Abstract

A ativação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutações são reconhecidos biomarcadores para pacientes com não-metastático cancro do pulmão de células pequenas (NSCLC) tratados com inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI). TKI EGFR pode também ter actividade contra NSCLC sem mutações de EGFR, que requer a identificação de biomarcadores adicionais relevantes. Estudos anteriores sobre os níveis de proteína EGFR tumor e número de cópias do gene EGFR revelaram resultados inconsistentes. O objectivo do estudo foi o de identificar novos biomarcadores da resposta ao TKI em NSCLC de investigar a expressão do genoma inteiro no nível exão. Utilizou-se matrizes de exões e amostras clínicas, a partir de um ensaio anterior (SAKK19 /05) para investigar as variações de expressão no nível do exão de 3 genes potencialmente desempenhar um papel chave na modulação da resposta ao tratamento: EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rato viral homólogo oncogene (KRAS) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGFA). Identificamos a expressão de EGFR exão 18 como um novo marcador preditivo para pacientes com NSCLC metastático não tratado tratados com bevacizumab e erlotinib no primeiro ajuste de linha. A sobre-expressão de EGFR exon 18 no tumor foi significativamente associada com redução do tumor, independentemente do estado da mutação EGFR. Uma associação significativa semelhante pode ser encontrado em amostras de sangue. Em conclusão, a expressão do EGFR exônico particularmente no exão 18 foi encontrado para ser um biomarcador preditivo relevante para a resposta ao bevacizumab e erlotinib. Com base nestes resultados, propomos um novo modelo de teste EGFR no tumor e sangue

Citation:. Baty F, Rothschild S, Früh M, Betticher D, Dröge C, Cathomas R, et al. (2013) EGFR Exon-Nível Biomarkers da Resposta ao Bevacizumab /Erlotinib em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (9): e72966. doi: 10.1371 /journal.pone.0072966

editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |

Recebido: 06 de março de 2013; Aceito: 16 de julho de 2013; Publicação: 10 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Baty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O Exon análise de arranjo foi financiada pelo grupo suíço para Clinical Cancer Research (SAKK). As principais atividades experimentais foram apoiados pelo Secretariado da Swiss Estado de Educação e Pesquisa (SER) e Roche Pharma (Schweiz) AG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. LB recebeu honorários da Roche e Astra Zeneca para palestras e participação de reuniões do Conselho Consultivo. OG declara ter recebido honorários por conselho consultivo. Todos os outros autores declaram não ter nenhum interesse competindo. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O prognóstico dos pacientes com não-pequenas células de pulmão em estágio IV (NSCLC) continua ser pobre. Apesar da quimioterapia citotóxica padrão, quase 50% não sobrevivem mais do que 12-14 meses [1], [2]. Nos últimos anos, as melhorias nas taxas de sobrevivência foram principalmente alcançados pela descoberta de marcadores moleculares preditivos, que identificaram subgrupos de pacientes provenientes de um substancial benefício de tratamento-alvo. Vários ensaios de fase III randomizado demonstraram recentemente uma vantagem significativa de os inibidores de tirosina cinase do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR-TKI) em doentes sem tratamento prévio de quimioterapia ancorando uma mutação de activação de EGFR [3] – [6]. mutações de EGFR são encontrados em cerca de 10-15% dos pacientes caucasianos [7]. Em pacientes com EGFR de tipo selvagem no tratamento de primeira linha com um TKI de EGFR pode mesmo danos comparativamente à quimioterapia convencional [8]. No entanto, em doentes sem quimioterapia anterior não selecionados o papel do EGFR-TKI é menos claro e estudos anteriores demonstraram resultados inferiores com TKI com ou sem bevacizumab comparação com quimioterapia [9] – [11]. Estes resultados indicam que existe um subgrupo de pacientes com EGFR de tipo selvagem que pode beneficiar do tratamento com um inibidor da tirosina quinase ou um TKI de mais um agente anti-angiogénico. O mesmo vale para pacientes não selecionados e pré-tratados, onde o papel de TKI tem sido abordada em numerosos ensaios e as taxas de eficácia e de sobrevivência têm mostrado ser comparável à quimioterapia convencional [12] – [14]. Além disso, analisa biomarcador recente de três grandes ensaios terapia de manutenção com erlotinib teste demonstrou claramente, que um subconjunto de pacientes com EGFR de tipo selvagem também derivar um benefício significativo da terapia de TKI de EGFR-[15] – [17].

