Abstract
Fundo
Acloridria causado por exemplo gastrite atrófica permite o sobre-crescimento bacteriano, o que induz a inflamação crónica e os danos para as células da mucosa dos indivíduos infectados condução malignidades gástricas e cancro.
Enterococcus faecalis
(
E. Faecalis
) podem colonizar estômagos achlohydric e, portanto, queria estudar o impacto da
E. infecção faecalis
na resposta inflamatória, espécies reativas de oxigênio (ROS) de formação, respiração mitocondrial, e estabilidade genética mitocondrial em células da mucosa gástrica.
Métodos
Para separar as mudanças induzidas por bactérias de aqueles das células inflamatórias estabelecemos um
in vitro de E. faecalis
sistema modelo de infecção usando a linha celular de carcinoma gástrico MKN74. Total de ROS e superóxido foi medida por microscopia de fluorescência. consumo de oxigênio celular foi caracterizado de forma não invasiva utilizando ventilometria base XF24 microplaca. A expressão de genes foi examinada por microarranjo, e vias de resposta foram identificados por Gene Conjunto de Análise (GSA). transcritos de genes seleccionados foram verificadas por reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR). mutações mitocondriais foram determinadas por sequenciação.
Resultados
A infecção de células MKN74 com
E. faecalis
induzida produção intracelular ROS através de um independente via da fosforilação oxidativa (FOX). Além disso,
E. faecalis
infecção induzida instabilidade do DNA mitocondrial. Após a infecção, os genes que codificam para proteínas de resposta inflamatória foram transcricionalmente regulado para cima, enquanto genes de controle de reparação de danos e do ciclo celular de DNA foram regulados negativamente. O crescimento celular abrandou quando infectadas com viável
E. faecalis Comprar e respondeu de uma forma dependente da dose a
E. faecalis
lisado.
Conclusões
A infecção pelo
E. faecalis
induziu uma resposta intracelular ROS independente de OXPHOS e danificou o genoma mitocondrial em cultura de células gástricas. Finalmente as bactérias induziu uma resposta inflamatória NF-kB, bem como prejudicada resposta a danos do DNA e do ciclo celular expressão do gene controle.
Transcrição profiling
Matriz Expresso número de acesso E-MEXP-3496.
Citation: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O, et al. (2013)
Enterococcus faecalis
infecção provoca inflamação, intracelular OXPHOS-Independent ROS Produção, e danos no DNA em células de câncer gástrico humano. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147
editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 28 de agosto de 2012; Aceito: 02 de abril de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Strickertsson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. AMDM é apoiado por uma bolsa da Ciência Português, Fundação de Tecnologia. LFH é suportado pelo MRC dinamarquesa. Jabs é suportado pelo dinamarquês Cancer Society, e da Universidade de Copenhague SUND. TMB e OW são apoiados por uma bolsa da Fundação Nordisk Novo para o Centro de Bioinformática. CD e LJR são suportados por NORDEA-Fonden. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico está entre os dez tipos de câncer mais comuns, e com uma taxa de mortalidade anual global de cerca de 700.000, é a segunda causa mais comum de mortalidade relacionada com o cancro [1]. O câncer gástrico tipo intestinal desenvolve através de uma série de eventos patológicos começando com inflamação crônica, gastrite atrófica, metaplasia intestinal, e, finalmente, câncer [2].
