Abstract

Temos elucidado recentemente uma função nova para CD82 na adesão homocelulares E-mediada por caderina; devido a esta função, pode inibir a dissociação de células de câncer do ninho câncer e limite de metástase de primário. No entanto, o efeito de CD82 na adesão de selectina heterocelular ligando-mediada ainda não foi elucidado. Neste estudo, que incidiram sobre as consequências do supressor de metástase CD82 /KAI1 heterocelular na adesão de células cancerosas ao endotélio dos vasos sanguíneos, a fim de elucidar melhor a função de tetraspanins. A sobre-expressão de CD82 em células de cancro, conduziu à inibição de metástases do pulmão induzidas experimentalmente em ratinhos e inibiu significativamente a adesão destas células para células epiteliais da veia umbilical humana (HUVECs)

In vitro

. Pré-tratamento das células com anticorpos de perturbação da função contra SLE

A /X, inibiram significativamente a adesão de células CD82-negativas a HUVEC. Além disso, as células que sobre-expressam CD82 exibiu uma expressão reduzida de SLE

A /X comparativamente com as células de tipo selvagem CD82-negativo. Significativo a sub-regulação de ST3 β-galactósido α-2, 3-sialiltransferase 4 (ST3GAL4) foi detectada por micromatriz de ADNc, PCR em tempo real, e análises de transferência de Western. Knockdown de

ST3GAL4

em células do tipo selvagem CD82-negativas inibiu a expressão de SLE

x e reduziu a adesão celular a HUVECs. Concluiu-se que CD82 diminui SLE

A /X expressão através da regulação negativa da expressão

ST3GAL4

e, assim, reduz a adesão de células cancerosas para os vasos sanguíneos, o que resulta na inibição de metástases.

Citation: Yoshihama N, Yamaguchi K, Chigita S, Mina M, Abe M, Ishii K, et al. (2015) A nova função do CD82 /KAI1 em sialil Lewis Antigen-Mediated adesão das células cancerosas: Evidência para um Anti-Metástase Efeito de Down-Regulamento de sialil Lewis Antígenos. PLoS ONE 10 (4): e0124743. doi: 10.1371 /journal.pone.0124743

Editor do Academic: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 24 de dezembro de 2014; Aceito: 03 de março de 2015; Publicação: 29 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yoshihama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação científica (kaken No. 23.390.465) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (para T. Sugiura). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a metástase é um fenômeno de múltiplas etapas caracterizado pela migração de células tumorais a partir de seu site principal, a invasão do sangue host ou vasos linfáticos, semeadura de órgãos distantes, eo subsequente desenvolvimento de tumores metastáticos. O extravasamento de células malignas envolve a interacção de P-selectina e E, que são moléculas de adesão de células encontradas na superfície das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos, com os ligandos de hidratos de carbono correspondentes que ocorrem na superfície de células malignas [1]. Várias espécies moleculares de ligandos de hidratos de carbono de selectinas são expressos em células de cancro, incluindo sialil Lewis X (SLE

x) e sialil Lewis A (SLE

a). Numerosos estudos clínicos têm relatado que a expressão do LES

x e com SLE

um mucinas em células tumorais está directamente correlacionada com a metástase, progressão de tumores, e mau prognóstico [2,3], e sabe-se que a expressão de LES

x /a é marcadamente aumentada em tumores sólidos. No entanto, o mecanismo molecular subjacente à regulação da SLE

x /a em células de cancro não é bem compreendido.

