Abstract

Novas estratégias que têm como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) levaram ao desenvolvimento clínico de anticorpos monoclonais, que tratam câncer metastático colo-rectal (mCRC), mas apenas subgrupos de pacientes com aumento KRAS tipo selvagem e de cópias do gene de EGFR, responder a estes agentes. Além disso, a resistência ao bloqueio EGFR inevitavelmente ocorreu, tornando a terapia futuro difícil. Novos métodos bio-imaging (BOI) podem ajudar a quantização de EGFR no tecido mCRC complementando assim a metodologia imuno-histoquímica, para orientar o futuro tratamento destes pacientes. O objetivo do presente estudo foi explorar a utilidade de perto EGF infravermelho marcado (EGF-NIR) para bio-imagem da CRC usando

in vitro

In vivo

modelos CRC tumorais ortotópico Comprar e e

ex vivo

tecidos CRC humanos. Descreve-se a preparação e caracterização de EGF-NIR e investigar a ligação, usando BOI de um painel de modelos de cultura de células que se assemelham a heterogeneidade CRC CRC de tecidos humanos. EGF-NIR foi especificamente e selectivamente ligados por EGFR expressando células de CRC, a intensidade de sinal de EGF-NIR a proporção fundo (SBR) reflecte os níveis de EGFR, dose-resposta e decurso de tempo experiências de imagiologia criadas condições óptimas para a quantização de níveis de EGFR por BOI. EGF-NIR imagens de ratos com HT-29 tumor CRC ortotópico indicou que EGF-NIR é mais lentamente eliminado do tumor eo maior SBR entre tumor e tecido normal adjacente foi alcançado dois dias após a injecção. Além disso, as imagens dos tecidos dissecados demonstraram acumulação de EGF-NIR no tumor e no fígado. EGF-NIR especificamente e fortemente marcado EGFR tecidos humanos positivos CRC CRC enquanto que o tecido adjacente e tecidos negativos EGFR expresso NIR sinais fracos. Este estudo enfatiza o uso de EGF-NIR para estudos pré-clínicos. Combinado com outros métodos, EGF-NIR poderia fornecer uma ferramenta específica bio-imagem adicional na padronização das medições de expressão de EGFR em tecidos CRC

Citation:. Cohen G, Lecht S, Arien-Zakay H, K Ettinger , Amsalem O, Oron-Herman M, et al. (2012) Bio-Imaging de Modelos cancro colorectal usando Fator de Crescimento Epidérmico Near Infrared rotulados. PLoS ONE 7 (11): e48803. doi: 10.1371 /journal.pone.0048803

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 17 de junho de 2012; Aceite: 1 de outubro de 2012; Publicação: 08 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Cohen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho relatado aqui foi apoiada por Bio Medical Photonics (BMP) consórcio, Ministério israelita da Indústria e Comércio, programa de MAGNET. gestão do consórcio não têm qualquer papel na concepção, recolha de dados e análise, ou preparação do manuscrito. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias mais comuns nas sociedades ocidentais. sobrevivência a longo prazo dos pacientes CRC-diagnosticados está correlacionada com o estágio da doença no momento do diagnóstico. Nas fases iniciais, bem como em pacientes seleccionados, com doença avançada, a cirurgia é a principal forma de tratamento [1]. Pelo menos 40% dos pacientes com CRC irá desenvolver metástases distantes síncrono ou metacrônicos, a maioria deles vai sucumbir à sua doença e morrer [2]. Algumas das características do fenótipo maligno de CRC são correlacionados com a sobre-expressão e activação de hiper-tirosina-quinases receptoras tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que tornam estes receptores alvos atraentes para o tratamento do cancro [3]. Na maioria dos pacientes com CCR, a progressão da mucosa do cólon normal a câncer envolve uma cascata definido de alterações moleculares, que se espalha ao longo dos anos [4]. polipectomia endoscópica mostrou reduzir a mortalidade relacionada com o CRC [5]. Este procedimento requer a visualização colonoscopia fibro-óptica do tecido CRC seguido por avaliação histológica. Além disso, os tecidos de CRC são frequentemente avaliado por [7] e

in situ hibridação

[8] técnicas [6] RT-PCR, imuno-histoquímica, a qual mostrou um muito maior grau de discordância entre primárias e metástases CRC relacionados [ ,,,0],9].

