Abstract

Fundo

Embora a perda relacionada à idade do cromossomo Y (LOY) em células hematopoéticas normais é um fenómeno bem conhecido, as consequências fenotípicas de LOY ter sido evasivo. No entanto, LOY foi encontrada em associação com o tabagismo, a sobrevivência menor e maior risco de cancro. Foi sugerido que LOY nas células do sangue pode tornar-se um biomarcador preditivo da carcinogênese masculino

objetivos, métodos e amp.; Achados

Para investigar a associação de LOY nas células do sangue com o risco de desenvolvimento de câncer colorretal (CC) e próstata (PC), analisamos amostras de DNA de sangue periférico de 101 pacientes do sexo masculino CC (idade média de 60,5 ± 11,9 anos), 70 pacientes de PC (idade média de 68,8 ± 8,0 anos) e 93 homens saudáveis ​​de controle (idade média de 65,8 ± 16,6 anos). A metodologia incluiu co-amplificação de sequências homólogas no cromossomo Y e outros cromossomos usando fluorescente quantitativa multiplex (QF) PCR seguido de detecção automática e análise sobre ABI 3500 Genetic Analyzer. O rácio significativo Y /X foi significativamente menor no grupo total de pacientes com cancro (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) em comparação com os controlos (0,15 ± 1,015), bem como em CC (± 0,884 0,15; p = 3.76×10

pacientes PC (0,941 ± 0,06 -9) e; p = 0,00012), quando analisado separadamente. análise de regressão logística multivariada ajustada para LOY e idade mostrou que LOY é um preditor mais significativo da presença de câncer do que a idade, e que a idade provavelmente não contribuem para o aumento do número de indivíduos com LOY detectável em pacientes com câncer de coorte.

conclusão

em conclusão, os nossos resultados apoiam as descobertas recentes de associação de LOY em células sanguíneas com a carcinogênese em homens

Citation:. Noveski P, Madjunkova S, Sukarova Stefanovska E, Matevska Geshkovska N, Kuzmanovska H, ​​Dimovski A, et al. (2016) Perda de cromossomo Y no sangue periférico dos colorretal e câncer de próstata. PLoS ONE 11 (1): e0146264. doi: 10.1371 /journal.pone.0146264

editor: Ezio Laconi, Universidade de Cagliari, Itália

Recebido: 14 de setembro de 2015; Aceito: 15 de dezembro de 2015; Publicação: 08 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Noveski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo projecto 13-3595 /1 de Ministério de Educação e Ciência, República da Macedónia (a DPK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Perda de cromossoma Y (LOY) é um fenómeno bem conhecido que está associado com o envelhecimento e observadas com frequências variáveis ​​em células da medula óssea [1,2] ou em células de sangue periférico a partir de [3,4] saudável homens mais velhos. A associação de LOY com cancros hematológicos foi indescritível. No entanto, tem sido relatado LOY em leucemias [5,6,7,8] e em pacientes previsível que tenha uma fraca resposta à terapia do cancro [9]. Outros estudos descobriram a associação apenas em pacientes que apresentaram LOY em mais de 75% [10] ou 100% das células afetadas [11]. estudo recente investigando LOY em duas fracções de células sanguíneas periféricas separadas encontrada significativamente maior frequência de LOY em células CD34 + em pacientes com síndromes mielodisplásicas comparação com os homens idosos sem doenças hematológicas [12]. Um estudo mostrando nenhuma associação entre LOY e cancros hematológicos também foi publicado [13].

Uma associação de LOY tem sido relatada em células cancerosas de câncer urotelial da bexiga [14], câncer pancreático [15], carcinoma de esôfago [16], carcinoma da cabeça e do pescoço [17], carcinoma de células renais [18] e em linhas celulares de cancro de carcinoma hepatocelular [19]. Estes estudos centraram-se na LOY no próprio tumor, como um marcador para o subtipo do cancro e /ou a progressão da doença e possível resultado.