Ao lado de EGFR outras mutações oncogénicas druggable em NSCLC avançado foram descritos [18], [19]. Infelizmente, a maioria dos pacientes com NSCLC não abrigam um alvo molecular que corresponde, portanto, a quimioterapia continua a ser o seu primeiro tratamento de escolha. Portanto, a identificação de novos subgrupos de pacientes que possam derivar benefício do tratamento alvo de explorar marcadores moleculares adicionais é crucial.

O tratamento com bevacizumab e erlotinib (BE) tem benefícios potenciais sobre a quimioterapia, particularmente em conta a sua mais perfil de toxicidade favorável. Existem evidências, de que a adição do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) tendo como alvo o bevacizumab anticorpo monoclonal para as exposições de EGFR erlotinib-TKI maior eficácia em comparação com erlotinib isoladamente em pacientes não seleccionados, que foram previamente tratadas com quimioterapia [20]. Esta observação provavelmente resulta da atividade erlotinib reforçada, dada a falta de eficácia da monoterapia bevacizumab no câncer de pulmão.

O grupo suíço para Clinical Cancer Research (SAKK) relatou recentemente um tempo médio de progressão (TTP) de 4,1 meses em doentes com NSCLC avançado não tratado não-escamosas tratados com BE [21]. Este resultado parece ser inferior ao que seria de esperar com combinações de quimioterapia modernas em populações de pacientes semelhantes [2], [22]. No sub-estudo atual, buscou-se identificar um subgrupo potencial de pacientes que participam no ensaio SAKK 19/05, em particular dentro do grupo de tipo selvagem EGFR, que podem se beneficiar do tratamento com BE. O principal objetivo deste estudo foi avaliar a correlação de variações de expressão de nível exão de 3 genes específicos [EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rato homólogo oncogene viral (KRAS) e vascular fator de crescimento endotelial A (VEGFA)] eo resposta à primeira linha BE terapêutica em doentes que participaram no estudo SAKK 19/05.

resultados

características do paciente e os resultados clínicos

o julgamento SAKK 19/05 incluiu 103 pacientes, 101 foram avaliados para a análise estatística primária. No geral, a idade média foi de 65 (variação, 32-80) anos. Todos os pacientes estavam em uma boa performance status (OMS 0-1), 48 eram do sexo masculino (48%), 53 eram do sexo feminino (52%). A maioria (86%) tinham doença em estágio IV. mutações de EGFR foram identificados em 15 pacientes (15%). Um paciente teve uma T790M mutação de resistência primária no exão 20. mutação KRAS foram identificados em 13 pacientes (13%). tumor respostas objetivas às 12 semanas (PR ou CR) foram observadas em 15 pacientes (15%). Estes doentes tinham o seguinte estado mutacional EGFR: EGFR del19 (n = 5), L858R (n = 2), estado mutacional desconhecido (n = 1), e o EGFR de tipo selvagem (n = 8). Um paciente com o EGFR do tipo selvagem e a resposta ser uma terapia teve uma mutação G12D KRAS.

A partir destes pacientes, o tecido do tumor para análise matriz exão foi obtida a partir de 42 pacientes e amostras de sangue de 75 pacientes (Tabela S1 na Informações de Apoio). Uma descrição pormenorizada das características dos pacientes é fornecida na Tabela 1 (amostras de tecido de tumor) e no Quadro 2 (amostras de sangue). As amostras de tecido correspondeu ao nosso conjunto de dados primários utilizados para a identificação de biomarcadores. Amostras de sangue foram utilizadas para fins de confirmação (conjunto de validação).