Proteínas

Tetraspanins, ou TM4SF, compreendem um grande grupo de proteínas transmembranares que ocorrem na superfície da célula, que pode formam complexos com receptores de membrana, tais como integrinas. Algumas proteínas tetraspanina-familiares têm sido relatados a desempenhar um papel particularmente importante na metástase das células tumorais [4,5]. CD82 /KAI1, um membro da superfamília das tetraspaninas, foi identificado pela primeira vez como uma molécula acessória de células T [6] e subsequentemente identificada em uma tela genética para os genes supressores de metástases do cancro [7]. Em tumores sólidos malignos, a expressão de CD82 /KAI1 correlaciona fortemente com um melhor prognóstico para pacientes com câncer, enquanto que a sua infra-regulação é comumente encontrada em cancros clinicamente avançados. Estes dados sugerem que a CD82 /KAI1 é um supressor da invasão e metástase de vários tipos de tumores sólidos. [8,9]. Consistente com estas observações, tem sido frequentemente observado que a expressão de CD82 está inversamente correlacionada com o potencial invasivo e metastático de cancros da mama, bexiga, cólon, colo do útero, do tracto gastrointestinal, a pele, pulmão, próstata, pâncreas, fígado, e tiróide [10-13]. CD82 regula a agregação celular, motilidade celular, metástase do cancro, e a apoptose [14]. Nós relataram que estabiliza CD82 complexos de E-caderina-β-catenina pela inibição da fosforilação da tirosina β-catenina. Esta função reforça a adesão das células cancerosas homocelulares e impede que as células cancerosas se escape a partir de ninhos primário [15]. Por outro lado, uma vez que as células de tumor invadir os vasos sanguíneos ou linfáticos, heterofílica adesão intercelular entre as células tumorais e as células endoteliais dos vasos é necessário que a etapa inicial de metástases para órgãos distantes. Sialil Lewis antígenos nas células cancerosas estão envolvidos na adesão de selectina em células endoteliais dos vasos [16]. No entanto, o efeito de CD82 na selectina adesão celular mediada pelo ligando não foi ainda elucidado.

aqui investigados os efeitos do supressor de metástase CD82 /KAI1 no processo de adesão de células tumorais heterocelular ao endotélio de vasos sanguíneos, a fim de elucidar a função de tetraspanins. Nós demonstrou pela primeira vez que a síntese do antigénio sialil Lewis é regulado por um sistema CD82 /KAI1 mediada, e depois examinou os efeitos desse mecanismo na metástase de células de câncer em um rato modelo de metástase.

Materiais e Métodos

anticorpos e reagentes

os anticorpos monoclonais de ratinho (G-2) e anticorpos policlonais de coelho (C-16) contra KAI1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Foram utilizados os anticorpos perturbando funções seguintes: anti-LES

x (rato, monoclonal) e anti-LES

a (mouse, monoclonais) anticorpos, os quais foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology and MILLIPORE (Temecula, CA, EUA), respectivamente, bem como um anticorpo monoclonal de ratinho contra integrina β1, o qual foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA).

cultura celular

A linha celular humana H1299 (uma linha de células de carcinoma de pulmão de não pequenas células) e as suas linhas de células transf, H1299 /zeo e H1299 /CD82, foram estabelecidos no nosso laboratório por meio de transfecção de um vector de controlo ou de ADNc de CD82, respectivamente, e com base em ordenar uma célula técnica de selecção do clone, tal como descrito anteriormente [14]. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM; Sigma), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, EUA) e 2 mM de L-glutamina.

As duas linhas de células utilizadas neste estudo, H1299 /zeo e H1299 /CD82, foram descritos anteriormente [10]. H1299 /zeo é uma linha celular simulada transfectadas que exibe expressão CD82 fraca, enquanto H1299 /células CD82 sobre-expressa CD82 seguintes transfecção cDNA. A análise de imunotransferência mostrou que o nível da proteína CD82 em células H1299 /CD82 era 20 vezes mais elevada do que nas células H1299 /zeo de tipo selvagem ou, ao passo que a citometria de fluxo revelou que o nível da superfície da célula de CD82 em células H1299 /CD82 foi de aproximadamente 9- vezes a das células H1299 /zeo de tipo selvagem ou.

Animais e ensaio de metástase

Oito semanas de idade camundongos atímicos fêmea (BalbC cAJcl-nu) foram adquiridos de Kyudo (Fukuoka , Japão). Os ratos foram alojados em cabines de fluxo laminar sob condições específicas livres de patógenos e alimentados autoclavado água e dietas em locais aprovados pela Universidade de Kyushu. Cada gabinete continha 1-4 ratos por grupo experimental. Os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Animal da Universidade de Kyushu (Permit Number: A23-13-1).