Vários estudos investigaram mosaico LOY em células de sangue periférico em relação à presença de doença. Encontrou-se associação com cirrose biliar primária [20], tiroidite auto-imune [21], mas não com o cancro da mama masculino [22]. Grandes estudos com base na matriz de coorte SNP encontrado uma associação de mosaico LOY em células do sangue periférico com o aumento do risco de câncer, menor sobrevida e tabagismo [23,24].

Nós aqui apresentar nossos resultados de um estudo de associação de LOY em células do sangue periférico em pacientes do sexo masculino com colorretal e próstata.

Materiais e Métodos

assuntos

Foram estudados 101 pacientes do sexo masculino com cancro colo-rectal (com idade média de 60,5 ± 11,9 anos ), 70 pacientes do sexo masculino com cancro da próstata (idade média de 68,8 ± 8,0 anos) e 93 homens saudáveis ​​da população geral (idade média de 65,8 ± 16,6 anos). assuntos de câncer foram recrutados a partir do Departamento de Urologia da Faculdade de Medicina, Skopje, Macedônia e foram encaminhados ao Laboratório farmacogenética, Faculdade de Farmácia, enquanto que amostras de DNA de controles saudáveis ​​foram obtidos a partir do banco de DNA no RCGEB “Georgi D. Efremov “. Algumas características clínico-patológicas dos tumores dos pacientes com câncer são apresentados na Tabela 1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Academia Macedônia de Ciências e Artes (Aprovação No. 2010/1) e do Comité da Faculdade de Farmácia de Ética, Universidade Ss Cirilo e Metódio (Aprovação No. 03-95), Skopje, Macedônia. Todos os indivíduos deram consentimento informado para participação no estudo de acordo com a Declaração de Helsinki.

isolamento de ADN

DNA foi isolado de sangue total. Após a lise, os leucócitos foram sedimentado e digerido com proteinase K e O DNA foi extraído seguindo o protocolo de fenol-clorofórmio padrão.

Determinação da LOY mosaico no

sangue

Presença de LOY foi determinado com multiplex quantitativa fluorescência de reação em cadeia da polimerase (QF-PCR) originalmente desenvolvido para a detecção de microdeleções em regiões AZF do cromossomo Y e cromossomo sexual aneuploidias em pacientes com infertilidade masculina [25,26]. quantidade relativa de cromossomo Y foi avaliada através da relação de sinal fluorescente de sequências curtas co-amplificado a partir de Y-X genes amelogenina homólogo chromosomeY /chromosomeX (Y /X) (

amely

e

AMELX

).

AMELX

contém um par 6 base de exclusão (pb) no intron 1 que está faltando no

amely

, de modo que os fragmentos de co-amplificadas são dimensionados 112 pb do cromossomo Y e 106 pb do cromossomo X e são facilmente separados e quantificados por electroforese capilar (~ 1: 1 de 112/106 picos bp em amostras de DNA normais do sexo masculino e presença de apenas 106 pb pico nas amostras de ADN do sexo feminino) [27]. Resultados falsos positivos em caso de perda ou ganho de cromossomo X foram controladas por amplificação de 152 pb fragmento do

TAF9B

gene no cromossoma X com iniciadores que também co-amplificar 148 bp sequência homóloga no cromossomo 3. O rácio das áreas dos picos dos dois fragmentos de co-amplificado (148/152 pb; cromossoma 3 /cromossoma X) é ~ 2: 1 em amostras de ADN normais do sexo masculino e ~ 1: 1 em amostras de ADN fêmea normais

. deleções ou duplicações em

amely e região foram excluídos por outros dois conjuntos de iniciadores. O primeiro amplifica sequências homólogas de

gene DAZL

no cromossomo 3 (duas cópias de 217 fragmento pb) e

DAZ

genes no cromossomo Y (quatro cópias de 214 fragmento pb). O outro conjunto de primers amplifica o

MYPT2

gene no cromossomo 1 (175 fragmento pb) e duas sequências homólogas (fragmentos de 180 pb) a partir do cromossoma Y. sequências primer e condições de PCR para multiplex QF-PCR foram como descrito em outros lugares [ ,,,0],26]. Co-amplificados Os produtos de PCR marcados fluorescentemente foram executados no Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer com LIZ500 como padrão interno e analisados ​​com o software GeneMapper 4,1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). electrophoregrams representativos de dois sujeitos, um com com amelogenina Y /X ~ proporção de 1 e um com amelogenina Y /X razão de 0,28 são mostrados na Figura 1.