Meta análise de expressão gênica no nível exão

growth factor-receptor epidérmico (EGFR).

expressão do gene EGFR foi medida a 451 loci, dos quais 51 foram situado a exons, e 400 foram situado fora de exons,

ou seja

intrônica, intergênico ou não eram confiáveis ​​(Figura 1, painel superior). Assim, um total de 51 sondas de exões intensidades de expressão foram medidos no interior do gene de EGFR. Uma medida resumo de todos estes conjuntos de sondas de nível exão foi fornecido pelo PCA (pontuação no primeiro eixo PC). Foi avaliada a associação entre esse resultado e TS12 e TTP sob BE, OS, e TTP sob quimioterapia.

Os carrapatos vermelhos mostram as sondas ex�icas, os carrapatos cinza exibir as sondas não-ex�icas (intrônicas, intergênicas e não confiáveis ). Em EGFR, KRAS e VEGFA, um total de 51 dos 451, 13 do 262 e 25 de 26 sondas ex�icas foram medidos, respectivamente. Todas as outras sondas foram situado fora de exons,

ou seja

intrônica, intergênico ou não eram fiáveis.

Nós encontramos uma correlação significativa entre a pontuação EGFR PCA e TS12 após BE tratamento (Spearman,) (Figura 2A, painel da esquerda). Uma análise detalhada de sondas-a-conjunto de sondas revelou que 86% das sondas ex�icas mostrou uma correlação significativa com a redução do tumor sem correção para testes de múltipla () (Figura 2B, painel esquerdo). Duas sondas mostrou particularmente forte correlação com TS12 (sondas de exão ID 3.002.770 e 3.002.769), que permaneceu significativa após a correção de Bonferroni para múltiplos testes. Estes 2 conjuntos de sondas estão localizados no exão 18 (cromossoma 7, posiciona 55’238’440 e 55’238’092, respectivamente). Nenhum outro foram encontradas associações significativas. Seis pacientes tinham TTP de 15 meses ou mais. Três delas tiveram EGFR del19, e 3 foram EGFR e KRAS do tipo selvagem.

Row A descreve a associação entre a redução do tumor na semana 12 ea pontuação composta de nível exão (PCA eixo 1) para EGFR, KRAS e VEGFA (esquerda, centro e direita, respectivamente). As pontuações PCA são definidas como as coordenadas dos pacientes em um novo espaço definido pela combinação linear dos valores de intensidade de sondas originais usando análise de componentes principais. Os pacientes com mutações EGFR são marcadas em vermelho, aqueles com estado mutacional não disponíveis são mostrados como círculos vazios. A linha B mostra a importância da correlação (-log (-valor)) entre cada conjunto de sondas exão ea redução do tumor na semana 12. A posição dos exons é mostrado em azul.

Figura 3 retrata a associação significativa do exão intensidade expressão 18-EGFR e TS12. O painel esquerdo mostra uma forte associação entre a intensidade do exão 18 de EGFR (conjunto de sondas 3.002.770) e TS12 (Spearman,) expressão.

O painel esquerdo mostra a correlação entre a intensidade do exão 18 de EGFR expressão ( de sondas 3002770) ea redução do tumor na semana 12. a linha vertical mostra a intensidade de expressão mediana de EGFR de sondas 3002770. os pacientes com mutações EGFR são mostrados como pontos lisos vermelhos e rotulados accrodingly. Os pacientes com estado mutacional não disponíveis são exibidos como círculos vazios. O painel central representa a curva ROC (ROC) que mostra a sensibilidade /especificidade de um teste com base no nível de expressão de EGFR de sondas 3.002.770 para classificar respondedores (redução do tumor na semana 120/20 /30%) versus não-respondedores ( encolhimento do tumor na semana 120/20 /30%). Os pontos de deslizamento retratam as verdadeiras taxas positivas positivos e falsos obtidos pela fixação do valor de corte para o nível de expressão mediana de EGFR 3002770. A trama cachoeira (painel da direita) mostra a mudança no tamanho do tumor na semana 12 ordenados da esquerda para a direita. As cores são definidas pela intensidade expressão de EGFR 3002770 dicotomizado pela mediana do evel expressão (azul: intensidades baixa expressão; vermelho: intensidades de expressão elevados).

A forte correlação entre EGFR exão 18 expressão e TS12 permaneceu altamente significativa (Spearman,) após restringindo a análise aos pacientes tipo selvagem EGFR (veja a Figura S1 na informação de apoio). Esta sub-análise indica que a associação entre o EGFR exão 18 expressão e TS12 foi independente do estado da mutação EGFR.