Para os estudos de metástase pulmonar experimentais, 1,0 × 10

6 células ou veículo (PBS) só foram injectados através da veia da cauda. Os ratos foram separados aleatoriamente em 4 grupos: (A) sem tratamento (controle: injetados com apenas PBS), (B) H1299, (C) H1299 /zeo, e (D) H1299 /CD82. Cada grupo continha pelo menos 3 ratos (um total de 20 ratinhos foram usados). Oito semanas após a injecção, os ratos foram sacrificados mediante a administração de pentobarbiturate (100-120 mg /kg) para minimizar o sofrimento e os pulmões foram colhidos. Lung focos metastáticos foram contadas se eles podiam ser vistas a olho nu, tal como descrito anteriormente [15].

A análise de imunotransferência

Os lisados ​​celulares para imunobloting foram preparados em tampão de lise celular (1% de Triton X -100, ortovanadato de sódio 2 mM, NaCl 500 mM, MgCl 10 mM

2, 10 ug /mL de leupeptina, 10 ug /mL de aprotinina, PMSF 1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,2). Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), e incubadas com anticorpos primários específicos. As bandas de proteína foram visualizadas usando peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários e reagente de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA). As bandas foram verificados por densitometria assistida por computador (ChemiDoc XRS-J; Bio-Rad) e analisados ​​utilizando software Quantity One (Bio-Rad) como descrito anteriormente [14, 15]

rotulagem fluorescente de células vivas. e adesão celular ensaio

células H1299 vivos foram rotulados com Vybrant DiO e fez soluções de rotulagem celular (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

para quantificar células tumorais adesão a células epiteliais humanas da veia umbilical (HUVEC), um ensaio de adesão estático padrão foi realizada, como descrito anteriormente [17]. HUVECs (1,5 × 10

4 células) foram colocados em placas de microtitulação de 96 poços pré-revestidas com gelatina a 0,1% (Sigma) e cultivadas em DMEM de baixo teor de glucose com 20% de FBS e 0,1 ug /ml de base-FGF por dois -3 dias para estabelecer monocamadas de HUVEC confluentes. Marcado com fluorescência células H1299 (4,0 × 10

4 células /cavidade) foram adicionados à monocamada endotelial e deixadas aderir a 37 ° C durante 30 min.

Para examinar os efeitos de anticorpos de perturbação da função em adesão de células de cancro para a monocamada de HUVEC, H1299 células foram pré-tratados com 5 ug /ml dos anticorpos de função perturbando a 37 ° C durante 30 min, e foram, em seguida, aplicados à monocamada de HUVEC.

a os poços foram lavados 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e as células fixadas com metanol durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células aderentes foram quantificadas sob um microscópio de luz, utilizando um campo de alta potência (200 ×). Para cada uma das experiências em triplicado, o número de células em 5 campos aleatoriamente seleccionados foi determinada e as contagens foram em média.

A transfecção de ARN de gancho de cabelo curto (ARN sh)

H1299 cultivadas /CD82 e células H1299 /zeo foram transfectadas utilizando Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O H1299 /CD82-sh. /linhas de células CD82-sh.CD82 controlo e H1299 foram gerados por transfecção de células H1299 /CD82 com o pLKO.1-Puro Controlo vectorial (Sigma) e pLKO.1-Puro /sh.CD82: NM_002231 (Sigma), respectivamente [ ,,,0],18]. O H1299 /zeo-sh.control e H1299 /linhas celulares zeo-sh.ST3GAL4 foram gerados por transfecção Lipofectamine mediada por células H1299 /zeo com o pLKO.1-puro Controle de Vetores e pLKO.1-puro sh.ST3GAL4: NM_06081105 (Sigma), respectivamente. As colónias que apresentam resistência a puromicina (Sigma) a partir das experiências de transfecção individuais foram reunidas. O nível de expressão de CD82 e transfectadas ST3GAL4 em shRNA H1299 células foi monitorizada por RT-PCR e immunoblotting. Estas células foram mantidas em DMEM contendo FBS a 10% e 2 ug /ml de puromicina.

DNA microarrays

O ARN total foi extraído a partir de H1299 /zeo e células H1299 /CD82 utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). hibridação de micromatriz de ADN e de digitalização foram realizadas pela Affymetrix (Santa Clara, CA, EUA), utilizando o gene chip Affymetrix U133A HG-plus2.0. GCRMA em Bioconductor (https://www.bioconductor.org) foi utilizado para a análise da sonda e normalização dos dados de microarranjos.

