Abstract

Fundo

A vitamina de ligação do factor de activação da proteína-macrófagos D ( DBP-maf) é um potente inibidor do crescimento do tumor. A sua actividade, no entanto, tem sido atribuída a mecanismos indirectos, tais como aumentar a resposta imunitária através da activação de macrófagos e a inibição do crescimento dos vasos sanguíneos necessários para o crescimento de tumores.

Métodos e Descobertas

Neste estudo mostramos pela primeira vez que DBP-maf exibe um efeito directo e potente sobre células tumorais da próstata na ausência de macrófagos. actividade inibidora demonstrada DBP-MAF em estudos de proliferação de ambos LNCaP e linhas celulares de cancro PC3 próstata, bem como clones de células metastáticas destes. Estudos de citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio mostrou que esta actividade inibitória não é devido a apoptose ou morte celular. DBP-MAF também tinha a capacidade de inibir a migração de células cancerosas da próstata

in vitro

. Finalmente, o DBP-MAF foi demonstrado que provoca uma redução no receptor de urocinase do activador do plasminogénio de expressão (uPAR) em células de tumor da próstata. Há evidências de que a activação deste receptor correlaciona-se com a metástase do tumor.

Conclusões

Estes estudos mostram forte actividade inibidora de DBP-MAF em células de tumor de próstata independentes da sua activação dos macrófagos.

Citation: Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. Protein-macrófagos (2010) Vitamina D Binding Factor de Activação Diretamente inibe a proliferação, migração, e uPAR Expressão de células cancerosas da próstata. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10.1371 /journal.pone.0013428

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2010; Aceito: 10 de setembro de 2010; Publicação: 18 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Gregory et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa (DOD) PC030286 concessão e Pesquisa para prevenir a cegueira Desafio Grant. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteína de ligação da vitamina D (DBP) é o principal transportador de vitamina D no sangue. Ele tem um peso molecular entre 52-59 kDa e é encontrado na corrente sanguínea a um nível entre 300-600 ng /ml [1], [2]. PAD é a molécula mãe de DBP-MAF [3]. DBP-MAF é o produto de desglicosilação selectiva de PAD e foi mostrado ser uma molécula anti-angiogénico potente anti-tumorigénica e [4] – [6]. Demonstrámos previamente em um rato modelo de xenoenxerto que DBP-MAF é um potente inibidor de tumores pancreáticos humanos, e que a sua capacidade para inibir o crescimento tumoral

In vivo

é devido, em parte, às suas propriedades anti-angiogénicas [4] . Nesse estudo, foi demonstrado que o DBP-MAF é antiangiogénico baseado na redução dos vasos na membrana corioalantóica de pintainho, e com base na redução da densidade de microvasos em tumores. Tem sido sugerido por outros estudos que os seus mecanismos anti-tumor primário são imunológicos, devido à sua activação de macrófagos. Estudos clínicos recentes por Yamamoto

et ai

têm demonstrado actividade anti-tumoral potente, bem como actividade contra o HIV [7] – [10]. Esta actividade foi medida como uma função de níveis séricos reduzidos da enzima α-N-acetilgalactosaminidase (nagalase). Nagalase desglicosilação de PAD a impede de macrófagos de activação e, por conseguinte, suprime a resposta imune [11]. O mecanismo proposto de base em todos os casos é, em grande parte a activação de macrófagos e as respostas imunes resultantes. Em HIV foi sugerido que a apresentação de antigénio defeituosa seja um factor de deficiência imune [12]. A presença de nagalase elevada no plasma de doentes com HIV sugere que a activação de macrófagos pode ser inibido nestes doentes [13]. Além disso, nagalase foi demonstrado ser um componente intrínseca de uma proteína do invólucro promotor da fusão para a iniciação da infecção [11]. A concentração plasmática de nagalase em doentes com lúpus eritematoso sistémico, também foi encontrada para ser elevada. No lúpus, auto-anticorpos formar complexos imunes patogénicos e são depositados nos tecidos. O apuramento destes complexos por macrófagos é inibida se a activação de macrófagos é interrompido [14]. As células cancerosas têm sido mostrados para produzir nagalase [15] e as concentrações elevadas no soro foram registados num número de pacientes com cancro que sofrem de melanoma [16], da próstata, colo-rectal e o cancro da mama metastático [7] – [9]. Um profundo conhecimento da atividade DBP-maf ainda está para ser alcançado, mas o seu potencial como uma terapia antiangiogênica e imunogênica é clara

