Abstract

Purpose

cancro do ovário

epitelial tem a maior taxa de mortalidade de todas as doenças malignas ginecológicas. Nós mostramos que a alta expressão RAN correlaciona fortemente com alto grau e pobres sobrevida do paciente em câncer epitelial de ovário. No entanto, como RAN é uma pequena GTPase envolvido em duas principais funções biológicas, transporte nucleo-citoplasmático e mitose, ainda é desconhecido qual destas funções associado com mau prognóstico.

Métodos

Para examinar o valor biomarcador de componentes de rede RAN em câncer epitelial de ovário seroso, a expressão da proteína de seis parceiros RAN específicos foi analisada por imuno-histoquímica utilizando um tissue microarray representando 143 pacientes associados com parâmetros clínicos. O ciclo /GTP PIB RAN foi avaliada pela expressão de RANBP1 e RCC1, a função mitótico por TPX2 e IMPβ, ea função tráfico nucleo-citoplasmático por XPO7, XPOT e IMPβ.

Resultados

com base em análises de Kaplan-Meier, RAN, XPO7 citoplasmática e TPX2 foram significativamente associados com pior sobrevida geral do paciente, e RAN e TPX2 foram associadas com menor sobrevida livre de doença em pacientes com carcinoma seroso de alto grau. A análise de regressão de Cox revelou que RAN e expressão TPX2 foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida livre global e da doença, e que a expressão XPO7 citoplasmática foi um fator prognóstico para a sobrevida global dos pacientes.

Conclusões

Neste estudo sistemático, mostramos que correu e dois de proteína parceiros envolvidos em suas funções nucleo-citoplasmático e mitose (XPO7 e TPX2, respectivamente) podem ser usados ​​como biomarcadores para estratificar pacientes com base no prognóstico. Em particular, nós relatamos pela primeira vez, a relevância clínica do XPO7 exportina e mostraram que a expressão TPX2 teve o mais forte valor prognóstico. Estes resultados sugerem que os parceiros de proteína em cada uma das funções da RAN pode discriminar entre diferentes resultados em pacientes com câncer de alto grau serosa epiteliais ovarianos. Além disso, estas proteínas apontam para processos celulares que pode vir a ser direcionados para melhorar a sobrevivência em câncer epitelial de ovário seroso

Citation:. Cáceres-Gorriti KY, Carmona E, Barrès V, Rahimi K, Létourneau IJ, Tonin PN , et ai. (2014) RAN Nucleo-citoplasmática Transportes e do fuso mitótico Assembleia Partners XPO7 e TPX2 são novos prognósticos Biomarkers em Serous epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (3): e91000. doi: 10.1371 /journal.pone.0091000

editor: Eric Asselin, Universidade de Quebec em Trois-Rivieres, Canadá |

Recebido: 26 de julho de 2013; Aceito: 06 de fevereiro de 2014; Publicação: 13 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cáceres-Gorriti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (MOP # 36056) do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) para a-MM-M, PNT e DP. Tumor bancário foi apoiado pelo Banque de tissus et données do Réseau de recherche sur le câncer de Fond de recherche du Québec – Santé (FRQS), associada ao tumor Canadian Repository Network (CTRNet). KYC-G foi apoiado em parte por studentships do Epstein Fundação Carole eo fundo Canderel do câncer de Institut du de Montréal. IJL foi apoiado por uma concessão do treinamento de pós-doutorado FRQS. A-MM-M e DMP são pesquisadores do Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM) e PNT é um pesquisador do Instituto de Pesquisa do Centro de Saúde da Universidade McGill (MUHC), ambas as quais recebem apoio dos FRQS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) é o mais letal de todas as malignidades ginecológicas na América do Norte [1] e no mundo. Isto é atribuído à natureza assintomática da doença que implica um diagnóstico tardio com uma taxa de sobrevivência de cinco anos em 30% [2], [3]. Ao longo dos últimos 30 anos, os avanços na cirurgia e quimioterapia têm tido pouco impacto na sobrevida geral do paciente [4], [5] e atual tratamento leva à reincidência na maioria dos pacientes. Aproximadamente 80% dos pacientes EOC apresenta uma histotipo serosa [6], [7], que é categorizada de acordo com o grau do tumor e estágio clínico, representando o grau de diferenciação celular e a propagação da doença [8], respectivamente. Evidência molecular suporta uma classificação que separa os doentes com estas carcinomas serosos em dois tipos: os pacientes com tumores de baixo grau (LG, bem diferenciados) e com tumores de alto grau (HG, pouco diferenciados) [9], [10]. Pacientes com tumores serosos LG normalmente têm um bom prognóstico, mas representam 5% de todos os EOCs serosa. Os pacientes com HG carcinoma seroso tem um prognóstico ruim, com sobrevida em cinco anos de menos de 40% [11]. A investigação sobre estas duas doenças distintas, LG e HG EOC serosa, seria, assim, proporcionar uma melhor compreensão da biologia do câncer de ovário e ajudar a melhorar os resultados clínicos. Além disso, a descoberta de biomarcadores discriminar HG pacientes EOC serosa que têm o bom ou mau prognóstico pode contribuir para paciente estratificação terapêutico e pode aumentar a sobrevida global.