A análise estatística (Estudante de

t

-teste) e uma bicicleta dobrável filtro de mudanças ( 3,0) (H1299 /CD82 vs. H1299 /zeo) foram realizadas sequencialmente para selecionar os genes significativos. Usando o recurso de definição de gene, todos os transferases que regulam sialil antígenos Lewis foram identificados e estão listados nas Tabelas 1 e 2.

em tempo real transcriptase (RT) -polimerase reacção em cadeia reversa (PCR )

O ARN total foi extraído a partir de células H1299 utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e utilizado para a síntese do ADNc da primeira cadeia. Os níveis de mRNA foram quantificados em triplicado utilizando um sistema de PCR em tempo real com o Kit de SYBR Verde Brilhante qPCR (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) como descrito anteriormente [18]. Os iniciadores específicos para a glicosiltransferase foram como se segue: (

ST3GAL1

: 5′-GCATAACGCCCATATAGAT-3 ‘e 5′-AAGGCTCTGACTGCTCTGT-3’;

ST3GAL2

: 5′-CTGGATGCTGGGACCTAC-3 ‘e 5’-GCTACTTGGAAGGCTGAGG-3 ‘;

ST3Gal3

: 5′-TCCTGGACGCACAATATC-3′ e 5′-GGTCTGAAGACTCCTGTGTA-3 ‘;

ST3GAL4

: 5′-AGTAGAAAACAACCCAGACAC-3′ e 5 ‘ -AGAGGTTGAGAATCCGAA-3 ‘; e

ST3GAL5

: 5′-TGCCTCAGTTCACCCTCA-3′ e 5′-TGGTGGTGTTTGTGTGCTG-3 ‘

As condições dos ciclos de PCR foram 10 min a 95 ° C durante um. ciclo, seguido de 45 ciclos cada um de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 60 s. Os amplicons são confirmou que os sinais são únicos por curva de dissociação da análise. Os níveis de expressão para cada amostra, obtido a partir de paralelo ensaios, foram normalizados para os do gene que codifica a desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (

GAPDH) e foram analisados ​​utilizando o pacote de software LightCycler2.0 System (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA).

resultados

a expressão ectópica de CD82 inibe a metástase pulmonar em camundongos

no primeiro experimento, confirmou o efeito metástase-inibitório de CD82 que tem sido relatado anteriormente, utilizando um modelo de metástase animais [17]. Para os estudos experimentais de metástases do pulmão, nos injectado células H1299 na veia da cauda de ratinhos nus atímicos fêmeas de 8 semanas de idade. Oito semanas após a injecção, quaisquer focos metastáticos foram observados e contados visualmente. CD82 mostraram um forte efeito inibidor sobre o tamanho e o número de focos de metástases do pulmão (Figura 1). Especificamente, os ratinhos transfectados com células H1299 /zeo mostrou 100% de metástases de pulmão (7/7), ao passo que os transfectantes CD82, H1299 /CD82, exibiram uma inibição significativa de metástases, com uma taxa de metástase de apenas 28,5% (07/02). Dado que a taxa de metástase pulmonar reflecte directamente a extensão da adesão celular aos vasos sanguíneos do pulmão, este resultado sugeriu que o CD82 desempenha um papel importante na adesão celular aos vasos sanguíneos.

As veias da cauda de ratinhos nus foram injectados com 1,0 × 10

6 H1299 /zeo ou células H1299 /CD82. Oito semanas após a injecção, os ratinhos foram mortos e os pulmões recuperado. focos metastáticos foram contadas por olho. A injeção de células H1299 /zeo resultou em 100 metástase pulmonar% (7/7), enquanto H1299 /células CD82 mostraram uma taxa significativamente menor de metástase (28,5%; 07/02).