Quatro próstata linhas celulares de cancro foram utilizados neste estudo, a fim de incluir.; o andrógeno sensível (LNCaP) e linhas insensíveis (PC3M), bem como linhas altamente metastáticas (LNCaPLN3 e PC3MLN4) derivada de cada genitor, respectivamente.

A capacidade de DBP-maf ter um efeito direto sobre células de tumor não tem sido relatada. Este estudo investigou o papel de DBP-maf na inibição direta de actividades, tais como a proliferação, migração e expressão do uPAR que estão relacionados com o crescimento de tumores e metástases.

Materiais e Métodos

Síntese de DBP-maf

(a) Preparação de grânulos (1-3) β-D-galactosidase-agarose.

Preparação de grânulos foi feito usando uma modificação do método de Yamamoto

et ai

[17]. esferas activadas por brometo de cianogénio (0,5 g) foram lavados com HCl 1 mM (3X, 10 mL por lavagem) através de filtração por sucção. As esferas foram, em seguida, lavou-se com água DDI e ressuspensas em 2 ml de tampão de acoplamento (0,1 M NaHCO

3, NaCl 0,5 M, pH 8,3). (1-3) β-D-galactosidase (1000 unidades) foi adicionado às esferas de tampão /de acoplamento e, em seguida, agitado com um excesso e sob misturador durante 2 horas à temperatura ambiente. As esferas foram então lavadas com tampão de acoplamento e ressuspensas em tampão de bloqueio (tampão de acoplamento mais 0,2 M de glicina). A suspensão foi agitada durante a noite a 4 ° C. As esferas foram então lavadas com tampão de condensação, seguido por acetato de sódio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4,0, e as lavagens foram repetidas para um total de quatro vezes. As esferas foram lavadas com uma lavagem final de tampão de acoplamento, em seguida, centrifugadas e ressuspensas em 1,0 M de NaCl.

(b) Determinação do (1-3) A atividade grânulo β-D-galactosidase-agarose.

Determinação da actividade do grânulo foi feito usando uma modificação do método de Yamamoto

et al [17]. A fim de determinar a actividade dos grânulos (1-3) D-β-galactosidase-agarose, 50 ul da suspensão de esferas foram adicionadas a 0,95 mL de tampão de ensaio /substrato cromogénico (PBS, 3 mM de 2-nitrofenil-β- D-galactopiranósido, 10 mM de MgCl

2, mM β-mercaptoetanol 0,1), e a suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min. A reacção foi parada com 33 mL de carbonato de sódio 1 M, e a absorvância foi medida a 405 nm. A actividade foi expressa como unidades /mL de suspensão de esferas, em que uma unidade é definida como o número de mol de p-nitrofenol formado por minuto. A absortividade molar de 18380 L /mol cm, e um comprimento do percurso de 0,25 cm correspondendo a um volume de 200 ul numa placa de 96 poços foram utilizados para calcular a concentração de p-nitrofenol.

(c) A desglicosilação de DBP com contas (1-3) β-D-galactosidase-agarose.

a desglicosilação da PAD foi feita usando uma modificação do método de Yamamoto

et al

[17]. PAD (Calbiochem, San Diego, CA) foi adicionado a uma concentração final de 0,05 mg /mL em PBS pH 6,0, 10 mM de MgCl

2, com 0,007 L de (1-3) β-D-galactosidase-agarose e 0,004 U de neuraminidase-agarose (Sigma, St. Louis), e agitou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. O volume total da reacção foi de 1 ml. As pérolas foram então sedimentados por centrifugação e removidos. DBP-MAF foi armazenado em alíquotas a -20 ° C.