Electrophoregrams de indivíduos com um) amelogenina Y normal /X proporção (aproximadamente iguais áreas de pico de cromossomo X e seqüências do cromossomo Y) e b) paciente com câncer colorretal e aumentou significativamente a proporção de células com LOY (amelogenina relação Y /X de 0,28).

a fim para validar a metodologia QF-PCR foram utilizadas duas amostras diferentes de ADN: uma amostra normal do sexo masculino (46, XY), e uma amostra com síndrome de Turner (45, X 0) (para imitar as células com LOY). Ambas as amostras foram misturadas em diferentes proporções para representar as amostras com 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% e 90% LOY. Antes da análise de ambas as amostras foram ajustadas para a mesma concentração. concentração de ácido nucleico e pureza da amostra foram determinadas por NanoVue ™ Além disso espectrofotômetro (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), enquanto a concentração de DNA de cadeia dupla precisão foi medida com Qubit

® kit de ensaio dsDNA HS em um Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). Com ambas as medições de concentrações de ADN e pureza de ambas as amostras eram idênticos.

A reprodutibilidade da determinação /X Y proporção foi medida através da repetição da amplificação QF-PCR e análise em 11 indivíduos com amelogenina Y /X proporção inferior a 0,80 . Além disso, o coeficiente de variação da amelogenina Y /X relação foi calculada a partir da repetido QF-análises PCR realizado em 14 indivíduos com Y /X razão entre 0,8-1,0 e 12 indivíduos entre 1,0-1,2. Para eliminar o possível viés de diferentes PCR set ups, reações de PCR para um terço dos controles saudáveis ​​e dois terços dos pacientes com câncer foram realizadas simultaneamente em cada um dos PCR é executado.

A análise estatística

as diferenças entre médias de dois grupos foram analisados ​​com o teste t de Student depois de avaliar para a igualdade de variâncias com o teste Levene`s. Correlação entre duas variáveis ​​foi analisada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r). Limite de detecção foi calculado com base no desvio padrão da resposta e a inclinação de uma linha de regressão [28]. As diferenças entre as médias das medições repetidas foram analisadas com o teste de amostras pareadas t. regressão logística multivariada foi utilizada para modelar a associação de LOY e variáveis ​​idade com presença de câncer. O nível de significância foi considerado quando o valor de p foi menor que 0,05. Coeficiente de variação a partir de medições duplicadas foi calculado com MedCalc para Windows, versão 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Bélgica) de acordo com sua metodologia descrita. analisa os dados para todos os outros testes estatísticos foram realizados usando Statistical Package for Social Sciences, versão 19 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

Resultados

Validação da amelogenina Y /X relação de pico como um método para a detecção de mosaico LOY em células de sangue e testes de reprodutibilidade

46, XY amostra de ADN normal e nove amostras de ADN misturados com diferentes proporções de 46, XY e 45, as amostras de ADN foram amplificadas X0 em triplicado e correspondentes amelogenina Y rácio /X foi obtido para cada proporção. análise de correlação com base em valores médios de medições em triplicado mostrou forte correlação negativa (r = -0,999, p = 8.03×10

-13) entre o percentual de 45, amostra X0 e amelogenina Y /X ratio.

A limite de detecção (LOD) de LOY foi calculado em 4,6%, com desvio-padrão e inclinação da linha de regressão dos valores médios de medições em triplicado (Fig 2). amelogenina

pontos representam valores médios /X razão y correspondendo a 0%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70% e 90% do 45, X0 nas amostras de ADN mistos. linha de regressão foi estimada utilizando percentagem de 45, amostra X0 como independente e amelogenina Y /X rácio como variável dependente. Slope (s) e desvio padrão (σ) da linha de regressão foram utilizados para calcular o limite de detecção utilizando a fórmula LOD = 3.3σ /s [28].

