Abstract

receptor de quimiocinas CC 7 (CCR7) contribui para a sobrevivência de certas células de câncer linhas, mas o seu papel na proliferação de células humanas do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) permanece vaga. Os ensaios de proliferação realizados em células A549 e H460 NSCLC utilizando células de contagem Kit-8 indicaram que a activação de CCR7 pelo seu ligando específico, ligando quimiocina exógena 21 (CCL21), foi associado com um aumento linear significativa na proliferação celular, com a duração de exposição a CCL21. A interacção CCL21 /CCR7 aumentou significativamente a fracção de células em G

2 /H de fase do ciclo celular como medido por citometria de fluxo. Em contraste, CCL21 /CCR7 não teve influência significativa no

0 /G

1 e S fases G. Western blot e PCR em tempo real indicaram que CCL21 /CCR7 upregulated significativamente a expressão de ciclina A, ciclina B1, e cinase 1 (CDK1) dependente de ciclina, que estão relacionados com o G

2 /H de transição de fase. A expressão de ciclina D1 e ciclina E, que estão relacionados com o G

0 /L

1 e G

1 /S transições, não foi alterada. A interacção CCL21 /CCR7 melhorado significativamente a fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK-P), mas não Akt, tal como medido através de Western blot. LY294002, um inibidor selectivo de PI3K que previne a activação de Akt a jusante, não enfraquecer o efeito de CCL21 /CCR7 na P-ERK. Coimmunoprecipitation confirmaram ainda que havia uma interacção entre P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1, particularmente na presença de CCL21. CCR7 pequeno ARN interferente ou PD98059, um inibidor selectivo de MEK que interrompe a activação de ERK jusante, aboliu significativamente os efeitos da CCL21 exógeno. Estes resultados sugerem que CCL21 /CCR7 contribui para a proliferação dependente do tempo de células NSCLC humanas por regulação positiva de ciclina A, ciclina B1, e CDK1 potencialmente através da via de ERK

citação:. Xu Y, Liu G, X Qiu , Jiang G, Huang B, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7 Promove G

2 /M fase de progressão através da ERK Pathway in Human Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (6): e21119. doi: 10.1371 /journal.pone.0021119

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de maio de 2011; Aceito: 19 de maio de 2011; Publicado: 16 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30.972.967) e Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Educação Superior da China (No. 20092104110018). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

receptor de quimiocina CC 7 (CCR7) é expressa em todas as células-T ingénuas e em algumas células T de memória, células B e células dendríticas maduras [1]. Após a interacção com os seus ligandos, ligando de quimiocina 19 (CCL19) ou ligando de quimiocina 21 (CCL21) [2], CCR7 contribui para linfócitos e tráfico homing para os gânglios linfáticos, durante as reacções imunitárias e inflamatórias [3] – [5]. CCR7 é altamente expressa em câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), câncer de mama e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço e é responsável por mediar a metástase em certas linhas de células cancerosas [6] – [15]. Até à data, o papel de CCR7 na proliferação de células NSCLC humanas não foi elucidado.

Activação de CCR7 pode aumentar a fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK-P) ou Akt (P-Akt) através proteínas Gi para aumentar a proliferação celular ou sobrevivência [16] – [20]. ERK pertence à família da cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK), que também inclui quinase c-Jun N-terminal (JNK) e p38. A cascata da ERK, activado por estímulos mitogénicos, é crítico para a proliferação e sobrevivência [21], [22] e é necessária para a progressão normal em mitose [23], [24]. As vias JNK e p38 são ativados em resposta a produtos químicos e estresse ambiental [25] – [27]. Akt (também conhecido como Akt1), um mediador de sobrevivência celular induzida por factor de crescimento [28] -. [30], pode promover a proliferação celular através da fosforilação [31]

O objectivo deste estudo foi examinar a efeito e mecanismo de regulação da interacção CCL21 /CCR7 na proliferação de A549 e NCI-H460 (H460) células NSCLC humanas. Aqui, demonstramos que CCL21 /CCR7 contribuiu para a proliferação dependente do tempo de células NSCLC humanas por hiperregular a expressão de ciclina A, ciclina B1, e CDK1 através da via de ERK. Informação obtida a partir deste estudo empresta insight para os mecanismos de sobrevivência das células cancerosas mediada por CCR7 e tem implicações para as metas de tratamento em NSCLC.