A inflamação crônica e câncer tem sido associada em diversos estudos de pacientes e de ratinhos geneticamente modificada, e acredita-se estar envolvida na patogénese de cerca de 25% de todos os casos de cancro em todo o mundo [2] – [4]. Características de inflamação relacionada com o cancro incluem a presença de quimiocinas e citocinas em tecidos de tumor, tendo o potencial para estimular a proliferação de células de tumor e a sobrevivência de células malignas [5], [6]. A inflamação crônica também favorece uma superprodução de DNA danificar espécies reactivas de oxigénio (ROS), cuja produção pode ser incidental a fosforilação oxidativa (FOX) reações nas mitocôndrias ou produzido a partir de fora das mitocôndrias mais comumente por fosfato de adenina nicotinamid (dependente do OXPHOS) ( NADPH) oxidase (independente OXPHOS-) (para revisão ver [7] – [9]). produção crónica de causa danos de ADN ROS, permitindo a acumulação de mutações que por sua vez podem activar oncogenes e /ou inactivar genes supressores tumorais, aumentando assim o risco de desenvolvimento do cancro [3].
O factor de risco mais comum para o desenvolvimento câncer gástrico é a infecção bacteriana crônica do estômago com o
Helicobacter pylori
(
H. pylori
) [10]. A infecção crónica do estômago pelo
H. pylori
afectar o equilíbrio do pH gástrico e podem causar ou acloridria hipercloridria [11]. Embora esta bactéria é classificado como um carcinógeno uma classe, não está sempre associada a um risco aumentado de desenvolvimento de cancro gástrico. Por exemplo,
H. pylori
infectado pacientes com úlceras duodenais e altos níveis de ácido gástrico têm um risco reduzido de desenvolver câncer gástrico em comparação com os da população em geral [11] – [13]. Em contraste, pacientes com gastrite atrófica e reduzida secreção de ácido gástrico têm um risco aumentado de desenvolver cancro gástrico [11], [13], [14]. O aumento do risco de cancro nos indivíduos achlorhydric podia ser devido ao crescimento excessivo de bactérias das outras bactérias no lúmen gástrico [15]. Em ambos os seres humanos achlorhydric e modelos animais gastrite bacteriana crescimento excessivo causa crónica que se desenvolve em metaplasia intestinal e câncer gástrico, finalmente [16] – [18]. Entre as bactérias encontradas no estômago de ratos foram achlorhydric
Enterococos
espécies, que são cocos Gram-positivos capazes de sobreviver em ambientes com um pH tão baixo quanto 4,5 [19], [20].
Enterococcus faecalis
(
E. Faecalis
) é um membro da microbiota comensal humana e uma das bactérias mais comuns do trato gastrointestinal [19]. Apesar disso,
E. faecalis
pode actuar como um agente patogénico humano [21], e foi encontrado em aumento significativo em números de lesões cancerosas da boca e nos cancros do cólon humanos [22], [23]. Em relação a este
E. faecalis
é capaz de produzir N-nitrosaminas e de induzir instabilidade genética em células epiteliais do cólon através de danos oxidativos do ADN [24], [25].
Gastrite está associado com a infiltração de células imunitárias no tecido, o que faz com que seja difícil para dissecar a acção das células do sistema imunológico do que as células de mucosa
in vivo
. Por isso, usou um
in vitro
modelo de cultura de tecidos que nos permitiu examinar como isolado células da mucosa responder a bactérias e os mecanismos moleculares pelos quais as bactérias intestinais, tais como
E. faecalis
induzir danos em células epiteliais gástricas. Usando esse modelo que examinou o impacto da
E. faecalis
infecção de culturas de células de adenocarcinoma gástrico sobre a produção de ROS, a respiração celular, crescimento, DNA dano /reparação e respostas inflamatórias.
Materiais e Métodos
Cultura de Células,
E. faecalis
, e condições de crescimento
MKN74 humano culturas de células de adenocarcinoma gástrico da Colecção japonesa de banco de células de pesquisa Bioresources (JCRB # JCRB0255) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml de estreptomicina, e 100 U /ml de penicilina (Invitrogen) a 37 ° C, e 5% de CO
2 atmosfera humidificada. Infecções foram realizadas com
E. faecalis
(ATCC 29212). As bactérias foram cultivadas em placas de 5% de agar de sangue a 37 ° C. A densidade óptica (OD) de bactérias cultivadas em meio RPMI 1640 foi medida a 550 nm num espectrofotómetro de UV-1601 (Shimadzu, Quioto, Japão) (Figura S1).