A reprodutibilidade do amelogenina Y /rácios X foi avaliada em 37 indivíduos. O baixo coeficiente de variação de 4,62% ​​e não houve diferença significativa nas médias entre duas medições (p = 0,1097, teste t pareado) confirmar que QF-PCR é um método confiável para a estimativa da amelogenina y /x rácios.

Mosaic LOY nas células do sangue é significativamente associada com a presença de câncer

Analisamos a /X rácio Y usando QF-PCR em 264 amostras de DNA isoladas a partir de leucócitos de sangue periférico em pacientes com câncer colorretal (n = 101 ), o câncer de próstata (n = 70) e controles saudáveis ​​(n = 93), pareados por idade. Distribuição das S /rácios X é apresentado como histogramas da Figura 3. A média de Y rácio /X foi significativamente menor em doentes com cancro (0,907 ± 0,12; p = 1.17×10

-9) do que os controles (1.015 ± 0,15) . A significância estatística foi mantida também quando médios y /x proporções de doentes com câncer colorretal (0,884 ± 0,15; p = 3.76×10

-9) pacientes com câncer de próstata e (0,941 ± 0,06; p = 1.15×10

-4) foram analisados separadamente.

Os valores médios e desvios-padrão são também mostrados.

por meio de regressão logística multivariada modelamos percentagem de LOY (inferida a partir de amelogenina Y /X ratio) e idade para avaliar a sua força para prever a presença de cancro. Ambas as variáveis ​​de previsão foram utilizados como variáveis ​​contínuas, enquanto resultado foi a presença do câncer e sem câncer como referência (Tabela 2). LOY percentual prevê a presença de câncer com uma força significativa (p = 2.043×10

-9), enquanto a idade mostrou apenas significância limítrofe (p = 0,024). As duas variáveis ​​de previsão do modelo sugerem que o aumento da idade quando o ajuste de porcentagem LOY não aumenta o risco para a presença de câncer em nossa coorte de pacientes com câncer.

Discussão

Um número de grupos de pesquisa estão investigando biomarcadores de câncer não-invasivo para melhorar o diagnóstico precoce e tratamento de doentes com cancro. Recentemente, LOY foi sugerido como um possível biomarcador para diferentes tipos de câncer em homens. Os dados de grandes grupos associados LOY no sangue periférico, com o risco de mortalidade por todas as causas e mortalidade por câncer de não-hematológica [23]. são necessários estudos caso-controle de confirmação associando LOY mosaico em células do sangue periférico com o aumento do risco de câncer.

Para contribuir para o esclarecimento do papel do LOY no sangue periférico como um biomarcador de câncer em homens, temos realizado caso estudo de controlo em pacientes do sexo masculino com dois tipos diferentes de cancro.

a metodologia usada foi baseada na determinação indirecta da presença LOY por QF-PCR, medindo a razão das áreas dos picos dos fragmentos de PCR marcados com fluorescência de comprimentos fixos representando sequências homólogas no cromossomo Y e algum outro cromossomo. Esta metodologia de medição da razão entre as áreas de pico é amplamente utilizado no diagnóstico pré-natal rápida de aneuploidias dos cromossomas comuns [29]. É também utilizado para a detecção de cromossomas sexuais aneuploidias, bem como para deleções e rearranjos em regiões AZF no cromossoma Y [25]. Em contraste com a análise citogenética de células sanguíneas em cultura (apenas linfócitos T) o que é demorado e sujeito a artefactos técnicos, tais como perda de cromossomas durante a preparação da lâmina [3], a metodologia QF-PCR é realizada sobre um ADN isolado a partir de leucócitos a partir de sangue inteiro , e é barato e mais robusto. Não fomos capazes de comparar os resultados de amelogenina y /x rácios usando contagem direta de células com análise citogenética, mas validaram a metodologia através da simulação LOY com o uso de 45, amostra de DNA X0. A alta correlação entre 45, porcentagem X0 e amelogenina Y /X Relação confirma que QF-PCR é um método confiável para a estimativa das y /x rácios. Embora haja relatos de

amely

dropout alélico como resultado da eliminação nesta região do cromossomo Y, o aumento da frequência é relatada principalmente em populações asiáticas [30,31,32]. Não detectamos perda de

amely

entre os homens incluídos no estudo, bem como mais de 4000 amostras do sexo masculino analisados ​​no nosso laboratório para a presença do aneuploidias cromossômicas mais comuns, paternidade e infertilidade masculina (dados não publicados).