DBP-maf péptido

Um péptido de 14 aminoácidos DBP-MAF foi sintetizado (Ana Spec, Fremont, CA) com o amino sequência de ácidos: Ac-TPTELAKLVNKRSE. Pureza foi . 90%

cultura celular

PC3M, PC3MLN4, as células LNCaP e LNCaPLN3 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Curtis Pettaway e Dr. Isaías J. Fidler (MD Anderson Cancer Center ). A linha celular foi isolado a partir PC3M metástases hepáticas produzidos em ratinhos nus subsequentes à injecção interna do baço da linha de androgénio humano PC3-insensível de células de carcinoma da próstata [18]. As sublinhas metastáticas, e PC3MLN LNCaPLN, foram criados por injecção de células parentais ortotopicamente no lóbulo dorsal da próstata de ratinhos nus e cultura das células que tinha metastizado para o gânglio linfático sentinela (paraaórtico). Depois da cultura durante 3-5 passagens, estas células foram re-injectada na próstata de ratos pelados subsequentes. Este processo foi repetido por 3 ciclos para criar a linha metastático, LNCaPLN3 e durante quatro ciclos para criar a linha metastático, PC3MLN4 [18]. Todas as células de tumor foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) com 10% de soro fetal de bovino (FBS), penicilina (100 U /mL) /estreptomicina (100 ug /mL), e L-glutamina e incubadas, a 37 ° C, 10% CO

2.

a fosfatase ácida ensaio colorimétrico

no final de cada experiência, as células foram lavadas em PBS, em seguida, 450 ul de tampão de fosfatase ácida (fosfato de p-nitrofenol 10 mM, 0,1 M de acetato de sódio, 0,1% de Triton X-100, pH 5,8) foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas a 37 ° C durante 45 minutos. Cinquenta ul de NaOH 1 N foram adicionados a cada poço para parar a reacção e a absorvância foi medida a 405 nm [19], [20]. O número de células de cada tipo de célula foi calibrado com absorvância utilizando um hemacitómetro para assegurar que os níveis de fosfatase ácida correlacionou-se de um modo linear com o número de células. Análises e conspirar para todos os ensaios foram feitos usando Origin Pro 8 (Northampton, MA).

ensaios de migração celular

ensaios de migração foram realizadas utilizando um modificados inserções de cultura Boyden câmara Millicell (Millipore, Billerica, MA) com poros de 8 um [20] – [22]. membranas superiores foram pré-incubadas durante a noite com fibronectina (10 ug /ml em PBS), o qual foi aspirado dos poços na manhã seguinte. As células (150.000 células /poço) foram plaqueadas em meio basal with.010% de gelatina, com ou sem PAD-MAF ou PAD. Alguns poços de amostra foram coradas na conclusão do período de incubação para assegurar que a adesão celular nas membranas superiores era uniforme sob todas as condições. meio basal foi adicionado a poços de fundo com ou sem FBS a 10%. As células foram incubadas durante seis horas a 37 ° C, 10% de CO

2. As células que não migraram foram removidos a partir do topo da membrana e as células que migraram foram quantificadas utilizando um ensaio colorimétrico de fosfatase ácida.

Os ensaios de proliferação

As células tumorais foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) com 10% de FBS, penicilina /estreptomicina e L-glutamina e incubadas, a 37 ° C, 10% de CO

2. As células foram tratadas com tripsina e adicionadas a placas de 24 poços (5000 células /poço) em 0,5 mL de meio de cultura. As células foram privadas de soro durante a noite, em seguida, o meio foi substituído com meio RPMI 1640, 1% de FBS, penicilina /estreptomicina e L-glutamina e incubadas durante 72 horas com ou sem PAD-MAF ou PAD [23]. A proliferação celular foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico de fosfatase ácida [4], [23].