E. faecalis
ligado foi preparado por congelamento /descongelamento a suspensão bacteriana três vezes, enquanto sonicação a suspensão entre cada ciclo.
A infecção de células gástricas para RNA e DNA isolamento
Durante 24 infecções h , 80% de células MKN74 confluentes foram lavadas com PBS e incubadas em meio isento de antibiótico. colónias de
E durante a noite adulto. faecalis
foram adicionados à cultura de células MKN74 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50 bactérias por célula. 5 dia infecções foram levadas a cabo por tratamento de 65% de células confluentes com MKN74
E. faecalis
a uma MOI de 10 ou com uma concentração de proteína de lisado de 40 ug /uL. A cada 24 horas, as células foram lavadas com PBS e meio fresco e foram adicionadas bactérias ou lisado. As células de controlo foram tratados de forma semelhante na ausência de bactérias ou lisado bacteriano.
In vitro
estudos foram realizados utilizando uma linha de células de câncer gástrico para testar o efeito prejudicial de
E. faecalis
em células de adenocarcinoma gástrico. Estas células diferem das células normais epiteliais gástricas através da realização de várias aberrações cromossómicas, mas oferecem a vantagem de ser um sistema modelo reprodutível, que em muitos aspectos se replica os eventos que ocorrem no estômago. Comparando as células infectadas para células não infectadas proporciona uma imagem fiável do dano e alterações na expressão génica causada pela infecção.
ARN e ADN isolamento
Após a infecção, o ARN e o ADN foram extraídos por adição de Reagente Trizol (Invitrogen) a cada frasco de cultura. O ARN foi isolado de acordo com o protocolo dos fabricantes. A fase intermédia contendo ADN foi precipitado por adição de etanol a 100%. As amostras foram centrif usadas a 4 ° C, 3500 g durante 6 min. O sobrenadante fenol-etanol foi removido e a extracção do ADN remanescente foi feito usando um kit de tecido NucleoSpin (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). As concentrações de RNA e de DNA foram medidos num NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. números de integridade de RNA foram medidos em um 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) de acordo com o protocolo de fabrica.
Medição de ROS e superóxido
Dois dias antes da infecção 8 × 10
4 MKN74 células foram colocadas em cada poço de um Lab-Tek
TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). células MKN74 foram coradas durante duas horas antes da infecção com mistura de detecção 2-Plex. ROS e superóxido coloração foi realizada utilizando o ROS /RNS Kit de Detecção (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nova Iorque) de acordo com as instruções do fabricante. células MKN74 foram infectadas a uma MOI de 50 durante 30 min e analisadas num microscópio confocal Zeiss LSM 510 usando o software de LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Não infectado manchado MKN74 células foram utilizadas como controlos negativos.
Localização de
E. faecalis
durante a infecção
8 × 10
4 MKN74 células /poço foram semeadas em uma lâmina de vidro de fundo de 8 câmaras (Thermo Fisher Scientific), 24 horas antes da coloração. A fim de identificar a localização de
E. faecalis
após a infecção nós manchado separadamente da membrana plasmática com CellMask
mancha membrana plasmática TM Deep Red (C10046, Invitrogen) e da parede celular bacteriana usando BacLight
TM verde mancha bacteriana (sondas B-35000, Molecular, Invitrogen) de acordo com os dois protocolos respectivamente. As células e as bactérias foram lavadas 3 vezes em PBS antes da infecção. As células foram infectadas a uma MOI de 100 durante 4 horas e analisadas num microscópio confocal Zeiss LSK 510 usando o software de LSM 510 (Zeiss). Esta experiência foi repetida três vezes e 8 champers foram examinados a cada vez.