Resultados

CCL21 /CCR7 promove a proliferação de células A549 e H460 . Em um estudo anterior, identificou-se um nível de expressão CCR7 maior em A549 e linhas de células NSCLC humana H460 comparação com outras linhas de células [32]. Para investigar o papel de CCR7 no funcionamento de células A549 e H460, activação e inibição CCR7 foram induzidas com CCL21 exógeno e CCR7 com pequeno ARN interferente (siRNA), respectivamente. Após a transfecção com CCR7 siRNA (siCCR7) ou ARNsi de controlo, a expressão de CCR7 foi avaliada utilizando Western blot e transcriptase inversa (RT) -PCR. Descobrimos que siCCR7 regulada negativamente de forma significativa os níveis de proteína e ARNm de CCR7, em comparação com ARNsi de controlo (Figura 1).

A549 (A) e células H460 (B) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi CCR7 (siCCR7) . Após a transfecção, a expressão da proteína de CCR7 (um) e ARNm (b) foi avaliada utilizando Western blot (um) e RT-PCR (b), e em comparação com as células não transfectadas A549 ou H460. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P . 0,05, em comparação com células de controlo

Para determinar o efeito de CCL21 /CCR7 na proliferação de células, o ensaio CCK-8 foi realizada em células A549 e H460. De acordo com os dados publicados [33], [34] e os resultados da nossa experiência preliminar, a 100 ng /concentrações mL CCL21 promoveu significativamente a proliferação de células, em comparação com as concentrações de 50 ng /mL, ao passo que não houve diferença significativa entre 100 ng /ml e 200 ng /ml concentrações (Figura 2). Portanto, a 100 ng /ml concentrações CCL21 foi utilizado no seguinte experiência. A interacção CCL21 /CCR7 promoveu significativamente a proliferação de células, enquanto que siCCR7 revogada significativamente a acção de CCL21 (Figura 3). siCCR7 sozinho não teve qualquer efeito significativo na proliferação de células, em comparação com células de controlo. Foram observadas diferenças significativas entre todos os pontos de tempo examinados (todos p 0,01), indicando um aumento linear na proliferação com o aumento do tempo de exposição ao CCL21 (todos p 0,01).

A549 (A) e H460 (B) as células foram tratadas com CCL21 (50, 100 ou 200 ng /mL) durante 24, 48, ou 72 h, e a vitalidade das células foi estimado usando o ensaio CCK-8. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. ** P . 0,01, em comparação com as células tratadas com CCL21 (50 ng /mL)

A549 (A) e células H460 (B) foram tratadas com CCL21 (100 ng /mL) durante 24 , 48 ou 72 h, e vitalidade celular foi estimada utilizando o ensaio de CCK-8. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. ** P . 0,01, em comparação com células de controlo

CCL21 /CCR7 aumenta a proporção de células em G

2 /M. Para verificar se a acção de CCL21 /CCR7 sobre a proliferação de células A549 e H460 está associada com uma alteração na distribuição do ciclo celular, análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. A interação CCL21 /CCR7 aumentou significativamente a proporção de células no G

2 /M fase, enquanto não houve efeito significativo dessa interação na proporção de células em G

0 /G

1 ou o fase S, em comparação com células de controlo (Tabela 1). siCCR7 abolida significativamente este efeito de CCL21, enquanto siCCR7 sozinho não teve efeito significativo sobre a distribuição do ciclo celular.

