Abstract
Fundo
O receptor de andrógeno (AR) desempenha um papel crítico na proliferação de células cancerosas da próstata. No entanto, o seu mecanismo de acção permanece desconhecido em proliferação. Uma compreensão do mecanismo de ação AR na proliferação pode levar ao desenvolvimento de estratégias eficazes para o tratamento de câncer de próstata.
Metodologia /Principais Achados
Neste estudo nós relatamos que o tratamento pulso de sincronizadas células LNCaP com Casodex, um AR-antagonista, durante 4 horas, em meados de L
1 fase era suficiente para evitar que as células entrem na fase S. Uma vez que a montagem do complexo de pré-replicação (pré-RC) em L
1 é necessária para a progressão de células de G
1 para a fase S, o efeito de Casodex durante meados de L
1 sugeriu que o papel da AR na proliferação poderia ser a de regular a montagem de pré-RC. Para testar esta possibilidade, foi investigada a interacção entre a RA e Cdc6, um componente essencial do pré-RC em células LNCaP. AR co-localizados e co-imunoprecipitados com Cdc6 e tratamento Casodex interrompido essa interação. AR-imunoprecipitado (AR-IP) também continha E ciclina e ciclina A, que desempenham um papel crítico na montagem e ciclo de célula de entrada pré-RC em fase S, e ADN polimerase-α, PCNA, e a ribonucleótido-redutase, que são essenciais para a a iniciação da síntese de ADN. Além disso, em células em fase S, AR co-sedimentadas com componentes da maquinaria de replicação de ADN de células que entraram na fase S.
Conclusões /Significado
Em conjunto, estas observações sugerem um novo papel da AR como um componente da pré-RC de exercer controle sobre a progressão de células LNCaP de G
1 para a fase S através de um mecanismo que é independente de seu papel como um fator de transcrição
Citation:. Murthy S, Wu M, Bai VU, Hou Z, Menon M, Barrack ER, et al. (2013) Papel do receptor andrógeno na progressão das células LNCaP do cancro da próstata a partir de G
1 a S Fase. PLoS ONE 8 (2): e56692. doi: 10.1371 /journal.pone.0056692
editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |
Recebido: 16 de Agosto de 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 20 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Murthy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão W81XWH-05-1-0071 do Departamento de Defesa para GPR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é o câncer de pele não-mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de morte por câncer em homens americanos [1]. Andrógeno, através da activação do receptor de androgénio (AR), desempenha um papel importante tanto no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata. Assim, a ablação do andrógeno pela castração farmacológica ou cirúrgica [2] permanece terapia de primeira linha para o tratamento de câncer de próstata localmente avançado ou disseminada. No entanto, embora a doença regride inicialmente em resposta à ablação de androgénios, que, eventualmente, recai para se tornar resistente à castração [3], [4]. Notavelmente no entanto, apesar do uso continuado dessa estratégia de tratamento para mais de 70 anos, muito pouco se sabe sobre o mecanismo pelo qual AR regula a proliferação de células de câncer de próstata. Uma compreensão do mecanismo de acção do RA em proliferação podem conduzir ao desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o tratamento do cancro da próstata.
de crescimento resistente à castração de cancro da próstata é geralmente associada com um aumento da expressão de AR [5] , [6], [7]. AR permanece indispensável para a proliferação de células de cancro da próstata que se tornaram resistentes à castração; específicos do AR shRNA ou siRNA bloqueia a proliferação de células cancerosas da próstata AR-positiva resistente à castração [8] sensível androgénio, bem como, [9], [10], [11], [12]. Além disso, a micro-injecção de anticorpos específicos para AR para o núcleo ou o tratamento de células com ARNm de AR hammerhead ribozima inibe a proliferação de AR-positivas, mas não AR-negativo, células de cancro da próstata [13], que indica um papel crítico de AR na proliferação de células de cancro da próstata expressando AR. Curiosamente, o papel de AR na proliferação de células cancerosas da próstata parece ser independente da sua função como factor de transcrição, pelo menos em células de castração resistentes CWR22R3 próstata humana cancerosas (derivado do xenoenxertos de CWR22), em que a proliferação dependente de AR é ligando actividade de transcrição independente mas AR permanece dependente de ligandos [11]. Colectivamente, estas observações invocar a possibilidade de que, para além do seu papel como um factor de transcrição, a RA pode desempenhar um papel directo na eventos reguladores do ciclo celular necessários para a proliferação de células cancerosas da próstata. Um papel direto da AR na regulação da proliferação contrasta com a noção de um papel indireto na qual Ar atividade transcricional regula a expressão de fatores necessários para a progressão do ciclo celular.
