Abstract

inibição da angiogênese é uma estratégia terapêutica importante para o câncer em estágio avançado de próstata. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que a estimulação prolongada de Rap1 por 8-pCPT-2′-O-Me-cAMP (8CPT) através da activação da EPAC, um Rap1 GEF, ou por expressão de um mutante constitutivamente activo Rap1 (cRap1) suprime endotelial quimiotaxia celular e angiogénese subsequente. Quando testado neste modelo no contexto de um xenoenxerto de tumor da próstata, descobrimos que 8CPT não teve nenhum efeito significativo sobre o crescimento do tumor da próstata sozinho. No entanto, em células que albergam cRap1, 8CPT inibiu dramaticamente, não apenas o crescimento do tumor da próstata, mas também expressão de VEGF e na angiogénese dentro do microambiente do tumor. Análise subsequente do mecanismo revelou que, em células epiteliais de tumor da próstata, 8CPT actuado através da estimulação da PKA em vez de Epac /Rap1. PKA antagoniza Rap1 e a indução hipóxica da expressão da proteína 1α, a produção de VEGF e, em última análise, a angiogénese. Juntos, esses resultados fornecem evidência de um romance inter-relação entre Rap1, a EPAC e PKA que regula a indução de tumor estromal da angiogênese

Citation:. Menon J, Doebele RC, Gomes S, Bevilacqua E, Reindl KM, Rosner MR (2012) a Novel interação entre Rap1 e PKA Regula a indução de angiogênese em câncer de próstata. PLoS ONE 7 (11): e49893. doi: 10.1371 /journal.pone.0049893

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2012; Aceito: 15 de outubro de 2012; Publicado: November 15, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Menon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por PC094476 – Departamento de Defesa (DOD) Programa de Pesquisa em Câncer de próstata (PCRP) Pós-Doutorado Fellowship (JM) e National Institutes of Health /National Cancer Institute R01-CA109278 (MRR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens nos Estados Unidos [1]. A alta morbidade e mortalidade associadas com o início do hormônio-refratário, metastáticos mandatos de câncer de próstata a necessidade de regimes de tratamento inovadoras para melhorar o prognóstico desta doença. Várias estratégias têm sido utilizadas para direccionar a angiogénese no cancro da próstata, incluindo o bloqueio dos factores pró-angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), através de anticorpos monoclonais ou os inibidores de moléculas pequenas de segmentação vias de sinalização efectores a jusante como a via do receptor tirosina cinase do VEGF [2], [ ,,,0],3], [4]. No entanto, a maior desvantagem desta abordagem é o número significativo de factores pró-angiogénicos, para além do VEGF, que podem induzir angiogénese e, assim, contornar estes agentes. Uma alternativa para inibir um ou mais dos factores pró-angiogénicos é identificar moléculas de sinalização que funcionam para regular a angiogénese [5].

Vários estudos têm implicado Rap1 como um mediador de angiogénese [5], [6] [7], [8], [9], [10], [11]. angiogénese defeituoso e hematopoiese foram observados em ratinhos sem Rap1a ou Rap1b, e um mecanismo que envolve a integrinas e receptores de VEGF em células endoteliais foi recentemente relatado [12], [13], [14], [15], [16], [17] , [18]. Assim, a perda de Rap1 inibe a angiogénese durante o desenvolvimento, de acordo com as execuções RAP1 papel na sinalização celular, a adesão celular mediada pela integrina e junções célula-célula, funções que são importantes para a formação da estrutura tubular. O derivado 8CPT-2Me-AMPc AMPc (8CPT) é um potente agonista de Epac, um factor de troca do nucleótido guanina para Rap1, e um agonista fraco de PKA [18], [19]. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que, em células primárias humanas microvasculares endoteliais, estimulação prolongada de Rap1 quer por activação Epac após o tratamento 8CPT ou pela expressão de constitutivamente activado Rap1 A63E (cRap1) inibe a migração e angiogênese [8], [9]. Deste modo, a angiogénese pode também ser inibida em células endoteliais, quando Rap1 é sujeito a uma estimulação prolongada de drogas ou mutação. Em conjunto, estes estudos sugerem que o grau de activação Rap1 é crítica para o processo angiogénico.