Em estudos anteriores, demonstramos que RAN (RAs-proteína relacionada Nuclear), em EOC, é mais expressa como qualidade aumenta tumor e está fortemente associada a menor sobrevida do paciente [12], [13]. funções Portanto, RAN pode ser desregulada em carcinomas do ovário e RAN padrões de expressão pode ser utilizado como uma ferramenta de prognóstico em pacientes com EOC avançada.

In vitro

, a utilização de um ARN de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação expressão RAN impede a proliferação de células EOC, sugerindo funcionou como um potencial alvo terapêutico favorável para o tratamento desta doença [14]. Além disso, diminuindo a expressão RAN no

in vivo

rato experimentos de xenotransplante resultou na prisão do crescimento do tumor EOC [14]. Estas observações indicam que a RAN está envolvida na progressão do cancro do ovário e pode estar implicada na tumorigénese e /ou sobrevivência celular. Estes resultados correlacionam-se bem com estudos semelhantes em diferentes tipos de cancro [15] – [19].

Ao nível celular, RAN executa duas funções principais e distintas. Na interfase, RAN regula o transporte nucleo-citoplasmático de moléculas através do complexo do poro nuclear, [20], [21]. Na mitose, RAN realiza uma função diferente e controla a progressão do ciclo celular através da regulação da formação do fuso mitótico [22]

O ciclo Ran-GTP é regulada por três proteínas.; RCC1, RAN-GAP1 e RANBP1 [23], [24]. trocas RCC1 PIB para GTP, convertendo RAN-PIB para RAN-GTP [23]. Em contraste, RANBP1 trabalho e RAN-GAP1 para aumentar a hidrólise de GTP [24] e, assim repor a piscina ran-PIB [25], [26]. RAN usa o mesmo GTP ciclo /PIB de regulamentar tanto de suas funções fisiológicas. No entanto, o gradiente de GTP /PIB alcançado por estes reguladores é único para cada função da RAN. Para o transporte nuclear, o gradiente é estabelecida através da membrana nuclear de uma distribuição assimétrica das proteínas reguladoras [27]. Durante a mitose, embora nenhuma membrana separa os reguladores, um gradiente é alcançada na proximidade do cromossoma com RCC1 estar ligado a cromossomas [27].

Embora RAN utiliza os mesmos reguladores para a troca de GTP /GDP, que utiliza única proteínas parceiras durante a interfase e mitose para executar diferentes funções fisiológicas (transporte vs. montagem do fuso). Durante a interfase, o enriquecimento de ran-GTP no núcleo é acoplado ao exportinas tais como exportina-T (XPOT) [28], [29] e exportina-7 (XPO7 também denominado RANBP16) [30], [31], que servem como adaptadores, anexando ARNt e proteínas, respectivamente, para permitir a exportação nuclear das suas cargas. Em contraste, RAN-PIB no citoplasma se liga a importinas, tais como importina β (IMPβ) [32], [33], que reconhecem a sequência de localização nuclear (NLS) de proteínas para facilitar o seu movimento através do envelope nuclear. Durante a mitose, Ran-GTP promove porta-veios de uma forma que é independente do transporte nuclear [34]. IMP liga beta e inibe fatores de montagem do fuso, como TPX2 (Segmentação de proteína para Xklp2). Na proximidade de cromossomos, TPX2 é posteriormente liberada facilitando a regulação da organização de microtúbulos ea dinâmica [35].