progressão do ciclo celular da G
1 para a fase S é fundamental para a proliferação. Nós relatado anteriormente que Casodex (bicalutamida), um inibidor específico de AR, bloqueia a capacidade de G
uma fase de células cancerosas próstata LNCaP AR-positiva a entrar na fase S [14], [15], indicando um papel de AR nas progressão do ciclo celular da G
1 para a fase S. Progressão de células de G
1 para a fase S requer uma cascata de eventos sequenciais no G
1 fase que contribuem para a montagem da maquinaria de replicação do DNA em células que entram em fase S. Estes eventos incluem: a) o carregamento de Cdc6, replicação factor de licenciamento RLF-B /CDT1, e manutenção de mini-cromossoma (MCM) proteínas para o complexo de reconhecimento de origem (ORC) para formar complexo pré-replicação (pré-RC), e b) desenrolamento do DNA por helicase (Cdc45) associado com pré-RC, e o conjunto de enzimas de síntese de DNA para formar mega-complexos necessários para a iniciação da síntese de DNA na origem da replicação do DNA (ver Reddy et al [16] para uma revisão ).
neste estudo, nós investigamos se AR interage com os componentes de pré-RC e máquinas replicação do DNA. Os nossos estudos demonstram pela primeira vez que a RA é necessário em meados de L
1 fase, no momento quando o conjunto de pré-RC é conhecida a começar, a fim de células LNCaP de entrar na fase S, e que AR está associada com proteínas reguladoras do ciclo celular e enzimas da síntese de ADN em um complexo multienzimático isolado a partir de células em fase S. Estas observações sugerem o envolvimento de AR em proliferação através da sua interacção com proteínas reguladoras do ciclo celular e enzimas da síntese de ADN necessárias para o início da síntese do ADN e a progressão de células LNCaP de G
1 a S fase.
Materiais e Métodos
Cultura celular
células LNCaP foram mantidas em meio RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS), glutamina 2,5 mM, 100 ug /ml de estreptomicina , e 100 U /ml de penicilina (meio completo) numa incubadora humidificada com 5% de CO
2 e 95% de ar a 37 ° C.
Isolamento de ARN, a RT-PCR, e em tempo real de RT -PCR (qRT-PCR)
O ARN foi isolado a partir de controlo e Casodex células tratadas e submetido a RT-PCR para determinar a expressão de GAPDH e de PSA, tal como descrito anteriormente [14]. As sequências dos iniciadores utilizados para a PSA são: 5′-gcacccggagagctgtgt (avançar) e primers 5-gatcacgcttttgttcctgat (reverso), e para GAPDH são 5′-gagatccctccaaaatcaagtg (para a frente) e 5′-ccttccacgataccaaagttgt (reverso). GAPDH foi usada como um controlo interno. A densitometria das bandas de RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [14]. qRT-PCR foi realizada num Applied Biosystems 7500 rápida Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando ensaios de expressão de genes Taqman para a PSA (Ensaio Id: Hs02576345_m1) e 18S de ARN (Ensaio Id: Hs03928985_g1) como descrito anteriormente [17]. O nível relativo de expressão PSA foi quantificada usando comparativa ΔΔC
t com 18S RNA como controle interno.
Sincronização de Células LNCaP por isoleucina Privação
privação Isoleucina foi realizado pelo nosso anteriormente método de publicada [15]. As células foram cultivadas até 60% a 70% de confluência e, em seguida, o meio foi substituído com RPMI isento de isoleucina 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com 6% de FCS dialisado (Life Technologies, Carlsbad, CA), glutamina 2,5 mM, 100 ug /ml de estreptomicina, e 100 unidades /ml de penicilina. As células foram mantidas em meio isento de isoleucina durante 36 horas numa incubadora como acima. As células foram libertadas a partir isoleucina-block, substituindo o produto com o meio completo contendo 10% de FCS e tratado com Casodex (bicalutamida, presente da Astra Zeneca, Inglaterra, Reino Unido), conforme indicado
.