A análise ROC (painel do meio) mostra a relação entre sensibilidade e especificidade, dependendo diferentes níveis de corte do exão 18 de EGFR (conjunto de sondas 3.002.770) expressão para classificar os pacientes em “respondedores” versus “não-respondedores”. Para efeitos desta análise ROC, a categorização “respondedores” versus “não-respondedores” derivado de TS12. Propusemos 3 definições alternativas para “respondedores”, definindo o TS12 de corte como maior ou igual a 0, 20, ou 30%, consoante se trate ou não de um incluiu a totalidade ou uma fração de pacientes com doença estável no “respondedores” categoria . Usando a expressão de EGFR mediana de sondas 3002770 como ensaio de limiar fornece uma exactidão de classificação de 75% (sensibilidade = 100%, especificidade = 67%). Como mostrado na curva ROC, a precisão da classificação mais elevada se pode esperar por uma maior sintonia fina desse limiar (área sob a curva [AUC] = 0,93).

Os dois exão sondas 18-EGFR mostrando a correlação mais forte com TS12 também mostrou uma associação significativa para o mesmo ponto final, quando medido utilizando sangue ().

a estabilidade da nossa descoberta foi avaliada usando bootstrapping e de validação cruzada estratégias. O procedimento confirmou a precisão da classificação forte do exão 18 de EGFR com uma mediana ROC-AUC de 0,94 (95% CI: 0,70-1,00) e a associação específica entre a região do exão 18 e redução do tumor na semana 12 (veja a Figura S2 e texto S1 para procedimento detalhado).

Kirsten rato sarcoma homólogo viral oncogene (KRAS) e de crescimento endotelial vascular fator-alfa (VEGFA).

No total, 13 e 25 de exão sondas intensidades de expressão foram medidos dentro KRAS e VEGFA respectivamente (Figura 1, central e painéis da direita). As pontuações PCA obtidos para ambos os conjuntos de conjunto de sondas (KRAS e VEGFA) não mostraram associação significativa com nenhum dos parâmetros clínicos. Um conjunto de sondas por-de sondas análise detalhada, não revelaram qualquer associação significativa com qualquer TS12 (Figura 2A, B, painéis direito e central) ou os outros parâmetros investigados.

Discussão

Para o nosso conhecimento , este é o primeiro estudo a explorar a correlação entre a expressão do gene avaliada a um nível exônico subgenic usando Affymetrix Human Exão 1.0 matrizes e resposta ao tratamento com um TKI de EGFR, em combinação com um agente anti-angiogénico ST. Nós investigamos as variações de intensidade exão dentro de 3 genes-chave (EGFR, KRAS e VEGFA) potencialmente associados com a resposta ao tratamento com BE. Fomos capazes de demonstrar uma forte associação entre a maioria, mas não todos, dos conjuntos de sondas de exão 51 de EGFR e TS12 de primeira linha BE terapia em pacientes com não tratada avançada não-escamosas NSCLC. Exon níveis de 18-EGFR apresentou a melhor associação com a resposta ao BE. Com base em nossas experiências anteriores, assumimos que o sinal que medido em EGFR Exon 18 não dependem do conteúdo de células tumorais [23]. Além disso, houve uma relação quantitativa – mais elevado nível de ARNm de EGFR foi correlacionada com a diminuição do tumor mais pronunciada, de forma independente do estado mutacional EGFR. análise de expressão de nível exão EGFR pode tornar-se um biomarcador útil para a prática clínica diária, pois proporciona várias vantagens em comparação com a análise mutacional convencional por sequenciamento do gene. Tipicamente, a expressão do gene de EGFR é medida usando RT-PCR com iniciadores que se ligam a uma região do gene único muitas vezes perto da extremidade 3 ‘do gene. No entanto, como mostrado no nosso estudo, a expressão do gene que variam significativamente durante o período do gene de EGFR. As razões para tais variações de expressão incluem splicing alternativo. O tipo de variante de EGFR III (EGFRvIII) tem uma deleção em enquadramento de exões 2-7 que foi encontrado para ser gerada por rearranjo de genes ou mRNA aberrante splicing [24], [25]. Esta forma de união alternativa tem sido encontrada em NSCLC [26], [27]. Em experiências de pré-clinicos, as células que expressam o EGFRvIII eram resistentes contra EGFR-TKI reversível, mas permaneceram sensíveis a inibidores de EGFR irreversíveis [28]. Encontramos a melhor correlação com o TS12 e exão 18. Nas extremidades do gene EGFR várias sondas ex�icas não mostraram uma associação significativa com o desfecho. Dziadziuszko e colegas relataram que a elevada expressão de EGFR ARNm analisados ​​por RT-PCR quantitativo foi associado com o aumento da resposta e prolongou o PFS em pacientes tratados com gefitinib [29]. Em um estudo chinês de 79 pacientes não selecionados tratados com erlotinib foi encontrada nenhuma correlação significativa entre a expressão de mRNA EGFR, mutações EGFR, mutações KRAS e desfechos clínicos [30].