XF24 microplacas ventilometria
Respirometria de células MKN74 foi realizada utilizando um XF24 Extracelular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Metade das células MKN74 plaqueadas foram infectados com
E. faecalis
a uma MOI de 50 durante 4, 8 ou 24 horas, enquanto a outra metade foi deixada não infectado. Após a incubação, as bactérias foram removidos usando 4% de Penicilina /estreptomicina (5 U /ml) e 4% cefotaxima (100 ug /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburgo, Bélgica). As células foram incubadas numa CO
2 incubadora livre a 37 ° C durante 1 hora para permitir que a temperatura e o pH de equilíbrio. A microplaca com células foi então carregado para o XF24 e a taxa de consumo de oxigénio de cada poço foi medido ao longo de um período de 100 minutos. As drogas oligomicina (0,5 uM), FCCP (0,3 uM) e antimicina A (2,0 uM) foram, por sua vez adicionados a cada poço. Mais detalhes estão disponíveis em S1 Arquivo.
Instabilidade DNA mitocondrial
A frequência de mutações na região D-loop ininterrupto de DNA mitocondrial, foram determinados por PCR utilizando os iniciadores de amplificação C6-CA5 (Tabela S1 ). Os fragmentos amplificados foram clonados no vector pCR2.1 (Invitrogen) e pastilhas de 328 colónias foram amplificados utilizando os iniciadores VectorD-ansa (Tabela S1). Os fragmentos amplificados foram purificados e sequenciados utilizando o Kit de Sequenciação do Ciclo de ABI Prism BigDye Terminator e um ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Para determinar mutações, as sequências foram usados como consultas contra a sequência de referência Cambridge obtido a partir MitoMap (https://www.mitomap.org. Acessado fevereiro 9. 2012).
Microarray e GSA
RNA com um número de integridade do RNA de 8 ou acima de três controle e três amostras de infecção (com viável
e. faecalis
ou com
e. faecalis
lisado 40 mg /mL) durante 24 horas e 5 experimentos dia foram submetidos ao RH Microarray Center no Hospital Universitário de Copenhague. O ARN foi amplificado e marcado utilizando o “kit de 3 IVT expresso (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. 250 ng de ARN total foi utilizado como entrada. As amostras marcadas foram hibridadas com GeneChip Genome U133 mais 2 matrizes (Affymetrix). As matrizes foram lavadas e coradas com estreptavidina conjugada phycoerytrin usando um Affymetrix Fluídica Station® 450, e as matrizes foram digitalizadas num digitalizador de Affymetrix GeneArray® 2500 para gerar imagens fluorescentes, como descrito no protocolo Affymetrix GeneChip®. 24 arquivos de intensidade de células-primas (CEL-arquivos) foram gerados no GeneChip® Comando Console® Software (AGCC) (Affymetrix). O CEL-arquivos brutos foram disponibilizados ao público em ArrayExpress com o número de acesso E-MEXP-3496. Pré-processamento de microarrays para a análise conjunto de genes (GSA) foi feito com R /Bioconductor [26], [27]. ajuste de fundo, a normalização quantil e resumo final para sondar estabelecidas intensidades de expressão foi realizada pelo algoritmo GCRMA [28] para cada condição experimental, separadamente (S2 Arquivo).
quantitativa transcrição reversa PCR
cDNA foi sintetizado utilizando SuperScript First-Strand III Síntese SuperMix para qPCR (Invitrogen). a expressão do gene foi analisada por qRT-PCR utilizando SYBR Greener Q-PCR SuperMix para ABI Prism (Invitrogen). Os iniciadores foram concebidos utilizando o software Primer-explosão do NCBI [29]. As reacções foram corridas num ABI PRISM 7900HT Sistema de Detecção de Sequência (SDS) a partir de Applied Biosystems. Os dados foram normalizados para a expressão de ARNm de GAPDH.