Desde a entrada de células em S fase é marcada pelo aparecimento de síntese de ADN, a progressão de células sincronizadas a partir de G
1 para a fase S foi monitorizada por determinação da capacidade das células para incorporar
3H-timidina no ADN como descrito anteriormente [14], [ ,,,0],15]. A intervalos regulares, após a libertação a partir de isoleucina-bloco, as células foram marcadas com impulsos-2 uCi /ml
3H-timidina (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) durante 30 minutos a 37 ° C numa incubadora humidif içada. A radioactividade incorporada no material de ácido-precipitável foi depois determinada como descrito [15].
Preparação de extractos celulares e imunoprecipitação
em crescimento exponencial de células LNCaP colhidas por raspagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram sedimentadas por centrifugação durante 10 minutos a 4 ° C a 2000 rpm numa centrífuga Sorvall RT7 e ressuspensas em imunoprecipitação tampão (IP) (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 0,1% de Triton X-100, 5 mM de EDTA, 250 mM NaCl, 2 mM CaCl
2, NaF 50 mM, e 0,1 mM de na
3VO
4), suplementado com um cocktail inibidor de protease (P-8340, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) a uma densidade de cerca de 1 × 10
7 células /ml. A suspensão de células foi então submetido duas vezes a 30 pulsos de ultra-sons utilizando um sonicador Branson 250 (Branson o Sonic Power Co., Danbury, CT), fixada a um controlo de saída de 2 e um ciclo de trabalho de 20, com arrefecimento em gelo intermitente. O extracto celular sonicada foi clarificado por centrifugação num Centrifugador Eppendorf 5415R a 6.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. A concentração de proteína em extractos de clarificado foi avaliada utilizando reagente de ensaio de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Para a imunoprecipitação, os extractos celulares foram diluídas 5 vezes em tampão IP suplementado com um cocktail inibidor de protease e incubados a 4 ° C durante a noite com 4 ug /ml de anticorpos anti-AR (AR-N20 ou Ar-441) ou anticorpos anti-Cdc6 (H-304) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Os complexos imunitários foram adsorvidos em seguida, a Pierce Proteína A /G agarose (Thermo Scientific, Filadélfia, PA) durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave. Os complexos adsorvidas foram lavadas três vezes com tampão de IP por centrifugação num Centrifugador Eppendorf 5415R a 6.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C, e em seguida eluiu-se com tampão de carregamento da página (Bio-Rad, Richmond, CA). imunoprecipitados de controlo foram preparados por utilização de 4 ug do rato purificada ou IgG de coelho (Antibodies Incorporated, Davis, CA) em vez de anticorpos anti-AR ou anti-Cdc6 /ml.