Em nosso estudo, foram incluídos pacientes do sexo masculino com câncer de próstata e câncer colorretal. Embora a amelogenina Y /X proporção não dá um valor preciso da percentagem de células com LOY, os valores da relação obtidos médios dentro mesmas condições experimentais representam uma reflexão aproximado para extensão da LOY para os grupos estudados. Os médios y /x rácios foram significativamente menores nos pacientes colorectal do que pacientes com câncer de próstata. O maior percentual de pacientes com LOY em nossa coorte de pacientes com câncer é consistente com as descobertas recentes que mostram significativamente aumento da frequência de cromossomos sexuais monossomias em pacientes com cancro do pulmão e da bexiga em comparação com controles saudáveis ​​[33].

Devido LOY é relatado para ser associado com a idade, que têm acompanhado os nossos pacientes com câncer e controlar indivíduos não-cancerosas com a idade e, posteriormente, idade e percentual LOY para previsões presença câncer modelado. Os resultados mostraram que o aumento do número de indivíduos com LOY em nossa coorte de pacientes com câncer, provavelmente não é influenciada pela sua idade.

O mecanismo exato pelo qual as células estão perdendo cromossomo Y não é conhecido. Um mecanismo proposto é a influência do encurtamento do telômero durante o envelhecimento que leva a grater instabilidade e de degradação do cromossomo Y, que tem telômeros mais curtos do que os autossomos [34]. Outro mecanismo proposto está relacionada com o estabelecimento do cromossoma Y para replicar no final da fase S [21], diminuindo assim o tempo do ciclo celular (e perder cromossoma Y) pode dar uma vantagem proliferativa para uma doença afectada organismo. Diferentes vias pode ser activado, conduzindo a diferentes taxas de proliferação, o número de células hematopoiéticas com LOY em diferentes tipos de cancro em resposta a sinais a partir de células cancerosas. Variação no genoma entre populações diferentes de cancro poderia, adicionalmente, modular a resposta de células hematopoiéticas para sinais celulares de cancro. Evidência adicional para este mecanismo proposto de sinal induzida LOY está relacionado com o facto de fumar tem um transiente e efeito mutagénico dependente da dose no estado LOY-[24]. Além disso, este mecanismo está de acordo com a influência proposta da sinalização microambiental tecido alterada sobre a evolução somática de uma forma dependente da idade [35]. Recentemente, a hematopoiese clonal com as mutações somáticas foi demonstrado não só a ser cada vez mais comum nos idosos, mas também para aumentar o risco de doenças malignas hematológicas e morte [36,37], com a possibilidade de que todas as causas de mortalidade é devido a um aumento do risco de doenças cardiovasculares [36]. Estes estudos analisados ​​apenas variantes de nucleotídeo único e pequenas indels e não relatam grande aberração como a perda cromossomo Y. Além disso, grandes anomalias cromossómicas ( 2Mb) de autossomos em DNA a partir de sangue foram encontrados para ser mais freqüente entre indivíduos com tumores sólidos do que em indivíduos sem câncer [38]. Seria interessante observar se ocorrência de LOY, mutações somáticas e /ou de certos tipos de anomalias cromossómicas são ligados e presentes em conjunto mesmas células ou tipos de células. Se comprometimento da saúde promove ocorrência simultânea de diferentes tipos de mutações genómicas, o LOY mosaico facilmente detectável poderia tornar-se um biomarcador valioso.

Em conclusão, os resultados do nosso estudo de caso-controle mostrou forte ligação entre a presença do câncer e mosaico LOY em sangue periférico de homens afectados com cancro do cólon e da próstata sendo os dois tumores sólidos mais comuns nos homens. Eles também suportam descobertas recentes de associação de LOY no sangue com a carcinogênese em homens.