efeitos importantes em biologia celular vascular onde regula o tônus ​​vascular e permeabilidade e promove a vasodilatação [7] – [11]. AM é também uma molécula angiogénico potente, especialmente em hipóxia, o que induz AM [10]. Os efeitos angiogénicos de AM são provavelmente mediada através da estimulação directa da proliferação de células endoteliais [12] e a protecção de células endoteliais da apoptose [13]. sinalização adrenomedulina é necessário para o desenvolvimento vascular linfático murino [14]. Ratinhos nos quais AM foi geneticamente excluído desenvolver edema cutâneo e letalidade midgestational devido a defeito no crescimento de vasos linfáticos e defeito cardiovascular [15]. No cancro, AM parece ter um papel importante na angiogénese, assim como um efeito adicional trófico directamente sobre as células cancerosas [16] – [18].

AM actua como um ligando de péptido que activa os receptores na superfície da célula . células beta pancreáticas expressam receptores conhecidos para responder a AM, incluindo o receptor de adrenomedulina (ADMR, também conhecido como L1-R) e o receptor-like-receptor de calcitonina-(CRLR) [6], [19], [20]. O nosso estudo anterior descobriram que as células de cancro do pâncreas expressam apenas ADMR, enquanto ambos os receptores estão presentes nas células encontradas dentro do microambiente do tumor, incluindo células humanas pancreáticas estreladas (HPSCs) e células endoteliais. No entanto, as funções dos receptores específicos no efeitos da MA sobre o câncer de pâncreas, HPSCs e células endoteliais são presentemente desconhecidos.

O presente estudo examina os efeitos da AM em células humanas pancreáticas tumorais, HPSCs e células endoteliais e investiga a receptores envolvidos nestes efeitos. Nós silenciados cada um dos receptores

in vitro

usando siRNA e descobriu que ADMR foi o principal responsável para os efeitos biológicos da AM em cada um destes tipos de células. Em seguida, examinou os efeitos de silenciamento ADMR em células de câncer de pâncreas e observaram uma redução significativa do crescimento do tumor

in vivo

. Para analisar o potencial de ADMR como alvo de terapia de câncer, nós então avaliaram os efeitos de silenciamento ADMR em ambas as células de rato que compõem o microambiente do tumor e em células cancerosas humanas, usando nanoliposomes DOPC para entregar espécies siRNAs específicos. Este silenciamento sistémica de ADMR não teve efeitos deletérios óbvios em camundongos sadios, mas o desenvolvimento do tumor bastante reduzido. Portanto, ADMR deve ser um alvo importante para o futuro desenvolvimento de pequenas moléculas terapêuticas.

Materiais e Métodos

linhas celulares e AM Peptides

células BxPC3 cancro do pâncreas e células HUVEC linhas foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas MPanc96 foram originalmente estabelecido pelo Dr. Timothy J. Eberlein (St. Louis, MO) [21]. MLECs são células endoteliais microvasculares de culturas primárias obtidas a partir de pulmões de ratinhos cujos tecidos abrigar um antigénio sensível à temperatura T grande de SV40 [22]. Quando cultivada sob temperaturas permissivas (33 ° C), as linhas celulares exibida vezes consistentes com as células endoteliais que possuem um fenótipo angiogénico de duplicação. A transferência destas células endoteliais a temperaturas não permissivas (37 ° C) resultou em diferenciação celular e a indução de um estado de repouso. MLECs foram cultivados em 10% de FBS em DMEM. BxPC3 células foram cultivadas em 10% de FBS em meio RPMI, As células foram cultivadas em MPanc96 10% de FBS em meio DMEM e células endoteliais humanas (HUVEC) foram cultivadas em FBS a 15% em MEM. Todos os meios continha 1% de antibiótico. células estreladas pancreático humano (HPSCs) foram isolados usando o método de desdobramento a partir de amostras de adenocarcinoma pancreático de doentes sujeitos a ressecção cirúrgica e cultivadas em 15% de FBS em DMEM [3], [23]. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. linhas celulares BxPC3 e MPanc96 rolamento estavelmente vetores shControl ou shADMR e o gene luciferase desenvolvido em um estudo anterior também foram utilizados [3]. Adrenomedulina (AM 52) e antagonista adrenomedullin (AMA (AM 22-52)) foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO).