ensaio de crescimento
8000 células foram distribuídos em cada cavidade de seis placas de 24 poços e incubadas a 37 ° C e 5% de CO
2 para dois dias antes do tratamento. As células foram tratadas em quadruplicado como se segue; 4 poços de células de controlo não infectadas, 4 poços tratadas com 400 ug /ul
E. faecalis
lisado, 4 poços tratados com 40 � /ul de lisado, 4 poços tratados com 4 ug /ul de lisado e 4 poços tratados com viável
E. faecalis
em um MOI de 10. Uma placa de células foi fixada a cada dia. A fixação foi realizada por lavagem com PBS e fixação com 1 ml de formalina a 10% durante 10 min. As células fixadas foram coradas com 1 ml de 0,1% de violeta de cristal (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), e as placas foram agitadas durante 30 min. As células foram lavadas, secas, e violeta de cristal foi extraída com ácido acético a 500 ul de 10%. A absorvância foi medida a 620 nm em um PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).
Análise Estatística
análise de classificação único de variância (ANOVA) foi utilizada para testar diferenças na capacidade respiratória máxima , o volume de ATP eo consumo de oxigênio independente de OXPHOS. ANOVA foi ainda utilizada para testar diferenças no crescimento celular durante diferentes tratamentos com
E. faecalis
. Quando a análise de variância indicou diferenças significativas entre os tratamentos, Tukey método honestamente significativa foi usada para testar diferenças entre as taxas de consumo de oxigênio ou número de células. frequências de mutação do mtDNA foram avaliadas por qui-quadrado e exato de Fisher. ROS resultados foram expressos como valores médios de, pelo menos, vinte medições independentes e analisados por desemparelhado de duas caudas
t
-test. resultados de qRT-PCR foram expressos como valores médios de pelo menos três experiências independentes medidos em três repetições técnicos, e analisados por desemparelhado de duas caudas
t
-test. As diferenças entre os conjuntos de dados foram consideradas significativas para valores de p ≤ 0,05. As barras de erro = ± SEM salvo indicação em contrário.
Identificação de vias reguladas foi feito por um método GSA, GAGE [30], reforçada para explorar disponíveis informações de indução de repressão (para maiores detalhes e cálculos ver S2 Arquivo). Pathways foram representados por listas de genes (conjuntos de genes) baixados da assinaturas moleculares de banco de dados (MSigDB) 3.0 [31]. coleção C2 de conjuntos de genes curadoria (vias canônicas e assinaturas de expressão gênica de perturbações genéticas e químicas) usando os símbolos de genes identificadores. conjunto de genes p-valores foram corrigidos para testes múltiplos estimando a taxa de detecção falsa e nível de significância foi fixado em 1%.
Resultados
E. faecalis
infecção induzir intracelular ROS e superóxido produção
Outros e temos mostrado previamente que o KO rato gastrina achlorhydric teve crescimento excessivo de bactérias com o
enterococos
que normalmente não fazem parte da flora gástricas [ ,,,0],20]. Embora
enterococos
em geral são considerados de baixa patogenicidade, sustentada crescimento excessivo em ratinhos achlorhydric está associada com uma resposta inflamatória e, finalmente, estes murganhos desenvolvem cancro gástrico [20], [32]. Para caracterizar o processo patológico no interior das células gástricas examinamos como as bactérias afectado as células epiteliais gástricas. Utilizando sondas de controlo da produção ROS intracelular, descobrimos que 30 minutos de infecção estimulou um aumento significativo no intracelular ROS formação (Figura 1A). Com as sondas específicas para a produção de superóxido que mostrou que a ROS consistia principalmente de superóxido em células MKN74 (Figura 1A). A intensidade de fluorescência foi quantificada utilizando o software LSM 510 e um aumento estatisticamente significativo na intracelular ROS e superóxido nas células infectadas em comparação com células de controlo não infectadas foi observado (Figura 1B). Não encontramos nenhuma evidência que sugeria a invasão das células de bactérias de modo concluímos que o ROS intracelular foi produzido pelas células infectadas e não por internalizado
E. faecalis
(Figura 1 C-D).