O objetivo do presente estudo foi investigar qual a função da RAN seria mais relevante implicado em HG serosa malignidade EOC e pobres sobrevida do paciente. Para verificar o impacto de uma função

contra

outro lado, a expressão de parceiros moleculares, específico para nucleo-citoplasmático transporte e mitose, foram analisados ​​por imuno-histoquímica em um tissue microarray de 143 carcinomas serosos compreendendo 131 casos de HG e 12 de tumores LG. Foi avaliada a expressão de proteínas individuais em correlação com os parâmetros clínicos e determinada a sua associação com a progressão e resultado EOC. Resultados promissores foram obtidos por dois parceiros correu, XPO7 e TPX2, com potencial para ser clinicamente relevante para estratificar pacientes EOC serosa HG.

Métodos

Declaração de Ética

O CHUM institucional comitê de ética (comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal) aprovou este estudo e consentimento escrito foi obtido a partir dos doentes antes da coleta da amostra.

pacientes e Tissue espécimes

amostras de tumor foram obtidas a partir de pacientes submetidos à cirurgia de câncer de ovário no Departamento de Oncologia ginecológica – Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CHUM). Um estágio da doença determinado ginecologista-oncologista, tal como definido pela Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO). Um patologista independente avaliação histopatológica e tumor grau. critérios de selecção do tecido para este estudo foram baseadas na confirmação independente da histopatologia serosa em amostras de doentes sem quimioterapia anterior. As amostras foram coletadas entre 1990 e 2006. sobrevida global dos pacientes foi definido como o tempo desde a cirurgia até a morte por câncer de ovário ou último follow-up. sobrevivência livre de doença do paciente foi calculada desde o momento da cirurgia até o primeiro progressão. Portanto, somente pacientes que evoluíram foram incluídos na nossa análise. dados clínicos sobre intervalo livre de progressão foram definidas de acordo com o nível de CA125 sangue e tamanho do tumor avaliada pela imagem. Os doentes que se sabe serem ainda vivo no momento da análise foram censurados no momento do seu último follow-up. As idades de diagnóstico de pacientes com tumores LG variou de 27 a 71 anos (média = 48,5 anos) e eles foram seguidos 50,6 meses em média. As idades dos pacientes com tumores HG variou de 34 a 87 anos (média = 62,6 anos) e sua média de acompanhamento foi de 37,2 meses. A coorte é descrito na Tabela S1.

epitelial seroso do ovário Tumor Tissue Microarray (TMA)

Todos os casos foram revistos por um patologista ginecológico. O grau e tipo de carcinoma dos ovários [9], [10] foram identificados e as áreas de interesse foram marcados em lâminas. Dois núcleos de 1 milímetro para cada amostra de tecido foram dispostas em dois blocos de parafina receptor. Esta matriz de tecido foi composta por núcleos de 12 LG e 131 tumores Hg (2 núcleos por amostra do paciente) do subtipo histopatológico serosa e seis pelotas embebidos em parafina EOC linha celular como controles de coloração (292 núcleos total). A TMA foi então seccionados, corados com hematoxilina-eosina e submetidos a uma outra avaliação da patologia do tecido para verificar a presença de material de tumor em cada núcleo.