Isolamento de DNA Replication Fracção Complexo de Lisado Nuclear
células LNCaP sincronizadas no G
1 fase (1 hora após a saída da isoleucina-bloco) ou na fase S (24 horas após a liberação da isoleucina-bloco) foram colhidas e o lisado nuclear foi preparado por um ligeira modificação do método de Subramanyam et al [18]. As células recolhidas foram sedimentadas por centrifugação durante 10 minutos a 4 ° C a 2000 rpm numa centrífuga Sorvall RT7 e ressuspensas em tampão A [0,16 M de sacarose, Tris-HCl a 50 (pH 7,6), KCl 25 mM, MgCl 10 mM
2, HEPES 70 mM (pH 7,6), CaCl 0,025 mM
2, um fluoreto de fenilmetilsulfonilo mM (PMSF), DTT 2 mM, EDTA 1 mM] a uma densidade de 2 × 10
7 células /ml. A suspensão de células foi então homogeneizada num homogeneizador Wheaton accionado por um motor (Wheaton Co., Wheaton, IL) até ~ 90% das células foram coradas com azul de tripano de corante (geralmente três batidas a uma configuração de rotação de 3). O sobrenadante citosólico foi em seguida separada a partir da pelete nuclear por centrifugação num Centrifugador Eppendorf 5415R a 6.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. O sedimento nuclear foi suspenso num volume igual de tampão A ao usado para a homogeneização e submetida duas vezes a 30 pulsos de ultra-sons com um sonicador Branson 250 (Branson Co., Danbury, CT), fixada a um controlo de saída 2 e um ciclo de trabalho de 20, com arrefecimento intermitente em gelo. O extracto nuclear sonicada foi clarificado por centrifugação num Centrifugador Eppendorf 5415R a 6.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. A fracção complexo de replicação de ADN foi depois isolado por sujeição do lisado nuclear para centrifugação de gradiente de densidade de sacarose, essencialmente como descrito por Reddy e Pardee [19]. lisado Nuclear (0,5 ml) foi colocado em camadas sobre um gradiente linear de 4,8 mL 20-40% (p /vol) de sucrose em tampão A, que por sua vez foi colocado em camadas sobre uma almofada de sacarose a 66% (0,5 ml) e centrifugado numa Beckman SW 50.1 rotor a 4 ° C durante 16 horas a 35.000 rpm. O gradiente foi então resolvida em fracções de 0,5 ml e a fracção rápida sedimentação que continham actividade de polimerase de ADN é referida como a fracção complexo replitase como descrito por Reddy Murthy e [20]. A fracção complexo de G
1 ou células em fase S foi em seguida submetido a análise de Western blot para avaliar a presença de enzimas de proteínas reguladoras de síntese de DNA e do ciclo celular.
Análise Western Blot
As amostras foram dissolvidas em tampão de carregamento da página (Bio-Rad, Richmond, CA) e submetidos a electroforese de desnaturação a 10% de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida, transferido para membranas de nitrocelulose. membranas individuais foram sondadas com anticorpos contra a AR (AR-N20 ou AR-441), Cdc6 (H-304), antigénio específico da próstata (PSA, C-19), lamina B, ADN polimerase-α (STK1), PCNA (PC10 ), ribonucleótido-redutase (R2, E-16), ciclina A (H-432), ciclina E (C-19) (todos a partir de Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27
Kip-1, ciclina B (BD Transdução Lab, San Jose, CA), caspase 3 (Sinalização celular, Danvers, MA), ou GAPDH (Chemicon, Temecula, CA). bandas imuno foram desenvolvidos utilizando anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e SuperSignal WestPico substrato quimioluminescente (Pierce, Rockfold, IL) e visualizada utilizando filme de raios-X.
imunofluorescência coloração e microscopia confocal
células LNCaP crescido em lâminas de vidro foram lavadas uma vez com PBS, seguido de fixação em 3,7% (vol /vol) de formaldeído durante 20 minutos a 22 ° C. As células foram permeabilizadas em 0,5% (vol /vol) Triton X-100 durante 15 minutos e bloqueadas durante 1 hora em 2% (p /v) de BSA a 22 ° C. As lâminas foram então incubadas durante 1 hora a 22 ° C com anticorpos contra a AR (AR-N20 ou AR-441) e Cdc6 ou ADN polimerase-α seguido por ambas isotiocianato-cabra-anti-rato fluoresceína (FITC) – e de cabra anti -rabbit-tetrametilrodamina B isotiocianato (TRITC) marcado com anticorpos secundários (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Depois de quatro lavagens com PBS, as lâminas foram montadas com Aqua-Poly /Mount (Polysciences Inc., Warrington, PA). A microscopia confocal de varrimento laser foi realizada com um Zeiss LSM 410 microscópio confocal vertical. As imagens foram processadas, e análise de co-localização (que é de cor amarela) foi realizada com um sistema de meta Excitação Zeiss LSM 410 com recolha a 488 e 543 nm. Intensidade Correlação Quotient (ICQ) Análise de quantificar AR co-localização com Cdc6 ou DNA polimerase-α foi realizada usando software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).