MKN74 células infectadas com
E. faecalis
durante 30 minutos a MOI50. (A) imagem microscópio de fluorescência Representante de células MKN74 corados com ROS detectar sondas (verde) e sondas superóxido detectar (laranja) Escala bares = 50 mm. (B) A quantificação da intensidade de fluorescência utilizando o software LSM 510. foi observado nas células infectadas em comparação com células de controlo não infectadas Um aumento de produção significativo estatisticamente intracelular de ROS (p 0,01) e de superóxido (0,02 p medimos como a infecção bacteriana afectada respiração mitocondrial de ATP medindo o volume de negócios, capacidade respiratória e do consumo de oxigénio-independente OXPHOS (Figura 2). Para assegurar que os resultados de respiração reflectida apenas as células MKN74, todas as bactérias foram removidos antes das medições. Não houve diferença significativa no volume de ATP das células de controlo cultivadas durante 4-24 horas, enquanto que um decréscimo significativo 2- e 4 vezes (p 0,001) do volume de negócios ATP estavam presentes entre as células de controlo e células infectadas foram incubadas durante 8 e 24 horas, respectivamente (Figura 2A). Uma correlação correspondente foi encontrado na capacidade respiratória, em que as capacidades de células infectadas foram também significativamente 2- e 4 vezes diminuiu (P 0,01) em comparação com células de controlo após 8 e 24 horas após a infecção (Figura 2B). O consumo de oxigênio independente de OXPHOS de células de controle permaneceu inalterada em células cultivadas durante 4-24 horas. Em contraste, o consumo de oxigénio-independente OXPHOS de células infectadas com bactérias aumento de ~ 50% do consumo total de oxigénio, após 4 horas de infecção para se tornar o utilizer oxigénio primário (P 0,001) (Figura 2C). Isto sugere que o
E. faecalis
interagir com as células epiteliais, induzindo a formação de ROS e consumo de oxigênio por outros sistemas enzimáticos intracelular do que a fosforilação oxidativa. Expressão de NOX1-5 e Duox1-2 foi examinado na linha celular gástrica; Contudo, a expressão não foi afectada pela infecção (Tabela S2).
MKN74 células foram incubadas com ou sem
E. faecalis Compra de 4, 8 ou 24 horas. As bactérias foram removidas e taxa de consumo de oxigênio foi medido em uma XF24 Extracelular Flux Analyzer. (A) ATP rotatividade, (B) capacidade respiratória e (C) o consumo de oxigénio OXPHOS-independente foi determinada como descrito no texto. ▪ = células de controlo, ο =
E. faecalis
células infectadas. (N = 3-6, barras de erro indicam DP ** e *** denota diferença significativa p 0,01 e p 0,001, respectivamente)
E.. infecção faecalis
causado instabilidade DNA mitocondrial
Temos demonstrado anteriormente que a infecção com patogénicos
H. pylori
estirpes induzidas mutações no genoma mitocondrial humano em cultura de células [36]. Dado que a infecção com
E. faecalis
aumentar intracelular ROS examinamos se também causou instabilidade mtDNA genômica. A frequência global de eventos mutacionais região D-ciclo mitocondrial foi significativamente maior em culturas de células infectadas com MKN74
E. faecalis
(45,5%) do que em culturas de células de controlo não infectados (23,0%; p 0,01) (Figura 3). Além disso, as células infectadas mostraram um maior número de transições (36,4%) do que as células de controlo (21,8%; p 0,05). Deleções (0% de controle /3,9% infectado), inserções (controle de 1,1% /2,6% infectada) e transversões (0% de controle /2,6% infectado), este último normalmente visto como uma consequência de ROS, foram detectados mais frequentemente em infectado células. Assim, a infecção com
E. faecalis
induz mutações nas células gástricas (Figura 3).