CCL21 /CCR7 regula positivamente a expressão de ciclina A, ciclina B1, e CDK1. Para determinar o possível mecanismo através do qual CCL21 /CCR7 influencia o G 2 /M distribuição

fase em células A549 e H460, a expressão de ciclinas e quinases dependentes de ciclina 1 (CDK1) foi avaliada utilizando Western blot e PCR em tempo real . Em comparação com células de controlo, a interacção CCL21 /CCR7 regulada positivamente de forma significativa a proteína e os níveis de mRNA de ciclina A, ciclina B1, e CDK1, que estão relacionados a G

2 /H progressão de fase (Figura 4). siCCR7 revogada significativamente os efeitos da CCL21, ao passo que siCCR7 sozinho não teve qualquer efeito significativo sobre a ciclina CDK1 ou expressão. CCL21 não teve efeito significativo sobre os níveis de ciclina D1 ou ciclina E, que estão relacionados a G

0 /G

1 eo G

1 /S transição.

A549 (A ) e células H460 (b) foram tratadas com CCL21 (100 ng /mL) durante 24 h, e a proteína de (a) e ARNm (b) os níveis de ciclinas a, B1, D1 e e e de CDK1 foram estimados usando Ocidental blot (a) e PCR em tempo real (b). Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 ou ** p . 0,01, em comparação com células de controlo

CCL21 /CCR7 regula positivamente a expressão de P-ERK, mas não P-Akt. Outros relataram que CCR7 pode aumentar a fosforilação de ERK, JNK, ou Akt, que estão relacionados com a sobrevivência celular [16] – [20], [33], [35] – [42]. Para verificar se a interacção CCL21 /CCR7 pode também aumentar a expressão de membros da família de MAPK e AKT em células A549 e H460, a expressão destes componentes foi avaliada por meio de Western blot. A interacção CCL21 /CCR7 regulada positivamente de forma significativa a expressão de P-ERK às 24 h e 48 h, ao passo que não houve nenhum impacto significativo sobre a expressão de ERK (Figura 5). CCL21 /CCR7 não teve influência significativa sobre a expressão ou a fosforilação de JNK, p38, ou Akt. Porque Akt é, possivelmente, a montante da ERK [43], as células A549 e H460 foram tratados com CCL21 durante 24 h, depois a 1 h de exposição para o LY294002, um inibidor selectivo de PI3K que inibe a activação da via de Akt a jusante. Seguindo este tratamento, CCL21 /CCR7 ainda significativamente regulada positivamente a expressão de P-ERK (Figura 6).

células H460 (B) A549 (A) e foram tratados com CCL21 (100 ng /mL) durante 12, 24, ou 48 horas, e (P-) níveis normais de expressão e fosforilados foram estimadas por transferência de Western. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 ou ** p . 0,01, em comparação com células de controlo

A549 (A) e células H460 (B) foram tratadas com CCL21 (100 ng /mL) durante 24 h depois de LY294002 , um inibidor selectivo de PI3K que consequentemente previne a activação de Akt a jusante, foi aplicado durante 1 h. A expressão de P-ERK foi estimada utilizando Western blot. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. ** P . 0,01, em comparação com células de controlo

A inibição da P-ERK abole os efeitos impellent de CCL21 /CCR7 na proliferação e G

2 /M progressão fase. Para verificar se PD98059, um inibidor selectivo de MEK que interrompe a activação de ERK a jusante, pode suprimir os efeitos da CCL21 /CCR7 na proliferação e G 2 /M progressão

de fase de células A549 e H460, a viabilidade celular e a distribuição do ciclo celular Os ensaios foram realizados usando o CCK-8 e citometria de fluxo, respectivamente. PD98059 revogada significativamente os efeitos da CCL21 /CCR7 sobre a proliferação celular e a progressão 2 L

/H de fase (Figura 7 e Tabela 2, respectivamente). PD98059 também aboliu a influência de CCL21 /CCR7 sobre a expressão da P-ERK, ciclina A, ciclina B1, e CDK1 (Figura 8). Além disso, PD98059 sozinho tinha um efeito inibidor significativo sobre a proliferação celular, o G

2 /H progressão de fases e a expressão de P-ERK, a ciclina A e ciclina B1 (Figura 7, Tabela 2, e Figura 8, respectivamente).