Análise Western Blot

A qualidade e especificidade de anticorpos individuais onde verificada por análise de Western blot. extractos de proteína total (30 ug) foram carregadas e submetidas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, em seguida, transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite-PBS (1 hr) e subsequentemente sondadas com anticorpos primários (2 horas à temperatura ambiente) com as diluições óptimas (para 1:500 RAN, XPO7, XPOT e TPX2; 1:200 para IMPβ; 1:300 para RCC1; 1:75 para RANBP1). Cada anticorpo primário foi detectado com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) e visualizado pelo método de quimioluminescência aumentada (ECL) (GE Healthcare, Reino Unido). Beta-actina foi usado como um controle de carga (1:50,000) (Abcam, Cambridge, MA).

imuno-histoquímica (IHQ)

Para o método de coloração manual, o bloco TMA foi seccionado em 4 mm em lâminas SuperFrost + vidro de microscópio (Fisher Scientific Limited, Nepean, oN, Canadá). As lâminas foram aquecidas a 60 ° C durante 15 minutos, desparafinados em xileno, re-hidratadas em um gradiente de etanol, e lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para desmascarar antigénios, as lâminas foram colocadas durante 20 minutos, a alta temperatura sob alta pressão em tampão de citrato (10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) para a coloração com anti-RCC1 (1/50, SC-1161, Santa Cruz tampão Biotechnology Inc.), anti-IMPβ (25/01, SC-1863, Santa Cruz Biotechnology Inc.) e anti-TPX2 (1/100, NBP1-01041, Novus Biologicals), ou em citrato-EDTA (10 mM de sódio citrato, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20, pH 8,0) para coloração com anti-RANBP1 (25/01, SC-1159, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-XPOT (1/50, LS-C80366, Biociências Longevidade Inc.) e anti-XPO7 (1/200, anticorpos LS-C55360, tempo de vida Biosciences Inc.). As lâminas foram então incubadas com 3% de peróxido de hidrogénio em PBS (para bloquear a peroxidase endógena), e lavou-se em PBS. As secções de tecido foram bloqueadas com reagente de bloqueio de uma proteína isenta de soro (DakoCytomation Inc., Mississauga, ON, Canada) durante 15 min à temperatura ambiente e incubados com anticorpo primário durante 60 minutos à temperatura ambiente numa câmara húmida. Substituição do anticorpo primário com PBS serviram como controlo negativo. As lâminas foram em seguida lavadas em PBS, incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Os produtos da reacção foram reveladas utilizando diaminobenzidina (DAB) contendo 0,3% de peróxido de hidrogénio até 5 min. os núcleos das células foram contrastadas com hematoxilina diluída para 1 min.

Para o método de coloração automática, as secções de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina (4 uM) foram coradas utilizando o corante XT BenchMark automático (Ventana Medical System Inc., Tucson , AZ). recuperação de antigénios para RAN foi realizada com uma pilha Condicionado (Ventana Medical System Inc.) durante 30 min. As lâminas foram incubadas com anticorpo anti-RAN (1/100, SC-1156, Santa Cruz Biotechnology Inc.) durante 40 min, e desenvolvido pelo kit de detecção iView DAB (Ventana Medical System Inc.). Hematoxilina e reagente bluing foram utilizados para contracoloração (Ventana Medical System Inc.). TMAs foram observados por microscopia de campo claro e digital fotografada (Aperio ScanScope, Vista, Califórnia, EUA).