EGFR é frequentemente sobre-expressa numa variedade de tumores sólidos, do cérebro, da mama, do pulmão, dos ovários e do pâncreas, e está associada ao aumento prognóstico pobre e potencial metastático de CRC [10]. Os agentes biológicos que inibem EGFR demonstraram actividade clínica como agentes únicos ou em combinação com quimioterapia, o mais promissor destes agentes serem cetuximab e panitumumab. Infelizmente, estes anticorpos são clinicamente eficazes em apenas uma minoria de pacientes com CRC [11]. O sucesso clínico dessas terapias de anticorpos monoclonais é uniformemente limitada pelo desenvolvimento de resistência adquirida ao bloqueio de EGFR [12]. Um mecanismo para a resistência foi recentemente elucidado: células resistentes cetuximab conter uma mutação do EGFR no domínio extracelular (S492R) que prejudica o cetuximab, mas não factor de crescimento epidérmico (EGF) de ligação [12]. Por conseguinte, uma vez que a resposta à terapia requer o alvo EGFR de estar presente, é necessário o desenvolvimento de métodos de BOI para a detecção quantitativa de níveis de proteína EGFR em CRC primário e tecidos de tumores secundários, a fim de orientar o tratamento de indivíduos seleccionados para EGFR alvo anticorpo tratamento e, em particular, aqueles que recaída, enquanto em terapias visando EGFR [13]. O advento do alvo EGFR anticorpos, cetuximab e panitumumab abriu o caminho para a medicina individualizada de mCRC. os dados actuais sugerem que a avaliação de KRAS e BRAF mutação e PI3K /PTEN alteração poderia ser útil para a selecção de pacientes que não são susceptíveis de responder aos anticorpos anti-EGFR-alvo. Verificou-se que os tumores que respondem CRC transportar tipo selvagem KRAS /BRAF e tendem a ter um modesto, o aumento do número de cópias do gene de EGFR, o que se traduz num aumento modesto no nível de EGFR. Portanto, o gene EGFR detecção do número de cópias e avaliação quantitativa do nível de proteína EGFR provavelmente vai melhorar a adaptação de cetuximab e panitumumab terapias para pacientes com CCRm [12]. No entanto, as dificuldades técnicas da técnica de imuno-histoquímica, o qual é utilizado para avaliar a expressão do EGFR em tecidos fixados, pode ter limitado a detecção do aumento do nível de proteína pequena EGFR medida [11]. Portanto, são necessários novos métodos sensíveis BOI de nível de proteína EGFR em mCRC. EGFR cintigrafia, representa um tal método, que se baseia na ligação, internalização, e a retenção dos agentes alvo EGFR marcado radioactivamente em compartimentos intracelulares e tem sido demonstrado com o EGF marcado radioactivamente e com o anticorpo monoclonal dirigido contra EGFR marcado radioactivamente [14]. No entanto, a desvantagem destes métodos é a utilização de materiais radioactivos

infravermelho próximo (NIR) BOI óptico oferece vantagens únicas para o diagnóstico de CCRm:. Que oferece uma elevada sensibilidade, ele pode ser usado com diferentes etiquetas de NIR e ele pode fornecer, em tempo real dinâmico

in vitro

e

in vivo

imagens por meios não radioactivas [15]. luz NIR (700-1000 nm de comprimento de onda) pode penetrar no tecido, e oferece um método potencialmente seguro, não invasivo de tumores caracterizam [16]. Na maioria das aplicações, NIR BOI é usado para ajudar os agentes de contraste fluorescentes específicas, que não só oferecer melhor contraste, mas também, mais importante, revelam eventos moleculares específicos associados com a iniciação do tumor CRC e progressão [17]. Estudos recentes estabeleceram o uso de segmentação Affibody mediada de agentes de contraste fluorescentes excitáveis ​​NIR para a detecção de células e tumores malignos [18].