A citometria de fluxo

As células foram cultivadas até à confluência em ~ 80% de 100 mm

2 pratos. As células foram tratadas com ou sem PAD-MAF (1 ug /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 48 horas. As células foram tripsinizadas, centrifugadas, divididas em alíquotas para tubos e marcadas com anexina V e iodeto de propídio utilizando um kit de detecção de apoptose (APOAF, Sigma, St. Louis, MO). Anexina V e coloração de PI foram realizadas seguindo as recomendações do fabricante. A análise de citometria de fluxo foi realizada utilizando um separador de células Cytomation MoFlo seguindo as recomendações do fabricante.

A transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (RTQPCR)

O ARN total foi extraído a partir de células humanas utilizando Trizol reagente (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante e foram tratados com DNase RNase-free (Ambion). integridade do RNA e qualidade foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose a 1% e as concentrações foram determinadas por espectrofotometria (NanoDrop 1000 Spectrophotometer v3.7, ThermoFisher Scientific). O ARN total (1 ug) foi submetido a transcrição inversa como descrito anteriormente [24], utilizando ADNc qScript SuperMix (Quanta Biosciences). Os produtos de RT (cDNA) foram amplificados por quantitativa (Real-Time PCR sistema Applied Biosystems 7900 HT rápido) por PCR em tempo real com verde de alimentação SYBR Mistura Mestre. oligonucleótidos iniciadores específicos para o ser humano variante uPAR 1 (Genebank adesão n ° NM-002659, frente 5’CAACGAGGGCCCAATCCT -3 ‘e reverso 5′-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3’), uPAR variante 2 (adesão n ° Genebank NM-001005376, para a frente 5 ‘- CAACGAGGGCCCAATCCT -3′ e CACTGGCGGCCATTCTG reverso 5’- -3 ‘), uPAR variante 3 (adesão n ° Genebank NM-001005377, frente 5’GCCGTTACCTCGAATGCATT -3′ e GGCCCCTCTCACAGCTCAT reverso 5’- -3 ‘) e 18S rRNA (directo 5’-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 ‘e inverso 5′-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3’) foram usadas. As condições dos ciclos foram de 50 QPCR ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de um programa de amplificação em dois passos (95 ° C durante 15 s e 58 ° C durante 1 min). No final da amplificação, o qual funde análise da curva foi aplicado usando o protocolo de dissociação do Sequence Detection System para excluir contaminação com produtos de PCR não específicos. Os produtos de PCR foram também confirmados por gel de agarose e mostrou apenas uma banda específica do tamanho previsto. Para controlos negativos, não há produtos de RT foram utilizados como moldes na QPCR e nenhuma banda foi detectada no gel.

expressões relativas de genes alvo foram determinadas pelo 2

-ΔΔCt método de [25]. As células não tratadas foram escolhidos como os calibradores.

imunotransferência

imunotransferência foi realizada utilizando uma modificação do método de Besch

et al [26]. As células foram cultivadas em 100 mm

2 pratos e cresceu para ~ 80% de confluência, em seguida, privadas de soro durante a noite. O meio foi substituído com meio RPMI (FBS a 1%). DBP ou DBP-MAF foi adicionado em concentrações indicadas. As células foram incubadas durante 24 ou 72 horas a 37 ° C e depois lisadas utilizando um tampão HTG (20 mM de HEPES, pH 7.4,10% glicerina, 1% de Triton X-100) e colhidas utilizando um raspador de células. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) foi adicionada (100 | iM). Os lisados ​​foram separados utilizando SDS-PAGE. As pistas foram normalizados utilizando Carga igual de proteína (40 pg /pista). Os níveis de proteína foram determinadas utilizando um ensaio de BCA (Pierce, Rockford, IL). As bandas foram transferidas para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada durante a noite em 10% de leite magro em pó e 0,10% de Tween 20 em PBS. A membrana foi hibridada com um anticorpo anti uPAR (Santa Cruz, CA), seguido de hibridação com um anticorpo secundário ligado a peroxidase de rábano e visualizados utilizando quimioluminescência. Vinculina foi utilizado como um controlo de carga.