Coloração Quantificação

A expressão proteica por IHQ foi pontuada de acordo com a localização subcelular e intensidade da coloração da maligna células. expressão nuclear e citoplasmática das proteínas de rede RAN em tecidos de cancro do ovário foi observada usando varreduras digitalmente imageadas de cada TMA coradas e pontuadas de acordo com a intensidade da coloração. Para cada proteína rede RAN em zonas epiteliais dos núcleos de tumor, a intensidade da coloração de DAB foi definido como 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (moderada coloração) e 3 (coloração forte). Todos TMAs foram analisadas em um estudo cego por dois observadores independentes. correlação Inter-rating (ICC) foi superior a 75% para todos os ensaios. A média de todos os núcleos com cancro a partir do mesmo paciente foi utilizado para a análise. Quando fortes diferenças de pontuação entre os dois observadores ocorreu o núcleo foi reavaliado para chegar a um consenso entre os dois observadores.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS versão 16.0 ( SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) em que p 0,05 foram considerados significativos. padrões de parceiros RAN expressão da proteína foram correlacionados (teste de correlação de Pearson, bicaudal) com a expressão da proteína de RAN e estágio da doença (I a IV). As curvas de sobrevida (sobrevida global ea sobrevida livre de doença) foram plotados pelo estimador de Kaplan-Meier, comparadas pelo teste de log rank e analisadas para diferenças significativas. Para cada parceiro RAN, o número de pacientes em cada curva de sobrevivência foi avaliada na Tabela S2. modelos de risco proporcional uni e multivariada de Cox foram usados ​​para determinar a taxa de risco para cada marcador. análises multivariadas foram feitas usando um modelo de risco com um método de entrar. Um máximo de quatro variáveis ​​independentes foram incluídas no modelo de regressão de Cox multivariada para evitar o excesso de montagem.

Resultados

Expressão da RAN e sua rede de parceiros Proteínas em Serous EOC tecidos

Para determinar se algum dos sócios da RAN estão implicados na biologia da EOC, foi realizada uma análise IHC utilizando uma TMA contendo um total de 286 núcleos de amostras de cancro representando 143 pacientes. RAN e as seis proteínas RAN-parceiros (RANBP1, RCC1, IMPβ, XPO7, XPOT e TPX2), foram analisados ​​usando essa matriz de tecido. A especificidade de cada anticorpo foi avaliada primeiro por análise de transferência de Western utilizando extractos celulares de quatro linhas celulares de EOC (Figura S1) e por IHC utilizando sedimentos de células embebidas em parafina a partir das mesmas linhas celulares (Figura S2). A intensidade e localização da coloração foram então avaliados através de exames digitalmente fotografados de cada TMA manchada. expressão citoplasmática de proteínas rede RAN em tecidos EOC nuclear e foram observados e classificados de acordo com a intensidade média de coloração um preço tão baixo (escores 1), médio (pontuação = 1 2) e alto (escores ≥2) (Figura 1) , exceto para TPX2, que foi classificada como ausente (escore = 0) ou presente (pontuações 0)., por causa do padrão de coloração única desta proteína (Figuras 1-2)

imagens representativas de immunoperoxydase padrão de coloração num núcleo TMA são mostrados para cada grau do tumor e proteínas (ampliação de 20 x). Quantificação da RAN (A-B), RANBP1 (C-D) e IMPβ (L-H) foi exclusivamente para a coloração citoplasmática. RCC1 (E-F) e TPX2 (M-N) foram exclusivamente localizada para o núcleo. XPO7 (I-J) e XPOT (K-G) foram quantificadas por tanto a sua expressão nuclear e citoplasmática.

para cada proteína, a intensidade da coloração foi definido como 0 (sem coloração), 1 ( coloração fraca), 2 (moderada coloração) ou 3 (coloração escura) dentro do compartimento epitelial por dois observadores independentes. A média da intensidade de coloração para cada proteína foi comparada entre o baixo grau (barras brancas) e tumores de alto grau (barras cinzentas), utilizando um teste de Student. * P 0,05 ** p≤0.005

A expressão de RANBP1 (PIB) e RCC1 (GTP), que são proteínas gerais relacionados com o ciclo Ran-GTP, foram inicialmente investigados.. IMPβ expressão foi analisada para avaliar concomitantemente tanto das duas funções principais de RAN. Então nós especificamente explorado a função nucleo-citoplasmático da RAN, avaliando a expressão de dois exportinas: XPO7 e XPOT. Finalmente, examinamos a expressão TPX2, a fim de avaliar a montagem do fuso durante a mitose, outra função importante da RAN. A Figura 1 mostra imagens representativas para a coloração de cada proteína em HG carcinomas do ovário serosas. Expressão de RAN (Figura 1A-C), RANBP1 (Figura 1D-F) e IMPβ (Figura 1J-L) foram localizados tanto para o citoplasma e o núcleo, apesar de sinal de quantificação focada exclusivamente no citoplasma com base na sua expressão mais elevada nesta compartimento celular. Expressão de RCC1 (Figura 1G-I) e TPX2 (Figura 1A-Z) foram nuclear. coloração nuclear e citoplasmática foi observada para XPO7 (Figura 1 M-R) e XPOT (Figura 1 S-X) proteínas, e ambos foram quantificados.