PKA também tem sido associada a angiogénese tanto como um regulador positivo e negativo [20], [21], [22], [ ,,,0],23], [24], [25], [26]. O aumento da actividade de PKA promove a formação de tubo endotelial, promovendo, assim, a angiogénese [27]. Por outro lado, a activação de PKA provoca a fosforilação do repressor transcricional Id1 [28] e interrompe o seu vaivém nucleo-citoplasmático, inibindo assim a angiogénese [29]. Além disso, quer a sobre-expressão da subunidade catalítica de PKA ou activação farmacológica de PKA induz a morte das células endoteliais por apoptose, supressão da angiogénese [22], [23]. No total, estes resultados indicam que os resultados da angiogénese de um equilíbrio de fatores pró e anti-angiogénicos incluindo Rap1 e PKA, e ambos os extremos terão efeitos deletérios.

O objetivo deste estudo foi determinar se Rap1 regula a angiogénese em tumores da próstata. Os nossos resultados sugerem que a activação Rap1 constitutiva em células de tumor da próstata humanos promove a indução hipóxica de VEGF e a angiogénese, e PKA antagoniza o efeito. Além disso, os nossos estudos sugerem que o tratamento 8CPT pode inibir a angiogénese através de dois mecanismos diferentes que envolvem a activação de PKA em células de tumor da próstata, como mostrado aqui, e activação Epac /Rap1 em células endoteliais [8].

(A e B)

Painel de Esquerda

: O volume do tumor (expressa em mm

3) de PC3 humana e xenotransplantes PC3-cRap1 tratados como indicado foi medido como descrito em Métodos. Dia 0 representa o primeiro dia de tratamento; * P

0,05, n = 7 para cada grupo.

Painel direito

: Imagens de um tumor representante de cada grupo de tratamento no final da experiência (dia 28). (C) O volume de tumor (expressa em mm

3) de PC3 humana e xenotransplantes PC3-cRap1 tratados conforme indicado foi medido como em A; * P

0,05, n = 7 para cada grupo. (D) Os tumores do painel C foram pesados ​​no final da experiência (dia 28) e expresso em gramas; * P 0,05; (

n

= 7).

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro da próstata, tratamentos, Antibodies, plasmídeos, e Reagentes

Epac activador de 8- (4-clorofeniltio) -2-O-metil-AMPc (8CPT) e PKA activador N6-Benzoyladenosine- 3 ‘, 5’-monofosfato cíclico (6-BZ-AMPc) foram adquiridos a Life Sciences Biolog Instituto (Bremen , Alemanha). células LNCaP e células PC3, que foram obtidos a partir de cultura de tecidos na Colecção Americana (Manassas, Virginia), mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 em Mediatech meio RPMI com 10% de soro fetal de bovino 1640, 50 ug /ml de penicilina e 50 U /ml de estreptomicina. Todos os meios e reagentes de crescimento foram adquiridos da Gibco BRL (Grand Island, NY). As células foram incubadas durante 24 h com meio isento de soro antes de cada tratamento. As células foram tratadas durante a noite com 10 pM ou 10 pM 8CPT 6BZ-AMPc dissolvidos em PBS ou PBS por si só como um meio de controlo. As células foram ainda tratados durante 6 horas (a menos que indicado de outra forma) com 10 uM CoCl

2 para mimetizar condições hipóxicas ou com SDF-1α a 200 ng /ml durante 20 min. As células foram pré-tratados com inibidores da PKA H-89 (10 uM) durante 30 minutos antes de CoCl

2 tratamento. Os anticorpos para a tubulina e Epac foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Mouse CD31 anti-humano e de coelho anti-VEGF humano foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA). SDF-1α foi obtido a partir de R D systems (Minneapolis, MN) e H-89 foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), miristoilada PKI foi de Invitrogen (Grand Island, NY), e anticorpos para VASP ou phosphoVASP eram de sinalização celular (Boston, MA).

(a e B) CD31 e VEGF imunorreatividade no PC3 e tumores PC3-cRap1. A imunocoloração foi medida como descrito em Métodos.

painéis direitos

: fotomicrografias representativas.

painéis esquerdo

: Quantificação de coloração imuno-histoquímica de fatias de tumor; * P 0,05; n = 7; u.a. = unidades arbitrárias. (C) O volume de tumor (expressa em mm

3) de xenoenxertos PC3-cRap1 humanos. células PC3-cRap1 foram injectados como xenoenxertos no Dia 0 e deixou-se crescer durante 10 dias antes de uma mini-bomba osmótica contendo os tratamentos foi implantado por infusão constante (Dia 10, bomba). Os tumores tratados como indicado foram medidos tal como descrito em Métodos; * P 0,05; N = 8 para cada grupo. (D) O peso do tumor de xenoenxertos PC3-cRap1 humanos. Os tumores de painel C foram pesados ​​no final da experiência (dia 38) e expresso em gramas; * P 0,05; (

n

= 8).