A549 (a) e células H460 (B) foram tratadas com CCL21 (100 ng /mL) durante 24, 48, ou 72 h após a PD98059, um inibidor selectivo de MEK que interrompe a activação de jusante ERK, foi aplicado durante 1 h. vitalidade celular foi estimada utilizando o ensaio CCK-8. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 ou ** p . 0,01, em comparação com células de controlo

A549 (A) e células H460 (B) foram tratadas com CCL21 (100 ng /mL) durante 24 h depois de PD98059 , um inibidor selectivo de MEK que interrompe a activação de ERK a jusante, foi aplicado durante 1 h. Os níveis de expressão destes componentes foram estimados utilizando Western blot. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05 ou ** p . 0,01, em comparação com células de controlo

P-ERK, induzida por CCL21 /CCR7, interage com ciclina A, ciclina B1, e CDK1. Para melhor identificar se existe uma interacção entre a P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1, foi realizada coimmunoprecipitation. A549 e H460 células na ausência ou na presença de CCL21 durante 24 horas foram sujeitas a imunoprecipi tacão com anticorpos contra a P-ERK ou IgG, seguido por transferência de Western para a ciclina A, ciclina B1, e CDK1. Observou-se, a interacção específica entre P pronunciada-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1, especialmente quando as células foram tratadas com CCL21 durante 24 h (Figura 9a). imunoprecipitação recíproca com os anticorpos contra a ciclina A, ciclina B1, CDK1, ou IgG foi determinada por Western blotting para P-ERK, e mais uma vez, a interacção entre P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1 foi saliente, especialmente na presença de CCL21 (Figura 9b). A549 e H460 células na ausência ou na presença de PD98059, durante 1 h foram sujeitas a imunoprecipi tacão com anticorpos contra a P-ERK ou IgG, seguido por transferência de Western para a ciclina A, ciclina B1, e CDK1. A interacção entre a P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1 foi enfraquecido em resposta à exposição PD98059 (Figura 9c).

A549 (A) e H460 (B) células na ausência ou na presença de CCL21 (100 ng /mL) durante 24 h foram sujeitas a imunoprecipi tacão com anticorpos contra a P-ERK ou IgG, seguido por transferência de Western para a ciclina a, ciclina B1, e CDK1 (a). recíproco imunoprecipitação com anticorpos contra a ciclina A, ciclina B1, CDK1, ou IgG foram analisados ​​por transferência de Western para o P-ERK (b). A549 e H460 células na ausência ou na presença de PD98059, durante 1 hora foram sujeitos a imunoprecipitação com o P-ERK ou anticorpos IgG, seguido por transferência de Western para a ciclina A, ciclina B1, e CDK1 (c).

Discussão

Vários estudos documentaram que a activação de CCR7 é responsável pela mediação da sobrevivência de certas linhas de células de cancro através da promoção de migração e proliferação ou através da inibição da apoptose [33], [35] – [42]. No entanto, o papel de CCR7 na proliferação de células NSCLC humanas não tem sido bem documentada. No presente estudo, confirmou-se que a interacção CCL21 /CCR7 pode aumentar significativamente a proliferação de células NSCLC humanas de um modo dependente do tempo, que envolve a sobre-regulação da ciclina A, ciclina B1, e CDK1, possivelmente através da ERK, mas não a Akt, via.