RAN Proteínas de rede são correlacionados com tumor grau

Tendo estabelecido o padrão de coloração para cada uma das proteínas de rede RAN, que, em seguida, avaliou a intensidade de coloração de acordo com o grau do tumor (Figura 2). Em um estudo anterior, informou a observação de que RAN coloração foi positivamente associado com o aumento do grau do tumor em EOC serosa [13]. No presente estudo, usando uma coorte enriquecido paciente, que corroboram ainda mais a nossa descoberta inicial que mostra que os níveis de RAN citoplasmática foram significativamente mais elevados em tumores em comparação com tumores HG LG (p 0,001) (Figura 2A). A intensidade da coloração citoplasmática de RANBP1 (p 0,001), IMPβ (p = 0,048), e a localização nuclear de RCC1 (p = 0,004) foram significativamente maiores no HG contra tumores LG (Figura 2B-D). Para as proteínas de rede RAN nucleo-citoplasmático, XPO7 nuclear foi significativamente menos expresso em HG que LG tumores (p = 0,005), enquanto não foram observadas diferenças significativas para a coloração XPO7 citoplasmática ou para a coloração nuclear /citoplasmático XPOT (Figura 2E-2H). Curiosamente, ao contrário de todas as outras proteínas de rede RAN investigado, para a coloração TPX2 parceiro RAN mitótico foi encontrada exclusivamente dentro dos núcleos de Hg carcinomas serosos (p 0,001) (Figura 2I). A sua expressão foi dicotomizados como positiva ou ausente devido ao padrão de coloração única desta proteína em tumores de doentes. Nossos resultados sugerem que a desregulação da rede RAN é característica de HG EOC serosa e, portanto, está em linha com a noção recente que HG e LG serosa EOC são entidades distintas de doenças [9], [10].

próxima verificou a associação entre a expressão de RAN e cada um dos parceiros da rede RAN utilizando o teste de correlação de Pearson (bicaudal) (Tabela 1). Como esperado, as proteínas envolvidas no GTP-ciclo e IMPβ, foram positivamente correlacionados com RAN (RANBP1, p 0,001; RCC1, p = 0,026; IMPβ, p 0,001), o que sugere um ciclo RAN GTPase competente (Tabela 1). Para o papel nucleo-citoplasmático da RAN, uma correlação positiva significativa foi encontrada para XPO7 citoplasmático (p = 0,028), bem como a expressão XPOT nuclear (p = 0,050) (Tabela 1). No entanto, não foi observada correlação entre as intensidades de coloração de RAN e TPX2, o que poderia ser explicado pela natureza indireta de sua interação na mitose [35].

A associação entre a expressão da RAN ou qualquer dos parceiros da rede RAN com o estágio da doença também foi investigado usando o teste de correlação de Pearson (bicaudal) (Tabela 1). Foi observada uma correlação significativa apenas para a coloração RANBP1 (p = 0,034), mostrando uma ligeira associação negativa (coeficiente de Pearson = -0,181) (Tabela 1).

RAN, XPO7 e TPX2 são associados com má sobrevida do paciente

Foi investigada a relação entre a expressão de proteínas parceiras RAN e sobrevida global na coorte de 143 pacientes. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram obtidas e comparadas pelo teste de log-rank apenas para casos HG (Figura 3, Tabelas S2-S3). casos LG não foram incluídos devido ao baixo número de pacientes, refletindo a raridade desta doença, e por causa de suas características de doenças distintas, em comparação com os casos HG. Um valor limiar não podia ser obtido por curvas ROC análises, e para evitar a tendência na selecção de um ponto de corte para cada uma das proteínas, todas as pontuações de coloração (agrupados como se mostra na Figura 1) foram tomados em consideração na determinação das curvas de Kaplan-Meier para cada proteína.