As mutações detectadas na região D-loop mtDNA após a infecção. células MKN74 foram infectadas com o
E. faecalis
a uma MOI de 10 durante 5 dias. Culturas de células infectadas MKN74 tinham um número significativamente maior de mutações no total e mutações de transição do que as culturas de células de controlo não infectadas. * Denota significativamente diferentes das células não tratadas p . 0,05
A infecção causou um NFkB dominado resposta inflamatória e uma resposta ROS
Para obter mais conhecimentos biológicos nas respostas celulares em células gástricas para
E.
infecção faecalis foi realizada uma análise microarray examinar as mudanças globais na expressão gênica em células infectadas com viável
E. faecalis
ou tratados com
E. faecalis
lisado. Ao invés de focar sobre a expressão de genes individuais que usamos GSA [30] para identificar as vias e os processos ativados ou inibidos pela infecção. Concentrando-se em conjuntos de genes em vez de genes individuais aumenta a robustez, a sensibilidade e importância biológica, mesmo para conjuntos moderadamente regulados de genes. Isto é conseguido, aumentando a relação sinal-ruído, o que torna possível interpretar mudanças modestas em genes individuais [37]. A GSA testado 2403 conjuntos de genes e resultou em 484 vias reguladas sendo estatisticamente significativa tanto para infecções ao vivo e /ou estímulos lisado (Figura S2). Concentrando-se nos caminhos estatisticamente significativas para as infecções ao vivo, alguns dos conjuntos de genes julgados para melhor caracterizar o estudo foram divididos em três grupos manualmente (Figuras 4, 5 A e 6 A). Examinando a inflamação e ROS,
E. infecção faecalis
causou um aumento da regulação significativa de várias vias envolvidas em respostas imunes, incluindo aglomerados de genes de receptores de quimiocina e quimiocinas de sinalização, genes envolvidos no ligando do receptor acoplado à proteína G de ligação, e NFkB activação de genes (Figura 4, superior seis conjuntos de genes). Além disso dois conjuntos de genes que compreendem genes que respondem a fosfolipídios pró-inflamatórias oxidados foram fortemente regulado para cima. fosfolípidos oxidados são produzidos por ROS e funciona de uma forma pró-inflamatória [38], [39] (Figura 4, o gene definido sete e oito). Apoiando a presença de ROS, um conjunto de genes de 30 genes conhecidos por ser expressa em resposta a ROS foi ativado (Figura 4, conjunto de genes inferior). Sabe-se que as ROS são importantes para o lipopolissacárido (LPS) da produção -driven de várias citocinas pró-inflamatórias [40] No entanto, as bactérias gram-positivas, tais como
E. faecalis
não expressam LPS. Estudámos, portanto, como a expressão de genes individuais que codificam para as citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas foram efectuadas em resposta a um não-estimulada por LPS infecção durante 24 horas e infecções Dia 5 (Tabela 1). Numerosos genes envolvidos na via de NFkB inflamatória foi significativamente regulada para cima durante
E. faecalis
infecção, incluindo a interleucina-1β (IL-1ß), interleucina-1 de cinase associada ao receptor 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11 e Factor de Necrose Tumoral-α (TNF- α) a maioria dos quais pode propagar-se ainda mais a resposta de activação do NF-kB [41] – [44]. Entre estes estavam várias citocinas previamente identificados em
H. pylori
infecções mediadas, tais como IL-8 e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), ambos associados com a angiogénese e com cancro avançado gástrica, IL-1ß, que é um inibidor potente da secreção de ácido, e também o TNF-α, uma regulador da proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [43] – [45]. Além disso, a citocina IL-23α que promove a incidência de tumor e o crescimento [46] e é altamente produzido em
H. pylori
mucosa colonizado [47] foi regulada juntamente com, IL-11, que é uma citoquina de células parietais que bloqueia a secreção de ácido gástrico, promove a gastrite atrófica e tumorigénese gástrica [48], [49]. Entre outros genes encontrados para exibir níveis elevados Expressional, e significativas durante a infecção foram IL-1α, IL-32, factor de diferenciação do crescimento 15 (GDF15) e, quimioquina (motivo C-C) ligando 22 (CCL22). Além disso, uma sobre-regulação da superóxido dismutase 2 (SOD2), que converte superóxido em peróxido de hidrogénio, foi observado. IL-8, factor regulador Interferão 1 (IRF-1) e o TNFa foram validados por qRT-PCR (Figura 4 B).