de acordo com estudos anteriores usando diferentes modelos de células [16], [37], [40], a activação de CCR7 com CCL21 promoveu a proliferação de células. Em contraste com os nossos dados actuais, de um estudo anterior sugeriu que CCL21 murina teve nenhuma acção significativa sobre a proliferação de células A549 [44]. Uma possível explicação para a diferença seria que CCL21 rato pode interagir com o CXCR3, mas não CCR7, enquanto CCL21 humana pode ligar CCR7 mas não CXCR3 [45]. Isto sugere que a activação de CXCR3 não afecta a proliferação de células A549

Tradicionalmente, o ciclo celular é segregado em quatro fases:. A replicação do ADN ocorre durante a fase S, e cromossoma segregação ocorre durante a fase M. As fases S e M são separados por as chamadas fases Gap, G1 (antes da replicação de ADN) e G2 (antes da mitose). Nós demonstramos que /CCR7 significativamente alterada a distribuição do ciclo celular CCL21 tal que mais células povoaram a G

2 /M fase. Não foram observadas diferenças significativas em relação à distribuição de células no G

0 /G

1 e fases S.

O ciclo celular é regulada por ciclinas e CDKs. ciclinas do tipo D são consideradas como reguladores chave de G

1 progressão [46]. Ciclina E é necessária para o G

1 /S transição [47], [48] e ciclina A é essencial para a progressão através da fase S [49], [50]. Tanto a ciclina A e os de tipo B ciclinas associar com CDK1 para promover a entrada na mitose [51], [52]. Neste estudo, ambas as proteínas e os níveis de mRNA de ciclina A, ciclina B1, e CDK1 foram significativamente regulada positivamente quando as células foram tratadas com CCL21 durante 24 h. Isto indica que CCL21 /CCR7 acelera a progressão L

2 /H de fase para promover a proliferação celular. Não houve diferenças significativas em ciclina D1 ou níveis de expressão de ciclina E foram medidos, indicando que CCL21 /CCR7 não tem efeito significativo sobre a G

0 /G

1 fase ou o G transição

1 /S. Esta constatação demonstra pela primeira vez que CCL21 /CCR7 tem um efeito impellent na progressão do ciclo celular que envolve o G

2 /H de fase.

Vários estudos que utilizam outros tipos de células indicaram que a activação de CCR7 está associada com a sobrevivência celular aumentada através do aumento da fosforilação de ERK, JNK, ou Akt [16] – [20], [33], [35] – [42]. Examinámos se CCL21 /CCR7 pode melhorar a expressão de componentes de MAPK e AKT em células A549 e H460. Os nossos resultados sugerem que CCL21 /CCR7 reforçada a fosforilação de ERK, mas não de JNK, p38, ou Akt. Estes resultados são inconsistentes com relatórios publicados anteriormente que sugeriram um efeito facilitador de CCR7 na Akt, mas não ERK, caminho [16], [19]. Um estudo separado indicou que a AKT é, possivelmente, a montante da ERK [43]. Descobrimos que CCL21 /CCR7 ainda podia regular positivamente de forma significativa a expressão de P-ERK depois as células foram tratadas com LY294002, durante 1 h. Porque LY294002 inibe selectivamente PI3K para evitar a activação a jusante de Akt, os nossos resultados sugerem fortemente que Akt não desempenha um papel crítico na interação entre CCL21 /CCR7 e ERK. Isto está em concordância com um relatório anterior [53]. A razão para estas discrepâncias permanece obscuro.

Desde CCL21 /CCR7 foi capaz de aumentar a expressão de P-ERK, procurou-se determinar se existe uma interação entre P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1. Coimmunoprecipitation e os resultados de imunoprecipitação recíprocas sugerem fortemente a interacção entre P-ERK e ciclina A, ciclina B1, ou CDK1, especialmente na presença de CCL21. Esta interacção pode ser enfraquecida por inibição de ERK com PD98059. Além disso, PD98059 suprimiu o efeito de CCL21 /CCR7 em A549 e a proliferação de células H460 e G

2 /H progressão de fase, bem como regulação negativa da expressão da P-ERK, ciclina A, ciclina B1, e CDK1. Estes resultados demonstram que o efeito de CCL21 /CCR7 sobre a proliferação celular e sobre-regulação da ciclina A, ciclina B1, e CDK1 pode ocorrer através da via de ERK em células NSCLC humanas.