Detecção de imunofluorescência de Bromodeoxyuridine (BrdU) incorporado no ADN
células LNCaP crescidas em lâminas de vidro foram marcadas com 10 uM de BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 30 minutos, lavadas uma vez com PBS e fixadas em formaldeído a 3,7% durante 20 min a 22 ° C. As células foram permeabilizadas em 0,5% (v /v) de Triton X-100 durante 15 min e bloqueadas durante 1 hora em 2% (w /v) de albumina de soro bovino a 22 ° C. As células foram então coradas com anticorpos monoclonais de ratinho contra BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguida de anticorpo secundário de cabra anti-ratinho marcado com FITC. As lâminas foram montadas com Vectashield montagem Medium contendo DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e fotomicrografia foi realizada com um microscópio Zeiss Axiofot equipado para epifluorescência.
Resultados
Utilização de Casodex para determinar o papel de AR no ciclo celular de células LNCaP sincronizada
AR knockdown estratégias foram utilizadas para demonstrar que a RA é necessário para a proliferação de células de cancro da próstata [8], [9], [10], [11], [12]. No entanto, AR knockdown por siRNA ou shRNA requer o tratamento de células de cancro da próstata ao longo de um período de vários dias. Assim, esta abordagem não pode ser utilizado para identificar quando no ciclo celular (ou seja, G
1, S, ou L
2 /M fases) Ar é necessário para a proliferação de células LNCaP, uma vez que cada fase do ciclo celular não dura mais do que algumas horas. Portanto, utilizou-se o Casodex anti-andrógeno não-esteróides (bicalutamida) para inibir selectivamente e de forma aguda AR, a fim de determinar o papel de AR na progressão das células LNCaP sincronizados através de G
1 e S fases.
Casodex é geralmente utilizada em 10 a 20 uM para inibir a actividade de transcrição induzida AR-andrógeno; mas nessas experiências, as células estão em soro despojado com carvão (CSS) forma molecular contendo [21], [22]. No entanto, células sincronizadas introduzidas em meio contendo CSS não irá avançar através do ciclo celular. Comparou-se a eficácia de Casodex sobre a expressão do antigénio específico da próstata (PSA), um gene de AR-alvo específico [23], em células LNCaP no meio FCS- vs CSS-. Andrógeno-privação de células em CSS médio diminuiu a expressão do PSA para ~ 50% do que nas células de controlo em meio FCS-Casodex e causou uma redução ainda maior (Figs. 1A e 1B). Casodex em 75-100 uM em meio FCS-teve o mesmo efeito na expressão de PSA como Casodex 25-50 uM em CSS-forma (Figs. 1A e 1B). Nomeadamente, quando a resposta dependente da dose a Casodex é traçada em relação ao seu próprio controlo (em FCS versus CSS), as curvas de sobreposição, indicando que o IC
50 para inibir a actividade de AR é ≈50 uM Casodex em qualquer ou FCS CSS (Fig. 1C). As células tratadas com 100 uM Casodex em FCS-forma eram morfologicamente semelhantes aos tratados com 20 uM Casodex em CSS-forma, e 100 uM Casodex em FCS-forma não causou morte celular visível, tal como determinado pelo método de exclusão de azul de tripano (dados não mostrando). Portanto, utilizou-se 100 uM Casodex, uma concentração máxima eficaz para inibir a actividade de AR, para determinar o papel de AR na proliferação de células de LNCaP em FCS-forma. Esta concentração é semelhante ao utilizado para inibir a expressão de PSA ou crescimento de células LNCaP na presença de FCS a [24], [25], [26].
em crescimento exponencial de células LNCaP foram lavadas duas vezes com sérica e meio isento de hormonas e transferidas para meio RPMI contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) ou soro despojado carvão a 6% (CSS). Após 24 horas, foi adicionado Casodex e as células foram incubadas durante um período adicional de 24 horas. ARN isolado a partir de células tratadas e de controlo Casodex foi submetido a análise de qRT-PCR de PSA e de RT-PCR como descrito em Materiais e Métodos. produtos (A) RT-PCR de PSA e GAPDH separados em gel de agarose a 1%. A relação de densidade de PSA banda /GAPDH (relação P /L) de células em FCS sem Casodex foi ajustado a 1,0 e a relação P /L de outras condições de tratamento é expressa relativamente a este controlo. (B) os níveis de PSA relativo, tal como determinado por qRT-PCR, são representados como uma função da concentração de bicalutamida. E (C) os níveis de PSA em relativos fig. 1B são representados como uma percentagem do controlo sem Casodex calculados separadamente para FCS- e forma CSS-. círculo fechado, FCS-médio; e círculos abertos, CSS-médio. Os dados são representativos de duas experiências independentes.