A análise estatística

O efeito de DBP-MAF foi testada separadamente para os ensaios de migração e proliferação celular. Um um teste t unilateral foi usada para medir a significância estatística de redução de crescimento do tumor em vários níveis. A Z-teste bilateral foi utilizado para medir o efeito de DBP-MAF na apoptose ou necrose. Todas as análises foram feitas usando o software estatístico SAS versão 9.1 (SAS Institute, Cary, Carolina do Norte) e um

P

-valor ≤0.01 foi usado para identificar a significância estatística.

Resultados

DBP-maf inibe a migração de células tumorais

invasão e a migração de células tumorais são passos importantes no crescimento de tumores e metástases. DBP-MAF foi testado o efeito sobre a migração de células do tumor em quatro linhas- duas linhas de cancro da próstata (LNCaP parentais e PC3M) e dois clones metastático destas linhas (LNCaPLN3 e PC3MLN4), usando uma câmara de Boyden modificada. O nível basal de migração entre cada linha parental e o seu respectivo clone metastático manteve-se inalterada. Em todas as doses testadas, foi observada inibição da migração (Figura 1).

,, PC3M (C) ou foram adicionados PC3MLN4 (D), as células LNCaP (A) LNCaPLN3 (B) (150.000 /poço) para o câmara de topo de uma câmara de Boyden modificada (+/- DBP-maf) com 10% de FBS na câmara inferior. Após 6 horas as células foram removidas que não tinham migrado e as células restantes foram quantificados usando um ensaio de fosfatase ácida. Os resultados foram normalizados para controlar. As experiências foram realizadas pelo menos três vezes e de erro é mostrado como +/- DP. Em comparação com o crescimento celular sem PAD-MAF, adicionando-PAD MAF teve uma redução global significativa da migração celular em 30% (P = 0,0003) para os quatro tipos de células de tumor combinadas. as taxas de redução significativa individuais foram encontrados com cada um destes tipos de células tumorais. Em comparação com o controlo, a redução significativa foi observada com DBP-MAF em (A) 20% P = 0,0022 (B) 20% P = 0,0029 (C) 10% P = 0,0045 (D) 30% P = 0,0094. n = 3.

Um peptídeo DBP-maf inibe tumor migração celular

A preparação de DBP-MAF envolve processos enzimáticos multi-passo. A desglicosilação selectiva é um passo necessário no processo, porque expressão de DBP-maf em E. coli produziu uma proteína com nenhuma atividade [4]. Uma versão activo, mas mais facilmente formulado da molécula faria o fabrico de DBP-Maf mais fácil e menos caro. Por estas razões, um péptido DBP-MAF foi sintetizado utilizando uma sequência a partir da molécula original que tinham demonstrado actividade em outros estudos [27]. O péptido foi testado para determinar o seu potencial para inibir a migração de células tumorais. Como mostrado na Figura 2, o péptido mostrou capacidade significativa para inibir a migração de todas as linhas de tumor. O efeito inibitório não aumentou em doses mais elevadas, o que sugere a sua IC