Este estudo sugere que a activação de CCR7 com CCL21 pode promover significativamente a proliferação de células NSCLC de uma forma dependente do tempo, envolvendo a ciclina a, ciclina B1, e CDK1, possivelmente através da ERK, Akt, mas não a, via. Esta informação pode ajudar a esclarecer os mecanismos de sobrevivência da célula cancerosa e identificar potenciais alvos para o tratamento do NSCLC.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

linhas de células A549 e H460 do nosso trabalho publicado anterior [32] foram cultivadas em meio RPMI-1640 ou DMEM-F12 suplementado com soro a 10% HyClone fetal de bovino (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, EUA), numa atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura e colhidos em uma solução de tripsina-EDTA na fase de crescimento logarítmica.

ciclina A, ciclina B1, ciclina D1, ciclina E, CDK1, P-ERK , ERK, JNK-P, JNK, P-p38, p38, P-Akt, Akt, IgG e anticorpos monoclonais de ratinho ou de coelho de p-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). CCL21 humana recombinante foi adquirida a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, EUA). siCCR7 e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Celular Counting Kit-8 (CCK-8) foi comprado de Dojindo Laboratories (Pequim, China). PD98059 e LY294002 foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA) e utilizou-se 50 uM ou 100 uM (concentração final), respectivamente, de acordo com relatórios anteriores [40], [54]. Proteína /G grânulos A foram obtidos a partir de Beyotime (Haimen, China).

tratamento siRNA de células

células A549 e H460 foram semeados em 6 cm

2 pratos de cultura de células e cresceu para 30-50% de confluência antes da transfecção com lipofectamina 2000, como previamente descrito [55]. A eficiência de transfecção foi avaliado por citometria de fluxo. Eficiências de siCCR7 e ARNsi de controlo não silenciamento foram testados utilizando Western blot e RT-PCR. As sequências de siCCR7 e ARNsi de controlo foram: CCR7, 5′-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 ‘e 3′-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5′; controle, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘e 3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’.

actividades de proliferação proliferação celular ensaio

celulares foram examinadas utilizando CCK-8. As células A549 e H460 foram semeadas em placas de 96 poços (1000 células /poço) e tratou-se com CCL21 para 0, 24, 48, ou 72 h. Após o tratamento, a CCK-8 foi adicionado a cada poço de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 4 h a 37 ° C. O valor de densidade óptica (DO) de cada poço foi medido utilizando um leitor de microplacas (Spectra Thermo, Männedorf, Suíça) com um comprimento de onda de teste de 450 nm.

ciclo celular análise

Após o tratamento com CCL21 durante 24 h, as células foram colhidas e lavadas duas vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) e fixadas em etanol a 75% durante 2 h a 4 ° C. As células fixadas foram lavadas duas vezes com 500 ul de PBS frio. As células foram então coradas com 500 ul de solução de iodeto de propídio (PI) a coloração (50 ug /mL de PI, 0,1% de Triton X-100, RNase 200 ug /ml de DNase-livre em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. Dez mil eventos por amostra foram adquiridos utilizando um fluxo FACS-Scan citómetro (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA), e a percentagem de células em G

0 /L

1, S e G

2 /M fases do ciclo celular foram determinados utilizando Modfit LT 3.0 (Becton-Dickinson).