ELISA para AM

AM foi detectado em condicionado mídia da HPSC, HUVEC e MLECs usando um ELISA comercial. Para recolha dos meios condicionados, as linhas celulares foram cultivadas até à confluência de 80% e lavou-se com PBS e em seguida cultivadas durante 24 horas em seus respectivos meios isento de soro. O meio foi recolhido e concentrado utilizando dispositivos de filtração Centricon YM-3 (Millipore Corporation, Chicago, IL). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o reagente de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). O ensaio ELISA competitivo foi então conduzida usando um kit de detecção de AM (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA; Cat # EK-010-01) seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. meio isento de soro concentrado respectivos serviu como valores de DO do controlo de reagente e foram subtraídos dos de todas as outras amostras. Os cálculos de concentração de AM utilizada a curva padrão incluída no kit e foram conduzidos de acordo com o protocolo do fabricante.

transfecção transiente de siRNA

O silenciamento de ADMR CRLR e foi conseguida em HPSC, HUVEC e MLECs (2 × 10

4 células) utilizando a transfecção transiente de ARNsi. Humano e do rato siRNAs cada contra o controle, ADMR e CRLR (siRNAs ID # 4611, 46184, 42272, Ambion Inc. Austin, TX e fez costume rato siRNAs ID # Control – 1.129.089, 1.129.090; ADMR – 1.129.085, 1.129.086; CRLR – 1.129.087, 1129088 a partir de Sigma-Aldrich (Proligo), St. Louis, MO) foram transfectadas com uma concentração final de 5 nM por poço em placas de 96 poços. Nós também analisou os efeitos da siADMR sobre as células cancerosas MPanc96. SiRNA transfecção foi realizada com o reagente de transfecção Hiperfect (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Western Blotting

células

MPanc96, HPSC, HUVEC e MLEC foram transientemente transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi contra ADMR ou CRLR e, após 72 horas, os lisados ​​celulares foram preparados e as concentrações da proteína foram medidas por reagente BioRad. A proteína (50 ug) foi carregado para 10% de gel SDS-PAGE e transferência de Western foi realizada utilizando um anticorpo primário contra ADMR (Cat # LS-A4048 MBL International Corporation, Woburn, MA) a uma diluição de 1: 1000 e utilizando um anticorpo primário contra CRLR (cat # SC-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a uma diluição de 1: 100. A mesma membrana foi re-sondado para β-actina (diluição 1:200; cat # A2066 Sigma, St. Louis, MO)., Que serviu como controlo de carga

RT-PCR

O ARN total foi extraído a partir de HPSC, HUVEC e células MLEC com ou sem siARN transfecção e do pâncreas de ratinho. ADNase foi usada para remover o ADN genómico contaminante após purificação de ARN. A integridade do ARN foi confirmada pela execução em um gel desnaturante, e observando as bandas 28S e 18S rRNA claras. Um não-transcritas inversa de controlo foi executada para assegurar que nenhum ADN genómico foi amplificado. RT-PCR foi realizada com os iniciadores AM /ADMR /CRLR humano e de ratinho para determinar a sua expressão e os níveis de silenciamento. A transcrição reversa foi seguida de 35 ciclos de PCR padrão (desnaturação de 1 min a 94 ° C, emparelhamento de 1 min a 63 ° C, e extensão de 1 min a 72 ° C). Primers desenhados para AM humana (Genebank: NM_001124) foram: 5’CGG frente GAT CCA TGA AGC TGG TTT CCG TC 3 ‘e reverter, 5’ CGG AAT TCC TAA AGA AAG TGG GGA GC 3 ‘. Iniciadores concebidos para ADMR humana (Genebank: NM_007264) foram: para a frente 5 ‘CAT CGC GGA CCT GGG CAT TGT 3’ e reverter, 5 ‘TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3’. Iniciadores concebidos para CRLR humana (Genebank: NM_005795) foram: encaminhar 5’TGC TCT GTG AAG GCA TTT AC 3 ‘e reverter, 5’ CAG AAT TGC TTG AAC CTC TC 3 ‘. Primers desenhados para mouse AM (Genebank: NM_009627) foram: para a frente 5 ‘CCA GGG TTC CCG CAG CAA 3’ e reverter, 5 ‘CTA TAT CCT AAA GAG TCT GG 3’. Primers desenhados para mouse ADMR (Genebank: NM_007412) foram: para a frente 5 ‘CCG TTA CCT TCC CAA GGA 3’ e reverter, 5 ‘TTA GCT GGC TAC AGA ATT GCA 3’. Primers desenhados para mouse CRLR (Genebank: NM_018782) foram: para a frente 5 ‘TGG CTT TTC CCA CTC TGA T 3’ e reverter, 5 ‘TCA CAT CAC TAG ATC ATA CGT 3’. 18S iniciadores serviu como controlo de carga para as reacções de RT-PCR. Os produtos amplificados foram separados em géis de agarose a 1,5% e visualizado por brometo de etídio.