ectópica expressão de CD82 inibe a adesão de células tumorais a HUVEC através de sialil Lewis antigénios

a adesão das células cancerosas dos vasos sanguíneos envolve a interacção de P-selectina e e sobre as células epiteliais de vasos sanguíneos com o LES correspondente

x e LES

a ligantes de carboidratos na superfície das células cancerosas [12]. Analisou-se o efeito de CD82 na adesão celular aos vasos sanguíneos, utilizando um ensaio de adesão de células previamente descrito em HUVECs [11]. foi anteriormente confirmado que expressam tanto HUVEC P- e E-selectina [11]. Observou-se que aproximadamente 65% das células /zeo H1299 carregados aderidas à monocamada de HUVEC. Por outro lado, as células H1299 /CD82 mostraram diminuição significativa de adesão celular, com apenas 6,6% de adesão à monocamada de HUVEC (Fig 2A e 2B). Pré-tratamento com anticorpos de perturbação de função contra SLE

x, SLE

a, ou integrinas b1 inibiu a adesão H1299 /zeo a HUVECs de 9,4%, 8,4% e 30,2%, respectivamente (Fig 2C). Em contraste, os anticorpos-perturbando função contra SLE

x /a não mostraram inibição significativa da H1299 adesão celular /CD82 para HUVECs. Estes resultados sugerem fortemente um papel inibidor para CD82 na adesão celular sialil Lewis-mediada.

marcado com fluorescência H1299 /zeo ou H1299 /células CD82 (4.0 × 10

4 células /poço) foram aplicadas a uma HUVEC cultura em monocamada e deixadas aderir a 37 ° C. células aderidas foram quantificadas após 30 min. Aderido H1299 /zeo (A) e H1299 /células CD82 (B) e o efeito de anticorpos perturbando função de adesão celular à monocamada HUVEC foram analisados ​​(C). células H1299 foram pré-tratados com 5 ug /ml dos anticorpos indicados e, em seguida, aplicados à monocamada de HUVEC. As experiências foram realizadas em triplicado e o número de células aderidas foi em média. As barras indicam o desvio padrão.

A expressão ectópica de CD82 reduz a síntese de sialil Lewis

A expressão do sialil Lewis antígenos em células H1299 foi analisada por imunotransferência (Fig 3). Sle

a foi detectado como bandas correspondentes a cerca de 97, 125 e 200 kDa, e o seu nível de expressão foi 5-8 vezes superior em células H1299 /zeo do que em células H1299 /CD82 (Fig 3A). Do mesmo modo, a expressão de SLE

X proteínas foi detectada a aproximadamente 90, 125, e 200 kDa, e foi 5-8 vezes superior em células H1299 /zeo do que em células H1299 /CD82 (Fig 3B). Estes resultados estavam de acordo com os resultados do ensaio de aderência de HUVEC

lisados ​​de células inteiras (200 ug) de células H1299 (H1299 /zeo, zeo;. H1299 /CD82, CD82; H1299 /CD82-sh.control , sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82, sh.CD82) foram resolvidas por 7,5% SDS-PAGE e analisadas por imunotransferência com anti-LES

a (a) ou anti-LES

x (B anticorpos). As mesmas membranas foram retirados e re-sondados para β-actina como um controlo de carga. As experiências foram repetidas em triplicado, e os dados mais representativos são mostrados.

Além disso, nós transfectadas H1299 /células CD82 com CD82 shRNA para confirmar se esta baixa regulação de sialil Lewis antígenos é um efeito direto da a expressão ectópica de CD82.

CD82

shRNA inibiu completamente a expressão de CD82 (Fig 3C) e, ao mesmo tempo, a produção de SLE

a e LES

x recuperou para os níveis de expressão observados em células H1299 /zeo.

a expressão ectópica de CD82 reduz os níveis de mRNA de genes de glicosiltransferase relacionados a sialil síntese Lewis

para examinar os mecanismos para a regulação de sialil Lewis antígenos por CD82, foi realizada uma análise de DNA microarray global do possível reguladores de sialil Lewis antigénios (todas as transferases). Como mostrado na Tabela 1, CD82 acentuadamente regulada para baixo (mudança 0,05 vezes) a expressão de

ST3GAL4

(sublinhada na Tabela 1). Em contraste, a expressão de genes que codificam para outras glicosiltransferases e grupos de grupos de transportadores de açúcar não foi significativamente alterado.

A seguir, examinou os efeitos de CD82 sobre os níveis de mRNA e proteína de ST3GALs utilizando PCR em tempo real (Figura 4) e imunotransferência (Fig 5), respectivamente. A expressão ectópica de CD82 não tinha efeito sobre a expressão de ST3GALs, com excepção de um decréscimo acentuado nos níveis de

ST3GAL4

de ARNm e de proteína.