Portanto, os objetivos do presente estudo foram desenvolver e caracterizar romance

modelos in vitro

CRC que se assemelhavam CRC heterogeneidade e para avaliar se é possível quantificar o nível de EGFR no

ex vivo

amostras de tecido CRC frescas, tumor ortotópico em camundongos e recentemente desenvolvidos modelos de linhas celulares usando EGF conjugado com IRDye 800CW (EGF-NIR) da sonda. Encontramos condições óptimas para BOI de EGFR utilizando sonda EGF-NIR nestes modelos, aplicáveis ​​para endoscópica e Odyssey Infrared Imager analisa. Além disso, por meio de análise de processamento de imagem e western blot confirmou-se que a intensidade do sinal de EGF-NIR à relação de fundo reflete o nível de proteína EGFR nos

in vitro

modelos CRC e

in situ

CRC humana tecidos investigados.

(a) o esquema reaccional para a síntese de EGF-NIR conjugado, o primeiro aminoácido asparagina no terminal amino como é indicado ASN1. (B) a separação da mistura de reacção de síntese por cromatografia de permeação de gel e de amostra de EGF-NIR de permeação em gel em cromatografia de permuta aniónica (C); EGF-NIR-full line (800 nm); gradiente de linha de NaCl-quebrado; não conjugada linha pontilhada-EGF. (D) separação por HPLC do EGF-NIR purificado a partir de cromatografia de permuta aniónica. Completa linha representa a absorvância a 226 nm e a linha pontilhada indica o gradiente. Introduza-12% A análise de SDS-PAGE de 10 ug de EGF-NIR digitalizada com Odyssey e EGF não modificado corado com azul de Coomassie. (E) espectro de NIR de EGF-NIR [excitação (linha cinza) e emissão (linha preta)]; Insira-IRDye éster 800CW NHS; (F) de EGF-induzida NIR Erk fosforilação.

células HT-29 foram incubadas durante 15 minutos a 37 ° C (A) e 4 ° C (B), com 7 nm de EGF-NIR no presença ou ausência de 100 nM de EGF. As experiências de competição com 500 nM de cetuximab, TGF-α ou NRG1 também foram conduzidos. Em experiências de controlo, as culturas foram incubadas com 7 nm NIR-corante para avaliar rotulagem não específica das células. A intensidade NIR em 800 nm foi estimada sob condições idênticas para todas as culturas e a média ± DP (n = 9) é apresentada. inserções superiores: scans NIR; inserções inferiores: microfotografias de contraste de fase das culturas, * P 0,05 vs. NIR-Dye; ** P 0,05 vs. EGF-NIR

células HT-29 foram transfectadas durante 2 dias com 5 nM anti-EGFR Silenciador seleccionar siRNA ou ARN mexidos ou deixada sem tratamento (controlo).. Avaliação da expressão do EGFR foi realizada por NIR Em celular utilizando imagiologia de 7 nm de EGF-NIR (barras pretas) e blotting (barras cinzentas) ocidentais. Os valores são a média ± SD (n = 3). * P . 0,05 vs. mexidos ou controle

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Dois pontos humanos linhas celulares de carcinoma HT-29, SW620, COLO205, A431 células de carcinoma humano epiteliais escamosas e de rato pequeno clone de célula epitelial de intestino IEC 6 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e ajustado para o crescimento em de Dulbecco modificado por Eagle Médium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L -glutamina e 10000 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C, 6% CO

2 numa incubadora humidificada. Todos os experimentos foram realizados em condições de GLP usando uma sala limpa de acordo com ISO7 requisitos (10.000 partículas /m

3).