Vários estudos demonstraram que o benefício clínico com EGFR-TKI foi não restrito a pacientes com mutações ativadoras do EGFR [13], [16], [31]. Por outro lado, o julgamento IPASS demonstrou que pacientes com EGFR de tipo selvagem tratados com gefitinib tinha PFS significativamente menor em comparação com os doentes no braço de quimioterapia (hazard ratio (HR): 2,85; IC 95%: 2,05-3,98;) [ ,,,0],8]. No presente estudo, fomos capazes de identificar 3 pacientes com EGFR de tipo selvagem e alta de exão níveis de expressão de 18 de EGFR (2 medidos em biópsias e sangue, e uma medida no sangue apenas) que tinha TS12 significativa após o tratamento com BE. Acreditamos que estes resultados são de interesse, porque a incidência de mutações ativadoras do EGFR em pacientes caucasianos é de 10-15% e nosso teste pode identificar pacientes adicionais que poderiam sair-se melhor com o primeiro-line EGFR-TKI em comparação com a quimioterapia. Esta hipótese necessita de validação prospectivo.

Curiosamente, os pacientes com EGFR mutações mais raros (

por exemplo

del L747-S751 e R748 del-S752) para o qual a resposta ao EGFR-TKI ainda tem de ser explorada também foram encontrados para ter níveis de expressão de EGFR de nível exão mais elevados que foi correlacionado com TS12. Duas sondas localizadas no exon 18 mostraram a associação mais forte com o encolhimento do tumor. Em um único estudo instituição italiana, EGFR mutações raras (exão 18 e 20 e as mutações raras em exons 19 e 21 e /ou mutações complexas) foram encontrados em 2,6% dos pacientes. Eles relataram PR à do erlotinib em um paciente com um E709A + G719C mutação dupla e uma resposta ao erlotinib em um paciente com uma mutação G719S [32]. Outros grupos relataram sensibilidade ao EGFR-TKI para o E709A + G719C dupla mutação e para a mutação G719S no exão 18 [33] – [35]

Curiosamente, observou-se redução do tumor em um paciente com uma mutação KRAS. . Este paciente teve uma elevada expressão do exão EGFR. Os pacientes com mutações KRAS representam aproximadamente 25% dos pacientes com NSCLC e têm sido descritos como altamente resistente ao tratamento de EGFR-TKI com RR perto de 0% e pior resultado para pacientes mutantes tratados com o EGFR-TKI em alguns ensaios [36], [37] . A análise biomarcador do estudo SATURN não mostrou nenhum efeito prejudicial sobre PFS com erlotinib em pacientes com tumores KRAS mutante [17]. Assim, alta de exão níveis de expressão de EGFR pode ser capaz de identificar os pacientes com mutações KRAS que tiram benefício de primeira linha BE.