O ARN total foi isolado a partir de células H1299 e analisados ​​por Real -tempo de RT-PCR. Os níveis de ARNm de genes que codificam para glicosiltransferases

(ST3GALs)

foram corrigidos em relação aos níveis de

GAPDH mRNA, com H1299 /zeo fixado em 1. Os dados são apresentados como a média ± SEM.

lisados ​​de células inteiras (300 ug) de células H1299 (H1299 /zeo, zeo; H1299 /CD82, CD82; H1299 /CD82-sh.control, sh.cont; H1299 /CD82-sh.CD82 , sh.CD82) foram resolvidas por 10% SDS-PAGE e analisados ​​por imunotransferência com anticorpos primários anti-ST3Gal. As mesmas transferências foram retirados e re-sondado para β-actina e CD82. As experiências foram repetidas em triplicado, e os dados mais representativos são mostrados.

Nós também avaliou se a redução da

ST3GAL4

em células H1299 /CD82 foi um evento específico do CD82 usando knockdown CD82. Seguindo knockdown de CD82, o nível de proteína de ST3GAL4 completamente recuperado para o nível observado em células H1299 /zeo.

ST3GAL4

shRNA reduz a produção de sLex

Para examinar se a jusante regulação da ST3GAL4 reduz a produção de sLex, nós derrubado

ST3GAL4

por transfecção estável de

ST3GAL4

shRNA. A expressão de

ST3GAL4

foi especificamente reduzido por shRNA em ambos os níveis de proteína (Fig 6A e 6B) mRNA e. O nível de proteína do LES

x foi significativamente reduzida em H1299 /células shST3GAL4 zeo (0,3 vezes de sh.cont H1299 /zeo). Em contrapartida, o nível de proteína de SLE

a não mostrou diferença significativa entre as células H1299 /zeo-sh.cont e H1299 /células zeo-sh.ST3GAL4. A constatação de que ST3GAL4 reduz especificamente LES

produção de proteína x sugeriu que o LES

x produção foi regulada pela expressão CD82 via

ST3GAL4

sub-regulação (Fig 7A e 7B).

A. O ARN total foi isolado a partir de células H1299 e analisadas por em tempo real de RT-PCR. Os níveis de ARNm de

ST3GALs

foram corrigidos em relação aos níveis de ARNm β-actina, com aqueles de H1299 /zeo fixado em 1. Os dados são apresentados como a média ± SEM. B. lisados ​​de células inteiras (300 ug) de células H1299 (H1299 /zeo, zeo; H1299 /CD82, CD82; H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /zeo-sh.control, sh.cont) eram resolvidas por 10% SDS-PAGE e analisados ​​por imunotransferência com anticorpos primários anti-ST3GAL4. As mesmas transferências foram retirados e re-sondado para β-actina. As experiências foram repetidas em triplicado, e os dados mais representativas são mostrados

(A) Os lisados ​​de células inteiras (300 ug) de células H1299 (H1299 /zeo, zeo;. H1299 /CD82, CD82; H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4; H1299 /zeo-sh.control, sh.cont) foram resolvidas por 10% SDS-PAGE e analisadas por immunoblotting com

a-LES anti ou anti-LES

x anticorpos. As mesmas membranas foram retirados e re-sondados para β-actina como um controlo de carga. As experiências foram repetidas 3 vezes, e os dados mais representativas são mostrados. (B) A análise densitométrica foi efectuada em (A), seguido por normalização para o valor densitométrico de β-actina e indicada como “valor da expressão relativa (β-catenina /β-actina)”. Os valores de expressão relativa a partir de 3 experiências individuais foram em média. As barras indicam o desvio padrão.