(a) uma parte do resultado GSA. A partir da porção de conjuntos de genes significativamente enriquecidos em MKN74 células infectadas durante 24 horas, um subconjunto de conjuntos de genes foram selecionadas manualmente por associação com a resposta inflamatória e de resposta para ROS. Os números entre parênteses indicam rígidos número efetivo de genes no conjunto de genes. O título de cada conjunto de genes corresponde ao título dado no site da MSigDB. Os números em caixas coloridas são ajustados os valores de p (valores de Q), pretas indicam significância estatística de 1% Fdr. (B) Caracterização por qRT-PCR de transcritos que codificam para citocinas importantes e quimiocinas após
E. faecalis
infecção durante 24 horas (MOI50) e 5 dias (MOI10). * Denota significativamente diferentes das células não tratadas p . 0,05
(A) Uma seção do resultado GSA após 24 horas de infecção. conjuntos de genes associados à reparação de danos ao DNA com mesma configuração como a figura 4 A. (B) Caracterização de transcritos que codificam genes importantes envolvidos na MMR após
E. faecalis
infecção durante 24 horas (MOI50) e 5 dias (MOI10). * Denota significativamente diferentes das células não tratadas p . 0,05
DNA reparação de danos são regulados negativamente durante a
E. faecalis
infecção
A análise indicou que a via de expressão de genes envolvidos na reparação de danos no ADN foi significativamente regulada para baixo em relação às culturas de células não infectadas após 24 horas de infecção (Figura 5A). qRT-PCR confirmou que a expressão de vários genes de reparação de incompatibilidade (MMR) foram regulados negativamente após ambas as 24 h e 5 dias de
E. faecalis
infecção (Figura 5, B). Em 24 h as células infectadas PMS1 e MSH6 foi significativamente regulada para baixo (4 vezes e 1,8 vezes, respectivamente; P 0,001). Uma regulação negativa significativa de MSH2 (3 vezes), MSH3 (1,9 vezes), MSH6 (2 vezes), e PMS1 (3 vezes) (p 0,05) (Figura 5, B) foi observada em células 5 dias após a infecção. Os Expressional dobrável mudanças de DNA genes de reparação de danos selecionados após a infecção são apresentados na Tabela S3. Estes resultados sugerem que
E. faecalis
infecção sub-regula principais vias de reparo de DNA, resultando em instabilidade genômica semelhante a infecções com
H. pylori
[36], [50], [51].
A infecção pelo
E. faecalis
inibe o controle do ciclo celular e crescimento de células MKN74
Para avaliar as alterações no crescimento celular induzida pelo
E. faecalis
infecção, foi investigada a influência de bactérias sobre a expressão de genes de controlo do ciclo celular e no crescimento de células MKN74. conjuntos de genes compreendendo o controlo do ciclo celular e os genes checkpoint foram regulados negativamente após 24 horas de infecção com bactérias viáveis, sugerindo uma diminuição significativa para baixo na proliferação celular, mas também um aumento do risco de mutações em células novas (Figura 6 A). Em contraste, estas vias foram regulados positivamente em células infectadas com o lisado bacteriano o que sugere que estas células ainda foram dividindo depois de 24 horas (Figura 6 A). Nós próxima medida a proliferação de células durante 5 dias e descobriu que bactérias viáveis causou a proliferação de células MKN74 de abrandar ou parar completamente (Figura 6 B).