estudos de crescimento celular

HPSC, HUVEC e MLECs (1000 células) foram semeadas em placas de 96 poços em 0,5% de soro contendo meios com ou sem AM (0-200 nM) ou AMA (1 uM), que foi trocado diariamente, e o número de células foi estimado após 48 horas para HPSC e células HUVEC e após 96 horas para MLECs por ensaio MTS. Para os estudos de ARNip, HPSC, HUVEC e MLECs (1000 células) foram semeadas em placas de 96 poços e respectiva humano e de ratinho siControl /siADMR /siCRLR foram transfectadas e o número de células foi estimado após 48 horas para as células HPSC e HUVEC e após 96 horas para MLECs. O crescimento celular foi analisada utilizando o reagente MTS acrescentou uma hora antes de tomar a leitura espectrofotométrica de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI).

In vitro

Angiogenesis ensaio

HUVEC e MLEC (1 × 10

4) as células foram semeadas sobre a superfície do ECMatrix polimerizado preparado como descrito pelo fabricante (Cat # ECM625; Chemicon Intl, Millipore Corp., Billerica, MA). As células foram tratadas com AM (200 nM) ou (1 uM) e depois AMA péptidos formação do tubo 6 horas foi avaliada sob um microscópio de luz invertido (Olympus, Center Valley, PA). As imagens foram captadas com uma refrigerados, charge-coupled câmera do dispositivo (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) e software SmartCapture (Digital Scientific, Cambridge, UK). As imagens foram posteriormente tratados com o software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). Para quantificar os eventos angiogénicos, os padrões de crescimento celular em 10 campos aleatórios a 100 × ampliação foi avaliada de acordo com as sugestões do fabricante e classificados como: células individuais, bem separados -0; As células migraram e alinhadas -1; tubos capilares à vista, não brotando -2; Brotando de tubos capilares -3; polígonos fechados formado – 4; e as estruturas do tipo de rede complexas desenvolvido -5

coloração imuno-histoquímica -. CD31 /VEGF

não coradas 4 mm secções de tecido de siControl ou siADMR ratinhos tratados foram desparafinados com xilol e reidratados com etanol. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio em metanol e sítios de ligação não específicos foram bloqueados com solução de bloqueio de proteína (5% de cavalo normal e soro de cabra normal a 1%). O anticorpo primário contra o CD31 (1: 800 de diluição; cat # 01951A; BD Pharmingen, San Diego, CA) /VEGF (1:100 diluição; cat # SC-152; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi adicionado e as amostras foram incubadas durante a noite a 4 ° C. Foi adicionado anticorpo secundário e incubaram-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as lâminas foram desenvolvidas com 3,3-diaminobenzidina (DAB) substrato contrastadas com hematoxilina, desidratadas com etanol, fixadas com xileno e montadas. A imuno-histoquímica foi analisado usando um microscópio de luz invertida (Olympus, Center Valley, PA). As imagens foram captadas com uma refrigerados, charge-coupled câmera do dispositivo (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) e software SmartCapture (Digital Scientific, Cambridge, UK). As imagens foram posteriormente tratados com o software Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, CA). As lâminas foram cegados e analisados ​​pelo núcleo IHC no Departamento de Biologia do Câncer, UT MDACC.

DOPC nanoliposome acoplado siRNAs.