Preparação, purificação e caracterização de EGF-NIR

EGF NIR foi sintetizado de acordo com LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EUA) utilizando as instruções do éster NHS IRDye 800CW (2-(3-{5-[7-(5-amino-1-carboxy-pentylcarbamoyl)-heptanoylamino]-1-carboxy-pentyl}ureido)-pentanedioic ácido) para a conjugação de EGF humano recombinante (Peprotech, Ásia, Rehovot, Israel). Resumidamente, o EGF (32 nmol) foi incubada com 5 equivalentes de éster de IRDye 800CW NHS em 1 M de K2HPO4, pH 9,0, durante 2 horas no escuro a 20 ° C, com agitação. Seguindo a conjugação, a mistura de acoplamento de reagentes livres e EGF-NIR foi aplicada a HiPrep 26/10 (Belas Sephadex G-25, tamanho de partículas de 90 mm) coluna de dessalinização (GE Healthcare, Ciências Biológicas, Buckinghamshire, Reino Unido) de um volume de 55 ml (Vo = 15 ml). Esta coluna foi equilibrada e eluída a 10 ml /min com água destilada utilizando instrumento FPLC AKTA P900 (GE-Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Isto foi seguido por recolha do pico excluido e ajustando-a a pH 8,0 por adição de 1 ml de tampão 0,02 M Tris-HCl (pH 8,0). A solução foi aplicada por cromatografia de permuta aniónica em Hitrap DEAE FF (DEAE Sepharose High Flow, GE Healthcare, Life Sciences, Buckinghamshire, UK) equilibrada com tampão de 0,02 M de Tris-HCl (pH 8,0) a um caudal de 1 ml /min e EGF -NIR foi eluída a partir da coluna usando um gradiente de NaCl 1-100% no tampão de equilíbrio. A purificada de EGF-NIR foi dialisada em 3000 cortar sacos de diálise (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA) durante 14 horas no escuro a 4 ° C contra água destilada. A solução destilada foi liofilizado, e 0,1 mg de amostras secas de EGF-NIR dissolvido em 1% de ácido trifluoroacético (TFA) foram finalmente separados por HPLC utilizando uma coluna Sperisorb DDS2 (instrumentos LKB, Gaithersburg MD) utilizando dois gradientes lineares: o primeiro gradiente 10-35%, seguido de um segundo gradiente de 35-85% de acetonitrilo em TFA a 1%. A purificação foi realizada a uma taxa de fluxo de 4,7 ml /min (pressão de 100 bar). A execução completa continuou durante 45 min e o pico de EGF-NIR foi estimada pela absorvância óptica a 226 e 700 nm. concentrações molares de corantes e EGF foram calculados utilizando coeficientes de extinção molar de 270.000 M

-1cm

-1 para IRDye 800CW a 780 nm, e 18.000 M

-1cm

-1 para EGF. A absorvância a 280 nm foi utilizada para calcular a concentração de proteína EGF baseados no coeficiente de extinção molar. absorvância de comprimento de onda dual foi usada para determinar corante: proteína. emissão de EGF-NIR foi medido em PBS utilizando uma Fluoro-Max 4 espectrofluorímetro (JY Horiba, Edison, NJ, EUA) com uma lâmpada de arco de Xenon como fonte de excitação de 774 nm, em cuvete de 1 cm, e a uma taxa de varrimento de 80 nm /seg. Para a validação, também foi usado o EGF-NIR de LI-COR Biosciences (Lincoln, NE, EUA). EGF-NIR foi submetida a análise em 12% de SDS-PAGE por comparação com EGF nativo, não marcado. As amostras de 10 ug de proteínas foram separadas e visualizadas por coloração com azul Coomassie e a emissão foi medida por NIR posicionamento e a digitalização do gel na Odyssey® infravermelhos (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA).

western Blotting de EGFR e Erk fosforilação

Os níveis de EGFR em tecido e linhas celulares de CRC e fosforilação de ERK foram estimadas mediante extracção com tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EUA). A capacidade de EGF-NIR para estimular a fosforilação de ERK em células A431 foi comparada com a de EGF não marcado. 2 × 10

6 células em 90% de confluência numa placa de 6 poços foram privadas de soro durante 2 horas. meio de inanição foi substituído por meio normal contendo 7 nM de EGF-NIR. As células foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente e colhida. 50 ug de proteína de lisados ​​foram separados por 10% de poliacrilamida de SDS-PAGE e transferidas em gelo para membranas de nitrocelulose (90 V durante 1,5 horas; Whatman, Dassel, Alemanha). A ligação não específica foi bloqueada através da incubação das membranas durante 2 horas à temperatura ambiente (TA) com 5% leite magro em pó (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) em tampão salino Tris que contém 0,1% de Tween-20. A imunodetecção foi realizada com o anticorpo monoclonal anti-EGFR (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EUA) ou anticorpos primários (1:1,000) contra fosfo-ou pan-ERK1 /2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EUA), seguido por peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) e reveladas com ECL (Pierce, Rockford, IL, EUA)