a expressão de proteínas de rede RAN foi avaliada como indicadores prognósticos em apenas os carcinomas serosos de alta qualidade por meio de análise de Kaplan-Meier. A sobrevivência foi definido como o tempo desde a cirurgia à morte do cancro do ovário ou último seguimento. O teste de log-rank foi utilizado para definir diferença estatística entre os grupos. Para os painéis A-H, baixa coloração (linha azul) definida por valores 1, coloração média (linha verde) definida por = 1 2 e alta coloração (linha rosa) definido como ≥2. Para o painel I, as amostras são classificados como negativos (linha preta) ou (linha cinza) positiva para a coloração TPX2. Em A-I, p denota significância entre todos os grupos. Para os painéis J-K, de coloração TPX2 negativo com baixa intensidade de coloração da RAN (J-preta de linha) ou XPO7 (K – linha preta); coloração TPX2 negativa com alta coloração da RAN médio + (J – line ciano) ou XPO7 (K – linha violeta); coloração TPX2 positiva com alta coloração da RAN (J – linha cinza) médio + ou XPO7 (K – linha cinza). Em J-K, p (canto superior direito) é calculado para negro contra ciano (RAN, painel J) ou violeta (XPO7, painel K). Em J-K, p (canto inferior esquerdo) é calculado para cinza contra ciano (RAN, painel J) ou violeta (XPO7, painel K). A-K, p 0,05 são indicadas em negrito

níveis crescentes de coloração RAN citoplasmática no HG serosa EOC foi significativamente associada com uma pior sobrevida global (p = 0,016;. Figura 3A, Tabela S3 ). Estas observações são consistentes com os nossos resultados iniciais [13]. Dos parceiros da rede RAN, a expressão citoplasmática alta de XPO7 (p = 0,02; Figura 3E) e expressão alta TPX2 nuclear (p = 0,002, Figura 3I) foram correlacionados com menor sobrevida global

Para investigar mais a. potencial significado prognóstico da RAN e suas proteínas parceiras na sobrevida global paciente, análises de regressão Cox univariadas foram realizadas (Tabela 2). RAN citoplasmática e coloração XPO7 e localização TPX2 nuclear no HG serosa EOC foram significativamente correlacionados com a sobrevida global pobres (p = 0,008, p = 0,027, p = 0,002, respectivamente). Estas proteínas foram fatores substanciais independentes de prognóstico para a sobrevivência com taxas de risco (HR = 1,82 para a RAN, HR = 1,58 para XPO7 e HR = 2,66 para TPX2) comparáveis ​​ao de doença residual (HR = 1,82), um fator prognóstico conhecido [3] .

em conjunto, nossos resultados sugerem que XPO7, envolvido na exportação da RAN nucleo-citoplasmática de proteínas, e TPX2, parceira da RAN na mitose, bem como a própria RAN, pode contribuir para o maligno potencial de sobrevida global EOC e influência serosa do paciente.

Associação de RAN e TPX2 com recorrência no serosas EOC pacientes

a importância das proteínas rede RAN na recorrência no contexto da sobrevida livre de doença foi avaliada pela curva de Kaplan-Meier e análises de regressão de Cox, tal como descrito acima. níveis crescentes de coloração RAN citoplasmática no HG EOCs serosa foi significativamente associada com sobrevida livre de doença mais curto por análise de Kaplan-Meier (p = 0,014; Figura 4A, Tabela S3). Das proteínas de rede RAN, Kaplan-Meier análises encontrado apenas a localização TPX2 nuclear como significativamente associado à recidiva em HG EOC serosa (p = 0,004; Figura 4I, Tabela S3). A análise de regressão univariada Cox validado essas descobertas onde as proteínas RAN (p = 0,006) e TPX2 (p = 0,006) apresentaram correlação significativa com recorrência da doença (Tabela 2). Estes resultados também foram comparáveis ​​para as taxas de risco para doença residual determinados (Tabela 2).