Para experiências para testar a eficácia de

in vivo

direccionamento terapêutico de tumores em ADMR ortotópico em murganhos, foram preparados lipossomas neutros contendo ARNsi como previamente descrito [24]. Resumidamente, oligonucleotídeos siRNA (sem grampos) para ADMR sequências alvo (siADMR humana (sentido – 5 ‘rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3’), mouse siRNA sequência sentido – 5 ‘rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3’) ou sequências de controle (controle dos sentidos siRNA sequência – 5 ‘UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3’ ) (custom made oligos humano e rato cat # siADMR humano – 1.150.080, 1.150.081; mouse siADMR – 1129085-H, 1.129.086-H; Control – 1.129.089, 1.129.090 de Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) foram misturados com 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) a uma razão de 10:01 (w /w) de DOPC /siRNA e liofilizada. Imediatamente antes

a administração in vivo

, preparações liof ilizadas foram hidratados em solução salina a 0,9% a uma concentração de 10 ug de ARNsi por 200 jil e foram purificados por separação siARN livre a partir de lipossomas com unidades de filtro com um limite de exclusão de tamanho de 30.000 daltons (Millipore Corp, Billerica, MA).

Teste de tolerância à glicose.

Para a tolerância à glicose, os ratos foram injectados por via intraperitoneal com 1,5 mg de glucose /g de peso corporal às 9:00 da manhã, depois de um 16-h rápido. glicose no sangue foi determinada nos tempos indicados com amostras de sangue da cauda obtidos utilizando o glicosímetro Ascensia CONTOUR sangue (Cuidados de Saúde Bayer, cidade Tarry, NY).

In vivo

estudos.

Todos os animais foram manipulados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definidos por organismos de carácter nacional e /ou local animal pertinentes, e todo o trabalho animal foi aprovada pela comissão competente (IACUC – 09-04-08832).

modelo tumor ortotópico.

Células MPanc96 e BxPC3 rolamento shADMR ou shControl foram desenvolvidos como mencionado em uma publicação anterior [3]. Estas células de câncer pancreático foram ainda modificadas para expressar estavelmente o gene luciferase de vaga-lume por transfecção lentivírus para facilitar a

in vivo

acompanhamento do desenvolvimento do tumor [25]. Estas células foram cultivadas até 80% de confluência, colhidas por tripsinização, lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas a uma concentração final de 1 × 10

6 células /50 ul de células MPanc96 e 2 × 10

6 células /50 ul de células BxPC3 em PBS estéril e injectada no pâncreas de quatro semanas de idade do sexo masculino

atímicos nu

ratinhos (n = 5). O crescimento do tumor foi avaliado por imagem de bioluminescência no final de quatro semanas. foram feitas

Pulmão e modelos de metástase hepática.

Comparações entre pulmão e metástase hepática em células MPanc96 rolamento células shADMR ou shControl utilizando modelos de metástase bem estabelecidos. metástases pulmonares foram desenvolvidos por injecção na veia da cauda de 1 × 10

6 células /100 ul (n = 9) e metástases no fígado, por injecção do baço de 1 × 10

6 células /50 ul (n = 7) a

atímicos camundongos nus

e avaliada por imagem de bioluminescência. Após seis semanas, os ratinhos foram sacrificados e os órgãos foram removidos e armazenados em solução de fixador de Bouin.

Entrega de nanoliposome DOPC acoplado siRNAs. Compra de avaliação da toxicidade potencial, experimentos foram conduzidos nanoliposome entregar DOPC acoplado siControl ou siADMR (mouse) para

camundongos

nus atímicos (10 ug por ip animais duas vezes por semana, durante quatro semanas). Ingestão de água e alimentos, o peso corporal e os níveis de glicose no sangue foram medidos. Os animais foram sacrificados após quatro semanas, o pâncreas e foi isolado o ARN total foi extraído. RT-PCR foi utilizado para avaliar o silenciamento de ADMR, enquanto 18S serviu como controlo interno. tumores ortotópicos foram desenvolvidas em