(a) esquerda:. um esquema de CRC pólipo com alta manchas de células transformadas CRC (área focal) e área heterogêneo, incluindo tanto as células normais e transformadas CRC; Meio: geração de uma mistura heterogénea em diferentes proporções (%) entre HT-29 e SW 620; 0 – nenhuma célula; + /++ -Presença De concentrações diferentes de células; Direita: chapeamento focal (em um anel) de HT-29 e monocamada A431 cercado por SW620 monocamada; inserir-o nível de EGFR (170 kDa) e não-EGFR maduro (150 kDa) nas células; (B) A relação entre a intensidade de NIR de 15 de ligação com 7 nm de EGF-NIR min (média ± DP, n = 9) e a percentagem de SW620 na mistura de células com qualquer HT-29 (círculos fechados) ou HCT116 (aberta círculos) * p 0,05 vs 100% SW620; (C) A relação entre SBR (média ± DP, n = 9) e a concentração de EGF-NIR; A431 (círculos abertos); HT-29 (círculos fechados); de ligação foi realizado durante 15 minutos. Inserção: scans NIR; * P 0,05 vs. 0,01 nM; (D) A cinética de 7 nM de EGF-NIR de ligação (média ± DP, n = 9) para as culturas de A431 focais (círculos abertos) ou HT-29 (círculos fechados); Inserção: scans NIR; * P . 0,05 vs. 0 min

Preparação de

in vitro

CRC Modelos e no celular NIR Imagem (IC-NIR)

monocamada homogénea de uma linha de célula individual.

CRC células foram plaqueadas a uma densidade de 150.000 células /poço em placas de 12 poços de cultura de tecidos (Nunc, Rochester, NY, EUA), dois dias antes das experiências gerando monocamada de células homogénea. Em seguida, o meio de cultura foi substituído com meio fresco contendo 7 nM de EGF-NIR, durante 15 min a 4 ° C e 37 ° C, para medir a ligação total. No final da experiência, as culturas foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS e celular associada intensidade NIR foi estimada. Para avaliar a ligação não específica, culturas irmãs foram incubadas com a mesma concentração de EGF-NIR, nas mesmas condições, na presença de um excesso de 100 nM de EGF. A ligação específica por imagiologia de EGF-NIR é definida como a diferença entre a intensidade de NIR da intensidade de ligação e NIR total de ligação não específica. As experiências de competição com 500 nM de qualquer cetuximab, transformando α fator de crescimento (TGF-a) ou neuregulina 1 (NRG1) foram realizadas por incubação concomitante de o competidor com EGF-NIR. Os resultados são apresentados como a média ± DP de pelo menos três experiências independentes (n = 9). A imagiologia NIR foi estimada utilizando Odyssey Infrared Imager nas seguintes condições variam: resolução: 170-340 microns; área de pixels: 0,03 mm

2 (aproximadamente 15-20 células); qualidade: médio-baixo; concentrar offset: 1-3; canais: 800 nm; Intensidade: 1-3.

monocamada focal heterogêneo de células CRC

Para imitar pontos altos de células CRC transformadas no pólipo [19] e para permitir medições diretas da relação sinal-fundo em. na mesma experiência, foi utilizada uma abordagem de cultura de células focal. Diferentes linhas celulares de cancro colo-rectal (com diferentes níveis de EGFR) ou 15 × 10

3 A431 (elevados níveis de EGFR) foram semeadas até à confluência dentro de um 4 milímetros ao diâmetro interno do anel de clonagem (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA ) colocada no centro de um poço. As células foram deixadas a aderir durante 2 horas numa incubadora. Em seguida, 15 × 10

3 SW620 células (falta o EGFR) foram plaqueadas na área livre de células em torno do anel de clonagem e deixou-se aderir durante 2 horas nas mesmas condições. Foram realizados dois tipos de tais experiências: a. um dos focos. b. dois focos. No final do passo de aderência celular, o anel de clonagem foi removido e as células foram lavadas com meio de cultura. Dois dias após a geração do modelo, as culturas foram submetidas a ligação e experiências de imagiologia tal como anteriormente descrito. Relação sinal /fundo (SBR) valores indicam a proporção de sinal fluorescente NIR do círculo central (área focal de CRC ou células A431) para sinal fluorescente NIR de fora da área (SW620).