LNCaP entrada de célula em S fase requer AR funcional durante Mid-G
1 Fase
Nós temos mostrado previamente que as causas de privação isoleucina células LNCaP para prender no G
0 /G
1 fase [15], [27]. Após a liberação da isoleucina-block, ou seja, transferir para meio completo contendo FCS (FCS-médio), essas células progredir através de G
1 e entrar na fase S 12 horas após o lançamento, e atingir um pico de fase S 10-12 horas depois [15]. Também mostramos que o tratamento Casodex durante 24 horas a partir do momento da introdução de isoleucina-bloco anula a capacidade das células para entrar na fase S [14], [15]. Enquanto isto sugeriu um papel de AR no ciclo celular, que o design experimental não pode distinguir entre um papel de AR em fase L
1 S vs. Por conseguinte, a fim de distinguir entre um efeito inibidor de bicalutamida em G
1 vs em fase S, nós tratamos sincronizadas células LNCaP com Casodex a partir de 0, 4, 8, 12, ou 16 horas após a libertação a partir de isoleucina-bloco , e determinou-se a capacidade das células para incorporar
3H-timidina (
3H-TdR) em 20 horas após a libertação, num momento em que as células de controlo estão em fase S (ver esquema da Fig. 2A). Como mostrado na Fig. 2A, Casodex maximamente inibida
3H-TdR, se adicionados a qualquer momento durante o G
1 fase (isto é, 0, 4 ou 8 horas após a liberação), indicando um papel de AR no G
1. Por outro lado, o efeito Casodex foi atenuada se o tratamento foi adiada até 12-16 horas após o lançamento de isoleucina-bloco, num momento em que as células já se comprometeram a entrar na fase S. tratamento Casodex de células que já tinham entrado na fase S (16 horas após a saída da isoleucina-block) tiveram muito pouco efeito sobre
3H-TdR (Fig. 2A). Assim, o efeito inibidor de Casodex ocorre em L
1 fase, quando as células estão a preparar a entrar na fase S, e não na fase S. Portanto, AR é necessária em L
1 para as células a entrar na fase S.
As células LNCaP foram sincronizadas por isoleucina-privação e lançado em meio completo. A) Casodex foi adicionado no momento indicado após a saída da isoleucina-bloco e mantida no médio até
3H-TdR foi determinada em 20 horas após a liberação da isoleucina-bloco. Os resultados são expressos como percentagem de
3H-TdR nas células de controlo que foram libertados em meio completo na ausência de bicalutamida. A) Casodex foi adicionado durante um período de 4 horas, como mostrado no painel de topo, e
3H-timidina (
3H-TdR) incorporação no ADN foi determinada a cada 4 horas após a libertação a partir de isoleucina-bloco e depois da remoção de Casodex. Cada ponto de dados representa a média de amostras em triplicado com 10% de variação; dados mostrados são representativos de duas experiências independentes.
Nós, então, determinado quando em L
1 fase Casodex é mais eficaz na supressão da entrada de célula em fase S. Nós pulsação trataram células LNCaP sincronizado com Casodex durante o primeiro, segundo ou terceiro de 4 horas de intervalo após a libertação de isoleucina-block, correspondente ao início do G
1, mid-G
1, ou late-G
1, respectivamente, e determinou-se a taxa de
3H-TdR incorporação no ADN em intervalos de 4 horas durante 24 horas (ver esquema da Fig. 2B). Nós mostramos anteriormente que
3H-TdR oferece um método de confiança e reprodutível para monitorizar a progressão de células sincronizadas a partir de G
1 para a fase S e é corroborada por análise de citometria de fluxo, bem como a expressão de S fase- ciclinas específicas e a activação de quinases dependentes de ciclina [14], [15]. Como mostrado na Fig. 2B, o tratamento com Casodex durante mid-G
1 (4-8 horas após a saída da isoleucina-bloco) foi mais eficaz em bloquear a entrada na fase S do que o tratamento durante a primeira-G
1 (0-4 horas após a saída da isoleucina-block) ou tardia-G
1 fase (8-12 horas após a libertação da isoleucina-bloco). Isto sugere o envolvimento AR em eventos reguladores do ciclo celular em meados de G
1 fase que são essenciais para as células LNCaP para o progresso do G
1 a S.