ST3GAL4

shRNA inibe a adesão celular a HUVECs

Finalmente, nós examinamos o efeito de shRNA mediada por down-regulação da

ST3GAL4

na adesão celular a HUVECs. A adesão celular a HUVECs mostrou aproximadamente 50% de inibição de tipo selvagem células H1299 /zeo depois

ST3GAL4

knockdown. No entanto, o nível de inibição de células shST3GAL4 H1299 /zeo não atingiu o de H1299 /CD82 (90% de inibição de H1299 /zeo; Figura 8).

marcado com fluorescência H1299 /zeo, H1299 /CD82, H1299 /zeo-sh.ST3GAL4, e células H1299 /zeo-sh.control (4,0 × 10

4 células /cavidade) foram aplicadas a uma cultura em monocamada de HUVEC e deixadas aderir a 37 ° C. células aderidas foram quantificadas após 30 min. células H1299 aderentes à monocamada de HUVEC foram analisados. As experiências foram realizadas em triplicado e o número de células aderidas foi em média. As barras indicam o desvio padrão.

Discussão

CD82 /KAI1 foi reportado como tendo propriedades anti-metastáticos e anteriormente foi confirmado ser um supressor de metástase. Nós já demonstrou uma nova função do CD82 na adesão intercelular homofílico E-mediada por caderina [15]. Neste estudo, foram examinados os efeitos de CD82 sobre a adesão celular heterofílica ao sangue ou vasos linfáticos, que é o passo inicial de metástases para órgãos distantes; e demonstrou a novela papel regulador do CD82 em sialil adesão celular Lewis-dependente. No nosso

In vivo

ensaio de metástase, CD82 mostraram um forte efeito inibitório sobre o tamanho e o número de focos de metástases do pulmão (Figura 1) na sequência da injecção directa de células cancerosas na veia da cauda do rato. Assim, os nossos resultados sugerem fortemente um papel para o CD82 inibidora na adesão das células cancerosas para as células endoteliais vasculares. Antígenos

sialil Lewis estão envolvidas no passo inicial da adesão celular de cancro para os vasos sanguíneos [16]. Numerosos estudos clínicos têm relatado que a expressão do LES

x e com SLE

um mucinas em células de tumor se correlaciona diretamente com a metástase, progressão de tumores, e mau prognóstico [2,3]. Uma vez que a adesão inicial através de sialil Lewis antigénios é estabelecida, a adesão mediada pela integrina segue [19]. Foi demonstrado que a adição de um anticorpo anti-integrina inibiu apenas parcialmente a adesão de células cancerosas e células HUVEC, sugerindo que a sialil Lewis inicial de adesão mediada por antigénio é essencial para a adesão de células de cancro para os vasos sanguíneos (Figura 2). A expressão ectópica de CD82 regulada para baixo a síntese de SLE

a /x (Fig 3), apoiando os resultados do ensaio de HUVEC aderência.

A via de biossíntese de LES

a e LES

X depende de uma variedade de enzimas, os quais catalisam a transferência de ácido siálico e fucose para o oligossacárido cadeias laterais de glicoconjugados. Resumidamente,

N

acetilactosamina (GlcNac) oligossacarídeos β1 é sintetizado por transferases GlcNAc. Com base em substratos β1 oligossacarídeos GlcNAc, β1, 3-galactosiltransferases (β3Gal-Ts) sintetizar a1 → 3 dissacarídeos (tipo 1) e cadeias β1, 4-galactosiltransferases (β4Gal-T) sintetizam a1 → 4 dissacarídeos (tipo 2 cadeias). Sialiltransferase (ST), pertencente ao

ST3Gal

família contém 6 subfamílias de enzimas. Entre estes, ST3Gal3 sialylates tipo 1 cadeias de produzir SLE

a, enquanto ST3Gal4 e -6 são obrigados a sialilar tipo 2 cadeias de LES

x produção.

Além sequencial de α1, 4-linked fucose ao tipo 1 correntes e fucose α1, 3-ligada ao tipo 2 cadeias de fucosiltransferase (fûts) finaliza a biossíntese de SLE

a e LES

x, respectivamente. A expressão de SLE

a e LES

x está associada a carcinogênese e progressão tumoral. A expressão do

ST

e

FUT

genes que codifica as enzimas necessárias para a biosíntese destes antigénios também está correlacionada com estes caracteres malignos. Aumento dos níveis de mRNA de

ST

e

FUT

são encontrados em vários tipos de tumores malignos.

expressão ST3Gal3

em pacientes com câncer de mama foi fortemente associada com mau prognóstico e reduziu a sobrevivência global [20]. Do mesmo modo, a expressão aumentada de