células CRC diferentes foram focally banhado em um fundo de IEC6 enterócitos monocamada. As culturas foram incubadas durante 15 min a 37 ° C, com 7 nm de EGF-NIR na presença (ligação não específica – barras brancas) ou na ausência (ligação total – barras cinzentas) de 100 nM não modificado EGF. O sinal (linha de células de CRC) /fundo (IEC6) proporção foi estimada em condições idênticas para todas as culturas e são apresentadas como a média ± DP (n = 9). Significado: * p 0,05 comparado com valores IEC6; ** P 0,05 em comparação com a ligação total do respectivo grupo p 0,05 comparado a A431 e p 0,05 comparado com COLO 205; inserções inferiores: scans NIR; inserções superiores: a expressão da proteína esquerda-EGFR por western blot; seta indica a posição do EGFR maduro proteína 170 kD e a proteína não glicosilada de 150 kD; expressão-mRNA direita do CEA e β-actina em culturas de células.

suspensões heterogênea de células CRC.

Para imitar distribuição heterogênea de células CRC transformadas no pólipo [20] e para permitir a avaliação da sensibilidade de detecção de uma quantidade mínima de células EGFR entre enterócitos normais de controlo, culturas heterogeneamente misturado de HT-29 e células SW620 que expressam foram preparados. As culturas em suspensão de HT-29 foram misturados com as culturas em suspensão de SW620 para gerar percentagem diferente da cultura de células individuais no mesmo volume. células SW620 poderia ser distinguido de células HT-29 pela sua morfologia alongada. Em condições designadas como “0%” a suspensão contém 0% HT29 células SW620 e 100%, e em células “100%”, a suspensão contém 100% de células HT-29 e 0% SW620 células. Nos outros casos, as percentagens indicam a relação entre a percentagem células HT-29 e percentagem de células SW620. As condições de ligação experimentais e medições de NIR intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias /mm

2) das diferentes culturas heterogêneas foi realizada como acima.

(A) A fotografia de um tumor ortotópico e proteína EGFR expressão no tumores; (B) Curso de tempo da acumulação de EGF-NIR em tecidos de ratinhos portadores de tumor. Os ratinhos foram injectados i.v. com 1 nmol de EGF-NIR em ratinhos não tratados (linha de cima, n = 6) ou de ratinhos pré-injectados com 1 ug /ml cetuximab (fila inferior, n = 4); BOI alta resolução de um rato injectado com EGF-NIR e círculos indicam as medições de ROI (C) Curso de tempo de acumulação de tecido de EGF-NIR em 48 horas a partir de ratos apresentados em B; A intensidade do sinal a 800 nm foram normalizados para a fluorescência de fundo usando um círculo arbitrária do tumor (10-20 ROIs /rato) em comparação com uma região idêntica no flanco (músculo adjacente); * P 0,05 comparado com o EGF-NIR 4 horas; ** P 0,05 em comparação com ratinhos injectados com EGF-NIR; (D) de EGF-NIR relação sinal /fundo no tecido isolado a partir de ratinhos portadores de tumor 48 horas após a injecção. * P 0,05 comparado com o músculo, ** p 0,05 em relação ao fígado; Inserir: superior fotografias de tecidos no prato; imagens-NIR Oriente; mapas de intensidade inferior espectral; Intensidade scale-vermelho-acastanhada (5) alta expressão; azul (3) muito baixa expressão.

RT-PCR e EGFR siRNA silenciamento

O RNA total foi isolado e o ADN genómico foi degradada a partir das preparações de RNA, usando o SV isolamento total RNA sistema (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). 1 mg de RNA total foi transcrito de forma reversa (Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A PCR foi realizada num volume final de 50 uL contendo 5 ug de cDNA, 50 pmol de cada sentido a montante e a jusante de iniciadores de sentido directo ou CEA EGFR [21], [22], e 25 ul de mistura verde GoTaq® mestre (Promega, Madison , WI). experiências de PCR foram realizados durante 35 ciclos. Para gerar diferentes fragmentos de ADNc, um gradiente Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) foi programado como se segue: desnaturação a 95 ° C durante 1 min, emparelhamento a 61 ° C e elongação a 72 ° C durante 1 min. Para derrubar EGFR o protocolo agente de amina transfecção padrão de Ambion (Applied Biosystem, Austin, TX, EUA) foi seguido. Resumidamente, 5 nM de 21 mer anti-EGFR Silencer seleccionar pequeno RNA de interferência (siRNA) e mexidos RNA foram transfectadas reversa em culturas de células A431 usando siPORTNeoFX agente de transfecção de acordo com o protocolo do fabricante. As células a uma densidade de 80.000 células /ml foram aplicadas em placas de 12 poços e 2 dias após as transfecções foram analisadas. Bater para baixo de ARNm de EGFR foi confirmada por Western blotting. A seguir carcino antígeno embrionário (CEA) e EGFR primers, preparado por SyntezzaBioScience Ltd., Jerusalem, Israel, foram utilizados:

Human CEA Cam5: Sense: 5′- CGCATACAGTGGTCGAGAGA-3 ‘; Antisense: 5’-ATTGCTGGAAAGTCCCATTG-3 ‘

Rat CEA1: Sense: 5′- CTACAGGCTGAGGGATGCTC-3′ anti-sentido: 5′-GGTCCCGTCACAGTTACGTT-3 ‘

EGFR humano: Sense: 5′- CGAGGGCAAATACAGCTT-3 ‘Antisense: AAATTCACCAATACCTATT-3’

Human EGFR siRNA: Sense: 5′- CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt-3 ‘Antisense: 5′-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag-3’

siRNA Scrambled: sentido: 5 ‘-UAACGACGCGACGACGUAATT-3′ Antisense: 5’-UUACGUCGUCGCGUCGUUATT-3 ‘

Preparação e NIR por imagem da CRC ortotópico tumores em ratos

Este estudo usando Masculino Balb /c nu (Harlan , Israel) ratos foi aprovado, realizada e supervisionada pelas diretrizes do Comitê animal Care Medical Center e Uso Chaim Sheba. Células HT-29 foram tratadas com tripsina, lavadas e ressuspensas a uma concentração de 1 × 10

7 células /ml em PBS. Para a implantação do tumor, os ratinhos foram anestesiados por injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg /kg) e xilazina (20 mg /kg). injeção trans-anal de 1 × 10

6 HT-29 células foi realizada sob a ampliação do microscópio (X40) utilizando uma agulha de 27 g. A injecção foi dirigido por via submucosa no recto distal, posterior, aproximadamente, 2-3 mm para além do canal anal e na mucosa rectal [23]. Os ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana para a iniciação e progressão do tumor. Tumores atingiram ~ 0,75 cm de tamanho em 3-4 semanas.

In vivo

imagem de EGF-NIR de fluorescência em camundongos foi realizada com um LI-COR Biosciences pequenos animais imager Odyssey MousePOD®. Para visualizar os tumores, 1 nmol de EGF-NIR em 100 ul de solução salina foi injectado através da veia da cauda em murganhos de tumor positivas na presença (n = 4) ou na ausência (n = 6) de cetuximab (1 ug /ml) e avaliada para depuração sistémica por imagiologia NIR em intervalos de 1-8 horas durante um período de três dias, após o que 95% do sinal tinha desaparecido. Os ratos foram fotografadas até dois dias após a injecção e sacrificados. A análise estatística das imagens para cada ratinho foram normalizados utilizando a mesma escala de intensidade, de acordo com as condições anteriormente descritas. SBR foi calculada como se segue: a intensidade média do tumor NIR dividida pela intensidade média NIR do fundo do músculo adjacente. Regiões de interesse (ROI) com áreas idênticas foram usados ​​tanto para tumor e do fundo. O desvio padrão dos fundos média foi calculada usando 10-20 ROIs. Devido a diferenças do tamanho do tumor entre os animais que receberam EGF-NIR, sinal tumoral dividido pelo sinal da ROI tamanho semelhante corrigida pela área (pixels) do fundo, desde o tumor bidimensional (2D) de rotulagem total. Tumores, músculo esquelético e no tecido do fígado de ratos sacrificados foram dissecados e as suas amostras de urina foram colhidas. Os tecidos foram pesados ​​e introduzidos em placas de tubos de plástico. Os pratos foram digitalizados em Odyssey Infrared Imager. NIR intensidade de ROI do tumor foi comparado ao músculo adjacente para gerar SBR. análises de tecidos isoladas foram realizadas por varrimento a 800 nm de canal, para o tecido acumulado sinal de fluorescência de EGF-NIR e foi calculada a SBR. A imagiologia NIR foi estimada nas seguintes condições: resolução: 170-340 microns; área de pixels: 0,03 milímetros

2; qualidade: médio-baixo; concentrar offset: 1-3; canais: 800 nm; Intensidade: 1-3.