Interage AR com Cdc6, um componente crítico de pré-RC necessária para a Assembleia da replicação Maquinaria em fase S células LNCaP
uma vez que o tratamento Casodex em meados de G
1 bloqueou a capacidade das células LNCaP sincronizados para entrar na fase S (Fig. 2), testaram se AR interage com as proteínas reguladoras do ciclo celular envolvidas na montagem de pré-RC, como montagem de pré-RC em meados e final-G1 é necessária para que as células entram na fase S e iniciar a síntese de DNA. Cdc6 se ligar ao complexo de reconhecimento origem (ORC) é o primeiro passo no processo de montagem de pré RC [16]. Observou-se que um imunoprecipitado preparado utilizando anticorpos específicos para cada Cdc6 (Cdc6-IP) contido AR, sugerindo que a interacção com Cdc6 AR (Fig. 3A). Esta interacção é específica uma vez que uma das proteínas mais abundantemente expresso, antigénio específico da próstata (PSA), em células LNCaP, não foi associada com Cdc6-IP (Fig. 3A). Nós mostramos anteriormente que a interacção entre as proteínas e enzimas da síntese de ADN reguladoras do ciclo celular numa variedade de células conduz à montagem de um complexo multienzimático chamado replitase ou maquinaria de replicação de ADN [28], [29], [30]. Estes complexos são facilmente detectáveis em células que estão na fase S, mas não em qualquer altura durante a fase G1 [29], [30]. Portanto, testou-se a AR-Cdc6 interacção é um fenómeno dependente do ciclo celular. Como mostrado na Fig. 3B, embora a Cdc6 estava presente a um nível baixo em G
células de uma fase, a sua associação com AR-IP foi visto em células LNCaP sincronizados que estavam em fase S, mas não nos que foram em G
1 fase. Por comparação, lamina B, uma proteína nuclear, mostraram muito pouca diferença na sua associação com AR-IP a partir de G
1 vs. células em fase S (Fig. 3B). Assim, AR exibe uma interacção dependente do ciclo celular com Cdc6.
A) Cdc6-IP foi preparado a partir de células de LNCaP em crescimento exponencial e foi submetido a análise de transferência de Western. B) AR-IPs foram preparados a partir sincronizado G
1 fase (uma hora após a libertação da isoleucina-bloco) ou fase S (20 horas após a libertação a partir de isoleucina-bloco) células LNCaP, e sujeitas a análise de Western blot. IgG de cadeia pesada em AR-IP e IgG-IP é indicado pela seta.
Casodex Disrupts AR-Cdc6 Interação
Desde AR está implicada a desempenhar um papel na regulação da expressão Cdc6 [14], [31], foi testado se o bloqueio induzido-Casodex da entrada de células LNCaP na fase S é devido a uma diminuição dos níveis de proteína Cdc6. Na verdade, nas condições experimentais empregadas no presente estudo, Casodex não teve qualquer efeito perceptível em ambos os níveis de proteína AR Cdc6 ou em células LNCaP crescimento exponencial (Fig. 4a, de entrada). No entanto, Casodex interrompido interacção AR com Cdc6, tal como indicado pela presença de Cdc6 em AR-IP de células de controlo, mas não no de células tratadas Casodex (Fig. 4A, AR-IP). Esta perturbação induzida por Casodex associação de AR com Cdc6 foi ainda apoiada por microscopia confocal (Fig 4B.); observou-se uma diminuição notável na co-localização de AR com Cdc6 nos núcleos das células tratadas Casodex (ICQ = 0,059 ± 0,022 SD), em comparação com células de controlo (ICQ = 0,152 ± 0,047 SD). Assim a supressão, induzida por Casodex da entrada de células de LNCaP em fase S está associada com a interrupção da interacção AR-Cdc6.