50 foi mais baixa do que a gama de doses testada.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) ou PC3MLN4 (D) as células foram adicionadas (150.000 /poço) para a câmara de topo de uma câmara de Boyden modificada (+/- DBP-maf) com 10% de FBS na câmara inferior. Após 6 horas as células foram removidas que não tinham migrado e as células restantes foram quantificados usando um ensaio de fosfatase ácida. Os resultados foram normalizados para controlar. As experiências foram realizadas pelo menos três vezes e de erro é mostrado como +/- DP. Em comparação com a migração sem PAD-MAF, adicionando-PAD MAF teve uma redução estatisticamente significativa da migração em 40% (P 0,0001) para a combinação de todos os quatro tipos de células tumorais. as taxas de redução significativa individuais foram encontrados com cada um destes tipos de células tumorais. Comparado ao controle, redução significativa foi observada com DBP-maf em (A) 30% P = 0,0038 (B) 40% P = 0,0016 (C) 20% P = 0,0038 (D) 40% P = 0,0005. n = 3.

DBP-maf inibe a proliferação de células tumorais

As quatro linhas de células foram então testados para determinar a sua sensibilidade à DBP-maf em estudos de proliferação. Como mostrado na Figura 3A, o DBP-MAF a 1 ug /mL reduziu a proliferação para os níveis de linha de base, ou abaixo, em todas as linhas celulares, à excepção de PC3M. Foi interessante que, apesar de as células PC3M não foram sensíveis ao DBP-maf neste ensaio, o PC3MLN4 clone metastático desenvolveram sensibilidade a ele.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) ou PC3MLN4 (D) As células foram semeadas em placas de 24 poços durante a noite, em seguida, forma +/- DBP-MAF foi adicionada com 1% de FBS. Após 72 horas as células foram quantificados usando um ensaio de fosfatase ácida. Os resultados foram normalizados para controlar. As experiências foram realizadas pelo menos três vezes e de erro é mostrado como +/- DP. Comparado ao controle, redução significativa foi observada com DBP-maf em (A) 50% P = 0,0001 (B) 50% P = 0,0001 (C) nenhuma redução significativa (D) 40% P = 0,0073. n = 3.

a 1 ug /ml, o DBP-maf teve uma redução estatisticamente significativa do crescimento celular a 40% (P = 0,0073) para a combinação de todos os tipos de células tumorais. as taxas de redução significativa individual (sem PAD-maf verso 1 ug /ml) foram também encontrados entre estes tipos de células de tumor, excepto PC3M em que nenhuma redução significativa (Figura 3).

estudos de proliferação utilizando a PAD- péptido MAF não mostrou qualquer redução na proliferação de qualquer das linhas de células (dados não apresentados). Isto sugere que a capacidade de inibir a migração e proliferação pode residir em áreas distintas da proteína e que esta sequência de péptido pode não ter nenhum papel na inibição da proliferação. É também possível que o local responsável pela actividade de DBP-maf completo é mais complexo e requer a sequência desglicosilada selectiva da proteína de estar presente.

De modo a determinar se a inibição da proliferação de células tumorais foi devida à a morte celular ou a apoptose, citometria de fluxo foi realizada utilizando iodeto de propídio e anexina V marcadores. Estes estudos não mostraram nenhuma evidência de qualquer morte celular significativa ou toxicidade resultante de células DBP-MAF tratados (Tabela 1) e, com excepção da linha parental PC3M, mostrou uma redução.