Outros potenciais marcadores moleculares para além de EGFR-mutações têm sido investigados por seu papel preditivo para o tratamento com inibidores da tirosina quinase ou TKI em combinação com inibidores de VEGFR. a expressão da proteína EGFR detectadas por imuno-histoquímica (IHQ) está presente em 60-90% dos pacientes com NSCLC [13], [38] e, portanto, pouco provável que seja de uso para a seleção clínica para a terapia de TKI. Embora análises de subgrupos de estudos de fase III controlados com placebo em pacientes pré-tratados mostraram algum valor preditivo da expressão da proteína EGFR [13], [39], estes resultados não foram confirmados, quer na primeira linha ou a definição de manutenção [17], [40] . Da mesma forma, número de cópia elevado de EGFR, que ocorre em 30-50% de doentes com NSCLC, e a amplificação do gene, que ocorre em cerca de 10% [41], foram recentemente mostrado em € € anulada por mutações de EGFR em relação à sua preditivo valor para a resposta ao EGFR-TKI [40]. Determinação da expressão de ARNm de EGFR por PCR quantitativa foi correlacionada com o EGFR FISH e IHC e foi demonstrado ser um biomarcador preditivo para gefitinib [29]. Nem a expressão da proteína EGFR nem teste FISH EGFR são atualmente utilizados na prática clínica e melhor marcadores moleculares são, portanto, uma necessidade urgente.

O gene EGFR dá origem a múltiplas transcrições de RNA através de splicing alternativo e o uso de sinais de poliadenilação alternativos [42 ]. O gene de EGFR se estende por cerca de 200 kb e o comprimento total de 170 kDa do EGFR é codificada por 28 exões. Diversas variantes de splicing alternativo têm sido descritos [43]. O método mais vulgarmente utilizado para detectar mutações de EGFR é sequenciação directa das sequências de exão amplificados por PCR. O número de cópia do alelo mutante, a amplificação por PCR desequilibrada e a quantidade relativa de contaminar-alelo de tipo selvagem de células não tumorais pode influenciar a sensibilidade de detecção de mutantes por sequenciação directa [44]. Devido à preocupação relativamente a sensibilidade do método de sequenciação directa, uma variedade de outros métodos têm sido investigados para aumentar a sensibilidade do ensaio de mutação. Aqui temos investigado pela primeira análise de expressão de exão tempo. A matriz utilizada permite a análise da expressão de genes bem como a detecção de diferentes isoformas de um gene. Neste estudo foram identificados retrospectivamente uma correlação entre níveis de intensidade exão dentro de EGFR e evolução de pacientes. O mecanismo através do qual o EGFR exão 18 expressão determina um aumento da sensibilidade à bevacizumab-erlotinib é desconhecida, embora diferentes hipóteses podem ser propostas. matriz Exon ainda é muito recente com alta tecnologia em potencial. Freia com a idéia comum de que a expressão genética é estável ao longo do período de um gene inteiro. Portanto, não é surpreendente que obtivemos uma expressão do EGFR correlação estatística mais forte perto da região que codifica para a parte transmembranar funcional do EGFR. Se o valor preditivo deste ensaio pôde ser confirmada em um estudo prospectivo, a expressão do gene de nível exão pode identificar os pacientes que decorrem beneficiar de EGFR e terapias para além dos pacientes selecionados por sequenciação genética convencional VEGFR-alvo.

Existem certas limitações no estudo. É um único desenho do braço e tem um número relativamente baixo de doentes de biópsias de tumores que estavam disponíveis para análise. No primeiro semestre de 19/05 julgamento de SAKK não era necessária uma biópsia virgens de tratamento para inclusão no estudo. Neste período, praticamente não biópsias foram recolhidos. Depois de uma emenda (Outubro de 2006) a biópsia tornou-se obrigatória para inclusão no estudo como uma biópsia virgens de tratamento podem ser tomadas em quase todos os pacientes, incluindo pacientes com NSCLC em estágio avançado [23]. análises de matriz Exon foram realizadas com biópsias de tumores de células mistas sem qualquer técnica de enriquecimento de células de tumor como microdissecção a laser de captura. Isto é susceptível de conduzir a uma certa diluição do sinal verdadeiro tumor. técnicas de enriquecimento de células de tumor pode optimizar ainda mais a eficiência de biomarcadores derivados de análises matriz exão. A validade da análise da expressão EGFR exão como biomarcador de resposta ao BE terá de ser confirmado tanto usando análise de RT-PCR visando EGFR exão 18. A plena realização da validação do romance biomarcador, eventualmente, requer uma investigação mais aprofundada utilizando um estudo prospectivo randomizado independente .

em conclusão, com a ajuda de um novo gene tecnologia de matriz de expressão com a cobertura exônico, fomos capazes de identificar exão expressão 18-EGFR como um potencial biomarcador preditivo para erlotinib e bevacizumab em pacientes com avançado, NSCLC não tratada .