ST3GAL4

e

FUT4

foi relatada em carcinomas colorectais [21]. Por outro lado, a regulação negativa do

ST3GAL4

tem sido observado em tecidos de cancro colorrectal e carcinoma de células renais humana [22,23]. No cancro gástrico, os níveis de expressão

ST3Gal3 e

FUT4

ARNm foram significativamente aumentada em tecidos de carcinoma de [24]. Além disso, a expressão de

FUT4

e

Fut7

mRNA foi relacionado a um pior prognóstico em pacientes com câncer de pulmão [25], eo aumento da atividade de a1,3 /4-fûts foram observados no ovário carcinoma comparação com o tecido saudável [26] Chandrasekaran et al., 1992 EV Chandrasekaran, R. K. Jain e K. L. Matta, ovário cancro alfa 1,3-L-fucosil-transferase. Diferenciação de espécies catalíticas distintas com o substrato original, 3′-sulfo-N-acetillactosamina em conjunto com outros aceitadores sintéticos,

J Biol Chem

267 (1992), pp. 23806-23814. Ver Record em Scopus Citado em Scopus (26). Estes relatórios sugerem que os papéis de

ST

e

FUT

diferem em vários tipos de câncer

in vivo

.

Em nosso modelo, CD82 down-significativamente regulada (variação de 0,05 vezes) a expressão de

ST3GAL4

. Em contraste, a expressão de outros grupos de glicosiltransferases e grupos transportadores de açúcar não foi significativamente alterado. Knockdown de

CD82

mRNA por shRNA em H1299 /células CD82 resultou na recuperação de

ST3GAL4

expressão e síntese de SLE

a /x, sugerindo que CD82 tem efeitos específicos sobre

expressão ST3GAL4

.

Como mencionado acima,

ST3GAL4

normalmente sintetiza só o LES

x e nossa

ST3GAL4

estudo knockdown apresentaram resultados que indicam uma específica para baixo Regulamentação do SLE

x em H1299 /Zeo células shST3GAL4. Em contraste, a expressão ectópica de CD82 reduziu a síntese de SLE

a e LES

x, simultaneamente. Este tipo de discrepância tem sido relatado previamente. A atividade enzimática da proteína recombinante ST3GAL4 foi eficaz para ambos os dissacarídeos tipo 1 e tipo 2

in vitro

, enquanto que

in vivo

, foi eficaz apenas para o tipo 2 substratos [27] Sasaki et al ., 1993 K. Sasaki, E. Watanabe, K. Kawashima, S. Sekine, T. Dohi e M. Oshima

et al

., Expression clonagem de um romance Gal beta (1-3 /1- 4) GlcNAc alfa-2,3 sialiltransferase utilizando selecção resistência lectina,

J Biol Chem

268 (1993), pp. 22782-22787. Ver Record em Scopus | Por Citado em Scopus (113). Os dados produzidos em nossa análise microarray pode fornecer outro mecanismo para explicar esta discrepância. A fraca infra-regulação de β

3galT

(variação de 0,7 vezes, sublinhado na Tabela 1), que sintetiza tipo 1 dissacarídeos, foi encontrado. É possível que mesmo esta fraca infra-regulação de β

3galT

pode resultar em uma diminuição da regulação significativa de SLE

a, porque um dissacarídeo tipo 1 é o elemento núcleo essencial dos seus derivados (Le

b, Le

a, e LES

a).

Conclusões

em conjunto, nossos dados sugerem que a expressão ectópica de CD82 reduz significativamente os níveis de SLE

x /a, que por sua vez reduz a adesão de células de cancro para os vasos sanguíneos. Assim, propomos que a diminuição da expressão de

ST3GAL4

mRNA desempenha um papel fundamental na CD82 mediada por regulação negativa do LES

x /a, especialmente a de SLE

x. Por conseguinte, conclui-se que CD82 regula negativamente ST3GAL4 e regula sialil Lewis adesão de células de cancro mediada por antigénio para os vasos sanguíneos e, desse modo, a inibição de metástases de células de cancro. Nossos resultados demonstram uma função nova para CD82 na regulação dos antígenos sialil Lewis.