Western blot análise

Após o tratamento com CCL21 durante 24 h, as células foram extraídas com lise tampão (150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 2 ug /mL de aprotinina e 1 mM de PMSF) durante 30 min a 4 ° C. Os extractos foram centrifugados a 12.000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C. Os sobrenadantes contendo proteína total, em seguida, foram colhidas. As aliquotas, cada uma contendo proteína de 50 ug, foram separados por 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF a 55 V (ciclina A, ciclina B1, P-Akt, Akt) ou 40 V (os outros) durante 2,5 h a uma temperatura baixa . As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% durante 2 h, e as proteínas foram detectadas utilizando anticorpos monoclonais em 1:1000 diluição (P-JNK, JNK, P-p38, p38 e β-actina) ou 1:200 (os outros) durante a noite a 4 ° C. As proteínas foram visualizadas utilizando anticorpos anti-ratinho ou anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) ou em 1:6000 1:8000 diluição durante 2 h à temperatura ambiente, respectivamente. Bandas foram fotografadas com um Imaging System EC3 (UVP LLC, Upland, CA, EUA), e o OD foi medida utilizando o ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA). A diferença de OD entre proteínas testadas e β-actina da mesma amostra foi calculado como teor relativo e expressos graficamente.

RT-PCR e PCR em tempo real

O ARN total foi isolado a partir de células usando Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. p-actina foi utilizado como um controlo interno. Para determinar a eficiência de siCCR7 e ARNsi de controlo, semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada em um termociclador L-STORM (GRI Ltd, Byfleet, Reino Unido), utilizando o Kit de PCR TaKaRa ARN (AMV) Ver.3.0 (Takara, Dalian, China). Os iniciadores de PCR foram como se segue: CCR7 F: 5′-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 ‘, R: 5′-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3’. O comprimento CCR7 amplicon era 305 pb. β-actina F: 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 ‘, R: 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’. O comprimento do fragmento amplificado β-actina era 513 pb. As condições dos ciclos térmicos foram as seguintes: 30 ciclos de 40 s cada, incluindo desnaturação a 95 ° C, hibridação a 53 ° C, e extensão a 72 ° C

-PCR em tempo real foi realizada num ABI. Prism 7900HT sistema rápido (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA), utilizando SYBR Premix Ex Taq II (Takara). As amplificações foram realizadas num volume total de 20 uL e repetido 40 vezes, após a desnaturação inicial (95 ° C durante 30 s) com os seguintes parâmetros: 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s. β-actina F: 5′-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ‘, R: 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3’. O comprimento do fragmento amplificado β-actina foi de 107 pb. Outras sequências de iniciadores foram publicados em outro estudo [56]. A fiabilidade dos resultados da PCR foi apoiada pela análise da curva de dissociação. Os dados de PCR em tempo real foram calculados utilizando a 2

método -ΔΔCT sobre o pacote de software SDS 2.4 (Applied Biosystems) [57].

Coimmunoprecipitation

Após o tratamento com CCL21 por 24 h , as células foram extraídas com tampão de lise (10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl

2, HEPES 10 mM [pH 7,9], PMSF 1 mM, DTT 1 mM) e homogeneizou-se durante 30 min a 4 ° C. Os extractos foram centrifugados a 12.000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C, e os sobrenadantes contendo proteína total foram recolhidas. Quantidades iguais de proteína foram expostos a anticorpos contra a P-ERK, IgG, ciclina A, ciclina B1, ou CDK1, que foram imobilizados em /G grânulos uma proteína. Após 3 h de incubação a 4 ° C com rotação suave, esferas foram extensamente lavadas cinco vezes com tampão de lise, cozidos, e microcentrifugadas. As proteínas foram detectadas com anticorpos contra P-ERK, a ciclina A, ciclina B1, ou CDK1 por Western Blot.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando SPSS 16.0 software. one-way análise de variância (ANOVA) foi utilizada para avaliar as diferenças entre os grupos com vários tratamentos, ea diferença significativa (LSD) teste de menos ou teste de Dunnett T3 foi utilizado para a análise pós-hoc subgrupo. contraste polinomial foi usado para a análise de tendências. Todos os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para p 0,05. Os valores de n vezes a expressão do gene para alterar até 0,5 e 2 abaixo foram tomados como não significativa em conformidade com os valores obtidos a partir de genes de controlo negativo [57], [58].