Materiais e Métodos

SAKK 19/05

O julgamento SAKK 19/05 (ClinicalTrials.gov: NCT00354549) matriculados 103 pacientes com NSCLC avançado não-escamosas, 101 pacientes foram avaliados para posterior análise [21]. Os critérios de elegibilidade incluíram anos de idade, a função da medula óssea adequada, a função renal e hepática normal e doença mensurável. Foram excluídos pacientes com necessidade imediata de quimioterapia, com grandes tumores localizados centralmente, cavitações tumores pré-existentes e metástases cerebrais. Extras de pré-tratamento biópsias broncoscopia para estudos translacionais foram tiradas em 49 pacientes, dos quais 42 eram de qualidade suficiente para a análise de matriz exão subsequente. Para o presente sub-estudo, amostras de sangue pré-tratamento estavam disponíveis a partir de 95 pacientes, e amostras de 75 pacientes tiveram qualidade suficiente para arrays de exão. No total, 76 doentes com qualquer tumor ou amostras de sangue ou ambos, foram incluídos no sub-estudo actual. consentimento informado por escrito para investigação de translação foi obtido de todos os pacientes. O ensaio clínico, bem como o sub-estudo atual foram aprovadas pelo IRB de St. Gallen (EKSG 06/012).

O delineamento experimental

SAKK 19/05 foi um estudo multicêntrico, prospectivo, aberto -label, de braço único, fase II julgamento em doentes não tratados previamente. De janeiro de 2006 a abril de 2009, 103 pacientes de 14 instituições suíças foram inscritos e receberam os BE até progressão da doença ou toxicidade inaceitável. No momento da progressão, os pacientes receberam quimioterapia, com 4-6 ciclos de cisplatina e gemcitabina. O objectivo primário foi a taxa de doença de estabilização (DSR) definida como a proporção de pacientes com uma resposta completa (CR), remissão parcial (PR) ou doença estável (SD) após 12 semanas de tratamento seja. Os endpoints secundários incluíram TTP sob BE, bem como sob CT, a sobrevida global (OS), redução do tumor em 12 semanas e 6 meses. Os resultados clínicos deste estudo foram relatados anteriormente [21].

análise de Patologia

O e espécimes embebidos em parafina foram analisados ​​e classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO) fixado em formol. análises de mutações de EGFR (exão 18-21) e KRAS (exão 12) foram realizadas a partir de cortes de tecido não coradas (3 mm) ou espécimes citológicos Papanicolaou-manchadas usando sequenciação directa como descrito anteriormente [45], [46]. o enriquecimento de células de tumor foi conseguida quer por macrodissection ou laser de captura microdissecação e análise da sequência de ADN.

exão ao nível do gene análise de expressão

O ARN total a partir de amostras de biópsia broncoscopia todo foram extraídos e qualidade suficiente para fornecida hibridação de micromatriz em 42 de 49 amostras. Circulating ARN a partir de amostras de sangue periférico foi extraída e fornecida qualidade suficiente para a hibridação microarray em todas as 75 amostras. ARNm foi hibridada em Affymetrix Human Exão 1.0ST matrizes (Affymetrix, Santaclara, CA, EUA) seguindo as recomendações do fabricante padrão (disponível procedimento detalhado no texto S1). Os dados brutos foram depositados em Gene Expression Omnibus NCBIs (GEO), e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE37138. Os conjuntos de sondas de exões e nível do gene foram pré-processados, a qualidade normalizada e verificada utilizando o procedimento de RMA [47]. Os conjuntos de dados de tecidos e de sangue foram analisadas de forma independente, sem a partilha dos dados. O conjunto de dados tecido foi usado para a descoberta de biomarcadores ao passo que o conjunto de dados sangue foi usado para validação interna.