Pacientes e CRC Tissue A recolha de amostras

18 pacientes com idade superior a 18 anos com diagnóstico histológico de adenocarcinoma primário do cólon foram oferecidos a participação no estudo. 5 pacientes que receberam radiação antes ou quimioterapia não eram elegíveis para o estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB, o Comité de Helsínquia), do Hadassah-Hebrew University Medical Center. Todas as amostras foram obtidas a partir de consentir sujeitos do estudo submetidos a ressecção cirúrgica do tumor que assinou um consentimento informado por escrito. Todas as amostras foram submetidas à análise macroscópica e microscópica de rotina por um patologista placa certificada de acordo com o College of American Pathologists (CAP) diretrizes de relatórios histopatologia (www.cap.org). Tecidos identificados pelo patologista estudo como adenocarcinoma do cólon e tecidos adjacentes [24] foram então usados ​​para geração de imagens IC-NIR.

36 Fatias de tecidos CRC e 19 fatias de tecido do cólon adjacente (n = 10-15 ROI em cada fatia) foram submetidas a

ex vivo

ensaio de ligação durante 45 minutos a 37 ° C com 70 nM de EGF-NIR na presença (não específica) ou na ausência (ligação total) de 1 uM não marcado EGF. A intensidade NIR foi avaliado em condições idênticas para todas as fatias (n = 12). Significado: * p 0,01 comparado com grupo respectivo EGFR cólon adjacente, ** p 0,05 comparado com grupo respectivo CRC tecido EGFR-; Inserção: típico western blot para EGFR das fatias investigados

Imagens de cinco fatias típicas, especificamente marcadas com EGF-NIR, conforme descrito na legenda para Fig.. 7. A Odyssey 800 nm Infrared Imager adquiriu imagens foram processadas utilizando o software de imagem espectral aplicada, Spectral View. Intensidade scale-vermelho-acastanhada (5) alta expressão de ligação de EGF-NIR; verde (4) expressão intermediária; azul (3) muito baixa expressão.

NIR BOI de CRC tecidos

tecido de tumor fresco ou tecidos do cólon adjacentes foram divididos em fatias horizontais, 230 mm de espessura, os quais foram preparados usando um vibratome VT1000S (Leica, Nussloch, Alemanha) e incubadas em DMEM solução de ligação arrefecido com gelo. As fatias foram transferidas para placas de cultura de 24 poços de tecido cheias com DMEM saturado com 95% de O

2 e 5% de CO

2 semelhante a condições que permitam a culturas de órgãos rectais [25]. As placas foram mantidas em gelo durante 45 min duração em DMEM e a experiência de ligação foi realizada por adição de 70 nM de EGF-NIR na presença (ligação não específica) ou na ausência (ligação total) de 1 uM de EGF não modificado. A partir de cada tecido, fatias foram incubadas em triplicado com 70 nM de NIR-corante (IRDye800CW) para avaliar a ligação não específica do corante. A experiência de ligação foi terminada por lavagem do tecido três vezes com PBS frio. As fatias húmidos foram transferidos para novas placas de 24 poços em 1 ml /poço de PBS e digitalizada para imagiologia NIR intensidade utilizando Odyssey Infrared Imager, sob as condições descritas acima. Em série, ao longo de um período de dois anos, foram avaliados 43 de CRC e 23 amostras de tecido de cólon adjacentes. ROIs com domínios idênticos foram usadas para fatias de os diferentes grupos experimentais. As médias e desvios-padrão dos NIR intensidade (unidades fluorescentes arbitrárias /mm

2 de área) foram calculados utilizando 10-15 ROIs em cada fatia individual. Cada fatia apresentado para a experiência de ligação de EGF-NIR foi também avaliada após a formação de imagens para a expressão do EGFR por western blotting. Os dados obtidos foram categorizados de acordo com tecidos EGFR positivos CRC, EGFR tecidos CRC negativos e tecido do cólon adjacente que na maioria eram EGFR negativo. A falta de EGFR foi provado por Western blotting. 85% das fatias foram incluídos na análise estatística de acordo com o critérios farmacológico seguinte: a. ligação total; b. FIG.