ratinhos nus atimicos com células MPanc96 portador do gene da luciferase (1 × 10

6 células /50 ul de PBS estéril) e duas semanas mais tarde, DOPC nanoliposome acoplado siControl e siADMRs (humano e rato em combinação) foram entregues 10 ug por ip animais duas vezes por semana durante seis semanas. imagem de bioluminescência. imagem de bioluminescência foi realizada utilizando um sistema de imagem criogenicamente arrefecida acoplado a um computador que executa o software de aquisição de dados LivingImage (Xenogen Corp., Alameda, CA). Antes de imagem, os animais foram anestesiados numa câmara de acrílico com uma mistura de isoflurano /ar de 1,5% e injectados i.p. com 40 mg /ml de sal de potássio luciferina em PBS a uma dose de 150 mg /kg de peso corporal. A imagem Animal em tons de cinza digital foi adquirido seguido de aquisição e sobreposição de uma imagem pseudo representando a distribuição espacial dos fotões detectados emergentes da luciferase activa dentro do animal. A intensidade de sinal foi quantificada como a soma de todos os fotões detectados dentro da região de interesse por segundo. Após a imagiologia de tumores final, os tecidos foram removidos e os animais foram re-fotografada para visualizar e contar a disseminação de células de cancro e metástases. Tecidos também foram fixadas com formaldeído e histologia foi avaliada para verificar a exactidão dos dados de bioluminescência.

Análise Estatística

Todos

in vitro

experimentos foram realizados em triplicado e realizada em três ou mais ocasiões separadas. Os dados apresentados são médias de três ou mais experiências independentes ± erro padrão da média (EPM). diferenças estatisticamente significativas entre os controles e amostras tratadas foram determinadas pelo teste t bicaudal de Student não pareado e foram definidos como * p 0,05. Os resultados foram comparados usando GraphPad Prism 4 software (GraphPad Software, https://www.graphpad.com).

Resultados

AM tem efeitos autócrinos no HPSC, HUVEC e células MLEC

Anteriormente observou-se que AM serviu como um regulador autócrino de proliferação, sobrevivência, e a motilidade das células cancerígenas pancreáticas [3]. Para determinar se AM também influenciada HPSC, HUVEC e MLECs, primeiro analisado se estas expressa AM e seus receptores ADMR CRLR e como medido por RT-PCR. Todas as três linhas celulares expressavam AM, ADMR e CRLR (Fig. 1A). Além disso, avaliou-se essas células segregadas SOU em meios de cultura de tecidos utilizando um ELISA. Todos estes tipos de células segregadas PM (Fig. 1B), apoiando o papel desta molécula como um regulador autócrino em vários tipos de células. Para examinar os efeitos do AM sobre a biologia destas células, exógena AM foi adicionado ao HPSC (Fig. 1C), HUVEC (Fig. 1D) e MLEC (Fig. 1e) células e proliferação foi avaliada pelo ensaio MTS. Estudos anteriores indicaram que a concentração óptima de AM foi de 50 nM para HPSC e 200 nM para a HUVEC e células MLEC (dados não mostrados). A adição de AM nas concentrações óptimas estimulou o crescimento de HPSCs por 29 ± 1,8% (p 0,05), HUVEC em 25 ± 3,7% (p 0,05) e MLECs de 33 ± 4,5% (p 0,05). Além disso, a adição do antagonista de AM, AMA (1 uM), reduziu o crescimento basal de HPSCs por 21 ± 5,3% (p 0,05), HUVEC por 21 ± 0,4% (p 0,05) e MLECs em 25 ± 5,1% ( p 0,05) que suporta ainda um papel autócrino de AM nestas células. Continuar a analisar os efeitos da AM e realizamos

in vitro

ensaios de angiogênese. AM estimulada a formação de polígono em HUVECs (Fig. 1F) e em MLECs (Fig. 1G) às 6 horas em comparação com culturas de controlo, e AMA bloqueou os efeitos mediados AM de formação do polígono.

(A) RT-PCR que mostra a expressão de AM, ADMR, e CRLR em HPSC, HUVEC e MLECs. ensaio (B) ELISA mostrando a secreção de AM de HPSC, HUVEC e células MLEC. meio isento de soro que banham-se estas células foram recolhidas e concentradas e ensaiadas para a presença de AM. Níveis foram calculados de acordo com as instruções do fabricante. (C) HPSC, (D) HUVEC, ou (E) células MLEC (1000 células) foram semeadas em placas de 96 poços e AM (50 nM para HPSC e 200 nM para a HUVEC e MLEC) ou AMA (1 uM) foram adicionados para as placas diariamente e o número de células foi estimado após 48 horas para HPSC e células HUVEC e após 96 horas para MLECs por ensaio MTS. Quando comparado com o grupo de controlo WT, AM, estimulou a proliferação de todos os três tipos de células. Da mesma forma, o tratamento AMA inibiu a proliferação basal de todas as células. Os dados apresentados são médias +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