Avaliação da expressão da proteína de rede RAN em apenas carcinomas serosos de alto grau por meio de análise de Kaplan-Meier. sobrevida livre de progressão corresponde ao tempo em meses, calculado a partir do momento da primeira cirurgia até a primeira progressão. O teste de log-rank foi utilizado para definir diferença estatística entre os grupos. (Ver Figura 3 legenda para detalhes).

Portanto, nossos resultados sugerem que a função mitótico da RAN especificamente, através do seu parceiro TPX2, parece estar associada a recorrência de HG EOC serosa.

análise multivariada confirmam a forte associação da TPX2 Expressão em paciente sobrevivência e recorrência da doença

para definir ainda mais o potencial valor prognóstico da rede proteína RAN, multivariados análises de regressão de Cox foram realizadas para RAN e cada parceiro que o alcançado significância na análise univariada.

as taxas de risco de RAN, XPO7 e TPX2 para a sobrevida global paciente foram comparados com factores de prognóstico padrão, tais como palco e doença residual (Tabela 2). Nossos resultados mostram que apenas RAN (p = 0,015, HR = 1,84), TPX2 (p = 0,033, HR = 2.15) e doença residual (p 0,05) foram os marcadores prognósticos independentes significativos para a sobrevida global em tumores HG. Curiosamente, ambos RAN e TPX2 teve RHs mais elevados do que doença residual (Tabela 2).

Para recorrência, o padrão de expressão de RAN e TPX2 também foram comparadas às variáveis ​​de prognóstico padrão (de palco e de doença residual). Nos tumores HG, única RAN (p = 0,013, HR = 1,69) e TPX2 (p = 0,024, HR = 2,53) foram as variáveis ​​independentes, que predizem um alto risco de recorrência (Tabela 2).

A concomitante Over- Padrão de TPX2 /RAN ou TPX2 /XPO7 expressão está associada a um pior resultado em serosa EOC pacientes

Nossos resultados indicam que os padrões de expressão de RAN e seu parceiro TPX2 mitótico no ato EOC serosa como biomarcadores prognósticos independentes para ambos sobrevida dos pacientes em geral e recorrência. A seguir, avaliou o impacto combinado desses dois biomarcadores candidatos sobre a sobrevida global e livre de doença usando análise da curva de Kaplan-Meier. Nossos resultados mostraram uma diferença significativa entre os padrões de coloração de RAN e TPX2 na sobrevida livre de progressão (Figura 4J) em casos HG. Em particular, a presença concomitante de RAN e TPX2 foi associada a menor sobrevivência livre de doença em comparação com a presença de só RAN (15 meses versus 30 meses, p = 0,001, Figura 4J). A mesma tendência também foi observada para a sobrevida do paciente geral com significância limítrofe (p = 0,07, Figura 3J). Usando as mesmas análises, que também demonstraram que XPO7 e TPX2 padrões de expressão foram significativamente associados com ambos sobrevivência global pior (p = 0,012) e mais curto sobrevida livre de doença (p = 0,012) quando comparada com a presença de apenas XPO7 (Figura 3K, Figura 4K). É notável que a expressão TPX2, quando ocorreu, foi sempre associado com qualquer RAN ou co-expressão XPO7.

Discussão

High RAN níveis de expressão foram relatados em diferentes tumores, como o pâncreas , cólon, pulmão, nasofaringe, do estômago e do rim, quando comparado aos tecidos normais [17] – [19], [36]. Curiosamente, os estudos de interferência de RNA mostraram que correu regulação afeta drasticamente a sobrevivência das células do câncer, mas não o de células normais [14], [18]. No entanto, apesar da importância vital da RAN em células cancerosas tem sido difícil de determinar qual a função desta proteína está envolvida na tumorigénese. Para começar a abordar esta questão temos estudado a expressão de vários parceiros RAN, específica para as suas funções distintas, em associação com EOC sobrevida e recorrência.

Usando uma coorte maior, que corroboraram nossos resultados iniciais que os pacientes com expressão alta RAN no EOC serosa estão associados com a progressão da doença e pior prognóstico [12], [13]. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.