Considerações estatísticas

O cálculo do tamanho da amostra inicial foi baseada no endpoint primário do estudo clínico (DSR na semana 12 (DSR12) sob BE tratamento). Os 101 pacientes avaliáveis ​​acumulados garantida uma alta precisão na estimativa da DSR12. Em uma abordagem de gene alvo, 3 genes foram especificamente investigados: EGFR (ENSG00000146648), KRAS (ENSG00000133703) e VEGFA (ENSG00000112715). EGFR incluiu 51, KRAS, 13, e 25 conjuntos de sondas VEGFA ex�icas (Figura 1). Os endpoints considerados neste estudo biomarcador incluiu redução do tumor após 12 semanas (TS12) de tratamento BE, TTP sob BE e OS. OS foi medido a partir de registro até a morte de qualquer causa. O resultado anterior de sequenciação EGFR tumor foi usado para análise sub-estudo. A associação univariada entre as intensidades de nível exão e endpoints tempo de colocação no evento foi avaliada por Cox riscos proporcionais regressão. A correlação entre as intensidades de nível exão e redução do tumor foi medida pelo coeficiente de correlação de Spearman e testados para a diferença significativa a partir 0. correções de Bonferroni foram utilizados para contabilizar os testes múltiplos. Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizada para resumir as informações incluídas em vários conjuntos de sondas de nível exão em pontuações compostas (pontuações no primeiros componentes principais). Characteristic (ROC) curvas Receiver Operating foram utilizados para estimar a sensibilidade, especificidade e acurácia de preditores baseados expressão exão. A fim de avaliar a estabilidade das nossas descobertas, foi utilizada uma estratégia de validação cruzada. A precisão do modelo de classificação foi avaliada utilizando bootstrapping. Todas as análises foram realizadas utilizando o software estatístico R (versão 2.13.0; pacotes xmapcore, ade4, ROCR, Daim e sobrevivência) [48]

Informações de Apoio

Figura S1..

Associação entre EGFR exão 18 expressão e redução do tumor na semana 12 – sub-análise. Apenas EGFR pacientes de tipo selvagem foram incluídos nesta análise. O gráfico de dispersão mostra a correlação entre a expressão de EGFR exão 18 (conjunto de sondas 3.002.770) e a redução do tumor na semana 12. A linha vertical mostra a intensidade de expressão mediana de exão EGFR 18.

doi: 10.1371 /journal.pone.0072966 .s001

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Figura S2.

Estabilidade da capacidade de predição de biomarcadores de EGFR por meio de estratégias de validação cruzada. O painel da esquerda representa a capacidade do biomarcador EGFR mais significativamente associado com TS12 (≤ / 20%) utilizando a base de dados original (conjunto de sondas 3002770) para classificar como respondedores. O melhor valor de corte, juntamente com a taxa associada falso positivo (FPR), a verdadeira taxa positiva (TPR) e área sob a curva ROC (AUC) são dadas. O painel da direita mostra a curva ROC média obtida após o procedimento de inicialização 0,632 validação cruzada. Os boxplots mostram a distribuição da FPR ao longo dos conjuntos de dados amostrados re-

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072966.s002

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Tabela S1.

Resumo de todos os pacientes incluídos no estudo SAKK 19/05. DST W12:. Estabilização da doença na semana 12, 0 = falha, 1 = sucesso

doi: 10.1371 /journal.pone.0072966.s003

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texto S1.

informações material e métodos adicionais. O primeiro parágrafo prevê uma descrição estendida da análise da expressão gênica em nível de exão. O segundo parágrafo dá detalhes sobre a avaliação da estabilidade dos resultados obtidos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072966.s004

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Reconhecimentos

Amostra coleta, transporte e processamento foi feito dentro da estrutura da Swiss biópsia pulmonar Biobank para o qual estamos muito gratos. Estamos muito gratos a Philippe Demougin que realizou o isolamento de ARN e hibridação matriz exão. O estudo não poderia ter sido feito sem a vontade dos pacientes para participar neste estudo, especialmente se submeter a uma broncoscopia adicional em certos casos.

Contribuintes

Os membros do SAKK Equipe 19/05 Estudo