ensaios de angiogénese foram conduzidos com HUVEC (F) e (G) As células MLEC. As células foram plaqueadas sobre matriz de CE, juntamente com AM (200 nM) sozinha ou em combinação com AMA (1 uM). Depois de 6 horas a formação do tubo foi avaliado microscopicamente conforme instruções do fabricante. São mostrados micrografias representativas. AM consistentemente estimulado HUVEC e células MLEC para formar tubos, enquanto AMA reverteu os efeitos da AM.

Os efeitos do AM em células HPSC, HUVEC e MLEC são mediados pelo receptor ADMR

Há dois potenciais receptores que respondem a SOU, ADMR e CRLR. Nós relatado anteriormente que as células cancerosas pancreáticas humanas expressam exclusivamente ADMR enquanto as células HPSC e HUVEC expressa tanto SOU receptores [3]. No presente estudo, observou-se que MLECs também expressam ambos os receptores. Para determinar a importância relativa destes receptores que eles silenciados independentemente nestas três linhas de células usando técnicas de ARNip. A transfecção com siRNA reduziu significativamente os níveis de qualquer um ou ADMR CRLR em HPSC (Fig. 2A), HUVEC (Fig. 2B) e MLECs (Fig. 2C) como comparado com o controlo ARNsi. HPSC, HUVEC e MLECs silenciados com siRNA para qualquer ADMR ou CRLR foram examinados em ensaios de crescimento, onde o número de células foram estimadas usando o método MTS. O silenciamento de ADMR, mas não CRLR, reduziu significativamente o crescimento de todos estes tipos de células. O silenciamento de ADMR reduziu o crescimento de HPSC por 21 ± 3,4% (p 0,05) (Fig. 2D), HUVEC por 24 ± 1,8% (p 0,05) (Fig. 2E) e MLECs por 26 ± 4,3% (p 0,05) (Fig. 2F). Silenciamento de ADMR em HUVECs (Fig. 2G) e MLECs (Fig. 2H) completamente abolida SOU mediada formação do tubo, ao mesmo tempo silencia de CRLR formação do tubo parcialmente reduzida. Estes dados sugerem que colectivamente os efeitos autócrinos de AM em células HPSC, HUVEC e MLEC são mediadas principalmente através do receptor de ADMR embora CRLR também pode ter alguns efeitos.

(A) HPSC e (B) células HUVEC foram transientemente transfectadas com ARNsi humanos e células (C) MLEC foram transfectadas com ARNsi de ratinho (siControl, siADMR, ou siCRLR). Após 72 horas as células foram colhidas e a proteína ou o ARN foi extraído. Western blotting utilizando anticorpos humanos mostra o grau de silenciamento de ADMR humano CRLR e em HPSC e células HUVEC, e RT-PCR utilizando iniciadores de rato mostra os efeitos de rato e siADMR siCRLR em MLECs. p-actina serviu como um controlo de carga para transferência de Western e os iniciadores 18S serviu como um controlo de carga para RT-PCR. geles de comprimento total são apresentados na Figura S1. Os efeitos sobre a proliferação de siRNA silenciamento mediado de receptores são mostrados em células MLEC (D) HPSC, (E) HUVEC, e (f). As células foram transfectadas com os respectivos siRNAs humana ou de ratinho (siControl, siADMR, ou siCRLR) durante 24 horas, em seguida, a proliferação foi estimada pelo ensaio de MTS após um período adicional de 48 horas para HPSC e as células HUVEC e 96 horas para MLECs. O silenciamento de ADMR mas não CRLR causou uma redução significativa da proliferação destas células. Os dados apresentados são médias +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

ensaio de angiogénese com (G) HUVEC e (h) células MLEC. As células foram plaqueadas sobre gel de matriz de 24 horas após a transfecção com os seus respectivos siRNAs humana ou de ratinho (siControl, siADMR, ou siCRLR). As células foram então tratadas com AM (200 nM) durante 6 horas e examinadas microscopicamente. A extensão da formação do tubo foi avaliada de acordo com as instruções do fabricante. micrografias representativas são mostrados. ADMR silenciar a formação do tubo completamente bloqueada, enquanto CRLR silenciar a formação do tubo apenas parcialmente reduzida.