A) em crescimento exponencial de células LNCaP foram tratados com Casodex ou veículo (controlo) durante 24 horas e AR-IP preparado a partir de células tratadas e de controlo foi sujeito a análise de transferência de Western para detectar AR e Cdc6. células B) LNCaP crescidas em lâminas foram sincronizadas por privação-isoleucina e libertado para meio completo na presença do veículo (controlo) ou Casodex. Ao fim de 24 horas após a libertação a partir de isoleucina-bloco (quando se espera que as células de controlo para entrar na fase S), as células foram fixadas e processadas para coloração immunoflourescent utilizando anti-AR (AR-441) anticorpo monoclonal de ratinho e anti-Cdc6 coelho (H-304) policlonais.
AR interage com S Fase ciclinas
Além Cdc6, algumas das proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como ciclinas e e a, também desempenham um papel importante na montagem de pré-RC em L
1 [16]. Portanto, testou-se a AR interage com qualquer das ciclinas que são conhecidos por estar envolvidos na progressão das células a partir de G
1 para a fase S (viz., Ciclinas E e A) e G
2 /H ( viz., ciclina B) fases em células LNCaP. Observou-se que a ciclina E e ciclina A, mas não uma ciclina mitótica, ciclina B, foram associados com AR-IP preparado a partir de células de LNCaP em crescimento exponencial (Fig. 5). Por comparação, a GAPDH, um marcador citosólica, não foi associada com AR-IP. Assim, AR exibe uma interacção específica com as proteínas reguladoras do ciclo celular que estão envolvidos na regulação da entrada de células em fase S.
AR em IP preparados a partir de células de LNCaP em crescimento exponencial foi submetido a análise de transferência de Western.
Interage AR com as enzimas do DNA síntese |
Uma vez que a montagem CDC-6 dependente da pré-RC leva ao recrutamento de enzimas de síntese de DNA para os sítios de replicação do DNA [16], e desde AR interage com Cdc6 (Fig. 3), foi testado se AR-IP também contém enzimas da síntese de ADN. Como mostrado na Fig. 6, observou-se que a RA-IP preparadas utilizando dois anticorpos diferentes AR (AR-AR-N20 e 441) continha DNA polimerase-α, uma enzima chave envolvida na iniciação da síntese de ADN (Fig. 6A). interação AR com DNA polimerase-α foi ainda confirmada por microscopia confocal immunoflourescent (Fig 6B.); observou-se uma forte co-localização de AR com ADN polimerase-α (ICQ = 0,45 ± 0,016 SD) nos núcleos das células LNCaP. Além de ADN polimerase-α, AR-IP preparado utilizando anticorpos AR-441 e Ar-N20 continham antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA), uma proteína auxiliar de ADN-polimerase, e a subunidade catalítica de ribonucleótido-redutase (RNR2), que converte ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos requeridos para a síntese de ADN (Fig. 6C). Em adição ao seu papel na proliferação de [8], [9], [10], [11], [12], Ar é também relatado que desempenham um papel crítico na sobrevivência de células LNCaP, como AR knockdown leva a morte celular por apoptose [32]. Portanto, nós testamos se o papel da AR na regulação da apoptose envolve também a sua interacção com proteínas apoptóticos. Como mostrado na Fig. 6A, a caspase-3, uma enzima apoptótico, não foi detectada em AR-IPs. Assim, AR exibe uma interacção selectiva com as enzimas de síntese de ADN necessário para a proliferação de células LNCaP.
AR em IP contém ADN polimerase-α. AR-IP preparados a partir de células de LNCaP em crescimento exponencial, usando anti-AR monoclonal de ratinho (441) ou anticorpo policlonal de coelho (20) N-anticorpos foi submetido a análise de transferência de Western. B) Ar é co-localizada com o ADN polimerase-α em células LNCaP. Exponencialmente o crescimento de células de LNCaP em lâminas foram fixadas e coradas com anti-AR (N-20) policlonal de coelho e anticorpos monoclonais de ratinho anti-polimerase ADN-α (STK1) e microscopia confocal foi realizada. C) AR-IP contém PCNA e ribonucleótido-redutase.