RT-PCR mostra a redução de expressão de uPAR em células tratadas com DBP-maf

a expressão do receptor de urocinase do activador do plasminogénio (uPAR) tem sido demonstrado que se correlacionam com o aumento da metástases em células de tumor [28] – [30], e com a resistência à droga [31] (para revisão ver [32]). RT-PCR foi realizada em todos os tipos de células usando três isoformas conhecidas de precursores de uPAR, incluindo o receptor solúvel, isoforma 2 (ver Métodos). Como mostrado na Figura 4D, foi observada a diminuição da expressão de ARN para LNCaPLN3 na presença de DBP-MAF, tanto a 0,001 e 1 ug /mL de DBP-MAF para ambas as isoformas uPAR2 uPAR1 e. As isoformas uPAR2 e uPAR3 mostrou redução similar de expressão com o tratamento DBP-maf de células PC3M. Curiosamente, apesar de as células PC3MLN4 não mostraram resposta significativa ao DBP-MAF (Figura 5D), houve uma redução estatisticamente significativa da uPAR2 com PAD a 1 ug /ml. Em quase todas as condições examinada, após 72 horas, os níveis de uPAR tinha voltado aos valores de controlo (dados não apresentados). O péptido também foi testada utilizando a linha de células (LNCaPLN3), que era activo em todos os ensaios e (PC3M), que era activo na migração, mas não em proliferação. Eles apresentaram nenhuma alteração significativa em qualquer um dos níveis de isoformas uPAR com o péptido (figura 6A e 6B). As linhas de tumor foram então testados para observar o efeito de DBP-MAF na expressão de uPAR ao nível da proteína. As células foram colhidas após 24 horas e os lisados ​​foram coradas imunologicamente. Como mostrado na Figura 4, o DBP-MAF não inibiu a expressão de uPAR em quaisquer linhas de células após 24 horas (Figura 7A), contudo, uma redução foi observada após 72 horas apenas nas células LNCaPLN3 (Figura 7B). PAD células tratadas não apresentaram qualquer alteração significativa na expressão do receptor.

e LNCaP LNCaPLN3, as células foram tratadas com DBP ou DBP-MAF (0,001 e 1 ug /mL) e incubou-se durante 24 horas e depois colhidas. produtos de RT (cDNA), identificadas como uPAR1, 2 e 3, foram amplificados por PCR em tempo real quantitativo.

PC3M e células PC3MLN4 foram tratados com DBP ou DBP-MAF (0,001 e 1 ug /ml) e incubou-se durante 24 horas e depois colhidas. Os produtos de RT (cDNA), identificadas como uPAR1, 2, e 3, foram amplificados por PCR em tempo real quantitativa. p. 0,05

LNCaPLN3 (A) e células PC3M (B) foram tratadas com DBP ou DBP-MAF (0,001 e 1 ug /mL) e incubou-se durante 24 horas e depois colhidas. Os produtos de RT (cDNA), identificadas como uPAR1, 2, e 3, foram amplificados por PCR em tempo real quantitativa. p. 0,05

LNCaP, LNCaPLN3, PC3M, e PC3MLN4 foram tratadas com DBP ou DBP-MAF e incubadas durante 24 horas (A), em seguida, colhidas e coradas imunologicamente utilizando um anticorpo anti-uPAR. LnCaPLN3 células às 72 horas (B). p . 0,05

Discussão

A ligação às proteínas DBP-maf vitamina D, foi mostrado para inibir o crescimento de tumores e vasos sanguíneos. Nós demonstramos aqui, pela primeira vez, um efeito directo sobre as células de cancro da próstata na ausência de macrófagos, aumento do âmbito de DBP-MAF para além das suas características já demonstradas antiangiogénicos e imuno-moduladores. DBP-maf demonstraram inibição potente de ambas proliferação e migração de células tumorais.

É interessante notar que a resposta das células parentais PC3M em comparação com o clone metastático. células PC3M não mostrou sensibilidade ao DBP-maf em ensaios de proliferação, mas a sua migração foi inibida por DBP-MAF. Houve uma redução de expressão de uPAR, como detectado por RT-PCR, mas a expressão da proteína do uPAR isotipos testados apareceu inalterado. Finalmente, o DBP-maf causou um ligeiro aumento na perda devido à apoptose ou necrose (Tabela 1), enquanto que as outras linhas de células demonstraram diminuição da apoptose ou necrose. O clone metastático PC3MLN4 exibiram uma resposta potente para o tratamento, quer a proliferação e migração mesmo em dose baixa (1 ng /mL), mas não mostrou qualquer redução na expressão de uPAR, quer ao nível de proteína ou de ARNm. Estudos adicionais de proliferação foram realizados para determinar se a diferença na resposta entre o clone parental e metastático era devido a uma mudança geral na sensibilidade das células. Calcitriol mostraram inibição potente e consistente entre todos os tipos de células dentro de gamas de doses idênticas. células PC3M e PC3MLN4 também foram testados com etoposido e as suas respostas foram semelhantes (dados não mostrados), sugerindo que o clone metastático adquirida sensibilidade à DBP-maf que a linha parental não demonstrar. O efeito de DBP-MAF em células PC3MLN4 causado as maiores taxas de redução significativa da proliferação e da migração em comparação com as outras linhas celulares. Estudos mostraram todas as linhas de células de tumor a ser sensível a DBP-MAF em ensaios de migração.