O silenciamento de ADMR em células de câncer de pâncreas reduziu o crescimento de tumores e metástases

in vivo

Para examinar os efeitos da ADMR silenciar sobre as células cancerosas, observou-se o crescimento de tumores ortotópicos formadas a partir de duas linhas celulares de cancro pancreático diferentes transfectadas com shADMR ou shControl. Os volumes dos tumores foram medidos após 4 semanas de imagem de bioluminescência. O volume tumoral foi reduzido em 92 ± 0,5% no ADMR silenciados MPanc96 tumores quando comparados com tumores de controlo vector rolamento (p 0,05) (Fig. 3A). Da mesma forma, o volume do tumor BxPC3 foi significativamente reduzida em 83 ± 0,6% após ADMR silenciamentos em comparação com tumores de controlo (P 0,05) (Fig 3B.). Em ambos os casos, houve também uma redução na metástase do pulmão e do fígado e uma redução na disseminação peritoneal. No entanto, porque ADMR silenciamento reduziu o volume do tumor; qualquer redução na metástase pode ter sido devido à redução geral do volume do tumor.

tumores ortotópicos foram desenvolvidos com MPanc96 (A) ou BxPC3 (B) células silenciados estavelmente com shADMR e expressando o gene da luciferase. Após 4 semanas, o volume do tumor foi estimado pela imagem de bioluminescência e mostraram uma redução significativa entre ADMR vector e portadores de tumores shControl de ambos os tipos de células. Os dados apresentados são médias +/- SEM para 10 animais por grupo. (* P 0,05) imagens bioluminescência de ratos representativos também são fornecidos

O silenciamento de ADMR em células de câncer de pâncreas reduzida metástase

in vivo

Para avaliar diretamente. o papel da ADMR no pulmão câncer de pâncreas e metástase hepática, realizamos estudos separados em

camundongos

nus pela veia da cauda e injeção do baço, respectivamente. silenciamento ADMR reduziu a incidência de metástases do pulmão (ShControl – 67% vs ShADMR – 22%) tal como medido por imagem de bioluminescência (Fig. 4A). Além disso, a presença de metástases detectáveis ​​utilizando imagem de bioluminescência foi adiada a partir do 2

nd semana em animais de controlo a 5

th semana em células portadoras shADMR. pulmões excisados ​​após fixação em solução de Bouin mostrou uma redução no número de focos metastáticos do pulmão, como mostrado na imagem representativa (Fig. 4C). Os efeitos de silenciamento ADMR nas metástases do fígado foram semelhantes aos de metástases do pulmão. silenciamento ADMR reduziu a incidência de metástases do fígado (ShControl – 100% Vs ShADMR – 43%) (Figura 4B.). A presença de metástases detectáveis ​​foi adiada a partir do 2

nd semana até o 5

th semana. A redução do número de focos metastáticos do fígado é mostrado como uma imagem representativa (Fig. 4D). Estes dados indicam que AM pode actuar como um indutor de metástases de células de cancro do pâncreas e estes efeitos de AM em células cancerosas são mediados através do receptor de ADMR.

MPanc96 células portadoras do gene da luciferase estavelmente transfectadas com células shControl ou shADMR foram injectados na veia da cauda para medir a metástase do pulmão e para o baço para medir a metástase do fígado. Os animais portadores de células ADMR silenciada mostraram uma redução na incidência de pulmão (A) e metástases do fígado (B) tal como medido por imagem de bioluminescência. Após 6 semanas os ratinhos foram sacrificados e os pulmões e fígado também foram excisadas e examinadas grosseiramente e histologicamente. silenciamento estável de ADMR reduziu o número de focos metastáticos no pulmão e no fígado, quando comparado a shControl. imagens representativas mostram a redução do número de focos metastáticos nos pulmões (C) e fígado (D).

I

n vivo

alvo de ADMR usando a entrega sistémica de siRNAs é altamente eficaz a reduzir o crescimento do tumor

os nossos dados suportam um papel para ADMR nos efeitos do AM em células de câncer de pâncreas.