As nossas observações em cultura destas células foram metastáticas que os clones de ambas PC3M e LNCaP foram mais sensíveis à tripsinização do que as linhas parentais. Muitos factores que podem regular a migração de células e, embora uPAR é um mediador possível, pode não ser o único mecanismo por meio do qual DBP-maf inibe a migração. O péptido foi eficaz em estudos de migração, mas não mostrou capacidade para afectar a proliferação ou a expressão de uPAR. Uma vez que o peptídeo representa apenas uma parte da proteína que não possui todos os domínios do DBP-maf nativa, tal como a região de ligação a vitamina D. É possível que a capacidade de regular a migração e proliferação reside em domínios separados da proteína. Apesar de todas as linhas celulares respondeu a DBP-MAF em um ou mais dos ensaios, apenas a LNCaPLN3 demonstraram uma redução do nível de proteína uPAR. É possível, no entanto, que o anticorpo não reconhece todas as isoformas de uPAR.

é agora geralmente aceite que o microambiente do tumor, e não apenas na célula de tumor por si só, representa um alvo para a terapia eficaz. Para além da investigação dos efeitos anti-tumorais, o método de administração destas drogas está a ser explorada. A biodisponibilidade é um componente crucial de qualquer estratégia terapêutica. Má absorção, internalização, meia-vida curta em circulação, e uma série de outras deficiências podem fazer uma terapia que tem mostrado grande promessa

in vitro

, ineficaz na clínica. O efetivo

in vivo

doses de DBP-MAF (pg-ng) tendem a ser mais baixos do que o

in vitro

doses (intervalo ng mcg) [4], [6] – [10]. Talvez isso é por causa de vários mecanismos da sua actividade. O potencial de impactar o crescimento dos vasos sanguíneos e crescimento de células tumorais, bem como estimular uma resposta imune potente através da ativação dos macrófagos é difícil de medir

in toto

usando

in vitro

abordagens. Eles, no entanto, fornecer uma maneira de caracterizar esses efeitos individualmente.

O efeito do tratamento DBP-maf na expressão uPAR em células de tumor da próstata era até então desconhecida. expressão de uPAR tem sido correlacionada com a metástase do tumor em vários tumores [26], [28] – [30], [32]. Estudos de tumores esofágicos mostrou PAI-1 e de uPA foram expressos ao longo dos tumores, mas não no tecido esofágico normal e que uPAR foi expressa nas fronteiras de tumores [33], [34]. A ligação entre câncer de pâncreas e uPA foi demonstrado, o que poderia explicar o efeito potente de DBP-maf em nossos estudos de tumores pancreáticos anteriores [33].

A relação entre as proteínas relacionadas com plasmina PAI-1, uPA e uPAR é complexo [35]. Embora o PAI-1 inibe a expressão de uPA, o qual iria ser pensado para inibir a progressão do tumor, PAI-1 também promove o crescimento tumoral e angiogénese no seu próprio [36], [37]. Neste sentido, uma terapia que atenuaria expressão de uPAR sem promover o crescimento do tumor seria valioso. Desde metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer, a sensibilidade uPAR para DBP-maf pode representar uma avenida atraente para um estudo mais aprofundado.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Jayakrishna Ambati e Royce Mohan por seus votos discussões.