Declaração de Ética

Todos os procedimentos envolvendo ratos cumpriram com as políticas da Universidade de Chicago Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC ) e foram aprovados pelo IACUC sob o protocolo número 1.196. Os ratos foram alojados no Biotério do Centro de Gordon para Integrativa Ciência na Universidade de Chicago em quartos dedicados com gaiola ventilado com ar HEPA-filtrado (12 horas de luz /ciclo escuro). Ratos tinha pleno acesso à água e comida. Os ratinhos foram monitorizados diariamente pela equipe de pesquisa. Foram avaliadas a capacidade de alimentar o acesso e água, a mobilidade dos membros posteriores, a respiração normal, a deambulação normal, e do comportamento social. Se um animal parecia ser doente foi monitorizado durante 24 horas e depois anestesiados com isoflurano e sacrificados por agente gasoso seguido por deslocamento cervical. Os animais também foram submetidos à eutanásia por recomendação do veterinário ou o pessoal clínico. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia cetamina /xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Xenoenxerto Modelo de cancro da próstata humano

ratinhos atímicos macho (15-20 g, 4-6 semanas da idade, do National Cancer Institute, Frederick, MD) foram inoculados subcutaneamente no flanco esquerdo inferior com 1 × 10

6 PC3 (PC3-GFP) ou PC3-cRap1 (PC3-cRap1A63E-GFP) as células de cancro da próstata em suspensão em 200 uL de PBS. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com PBS ou 2,5 umol 8CPT, ou 2,5 umol H-89. Para esta finalidade, os ratinhos foram anestesiados como descrito acima e minibombas osmóticas de Alzet (modelo 2004, Durect Corp., Cupertino, CA) foram inseridos subcutaneamente para infundir PBS, 8CPT ou H-89 durante 28 dias. No final do tratamento os animais foram sacrificados, os tumores foram removidos, pesados ​​e processados ​​para imuno-histoquímica. O volume do tumor foi medido utilizando a fórmula -1/2 x L x W

2 a cada dois dias, onde L = comprimento e W = largura.

os níveis de VEGF (A) foram medidos por ELISA em PC3 e células PC3-cRap1 sob condições hipóxicas-like (CoCl

2), tal como descrito em Métodos; * P 0,05, (n = 3). (B) A análise de imunotransferência de extractos nucleares a partir de células PC3 e PC3-cRap1 tratados como indicado. Os níveis de proteína de HIF-1a foram determinados por immunoblotting com um anticorpo específico; (C) A análise dos níveis de ARNm de VEGF por qPCR em PC3 e células PC3-cRap1 tratadas como indicado. Os dados foram normalizados para níveis de GAPDH; * P 0,05 (

n

= 3)

Imunohistoquímica

tumores de camundongos foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 24 horas e incubados em 70% de etanol para. 48 h antes da inclusão em parafina. Os tumores foram cortados em incorporados cinco micra de espessura e corados com hematoxilina e eosina para determinar a morfologia. Secções de tumores infundidos com 8CPT, H-89 ou PBS foram histoquímica para VEGF, CD31 ou Ki67 usando o método da estreptavidina-biotina marcado para medir a angiogénese ou proliferação das células. secções coradas foram visualizados e fotografados com um sistema de análise de imagem de vídeo (Scion, Inc., Frederick, MD). Um sistema de imagiologia de células automático foi usado para quantificar a coloração imuno-histoquímica de VEGF. A densidade capilar foi calculado por contagem de vasos imunocoradas com CD31 +. Pelo menos 6 campos aleatórios foram contadas numa secção representativa. Os valores são representados como médias mais ou menos SEM.

VEGF ELISA

As células (5 × 10

4) foram plaqueadas em placas de 24 poços. Quando as células eram 70-80% confluentes, que foram tratados tal como descrito acima. O meio foi recolhido dos poços e os níveis de VEGF foram determinados de acordo com as instruções do fabricante para kits de VEGF humano ELISA Desenvolvimento (Peprotech, Rocky Hill, NJ).

Isolamento RNA e Transcrição Reversa /em tempo real Polymerase Chain Reaction

o ARN foi isolado a partir das células utilizando QIAshredder e RNeasy

R Minikit de Qiagen Biociências e foi submetido a RT-PCR, utilizando ADNc de alta capacidade kit de transcriptase inversa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qPCR) foi levada a cabo usando Gene Expression Assays da Applied Biosystems e 2X Master Mix da Applied Biosystems ou ABgene no Applied Biosystems 7300 em Real-Time PCR System StepOne Plus. Os resultados foram quantificados como valores Ct, em que Ct é definido como o ciclo limiar de PCR em que o produto amplificado é detectado pela primeira vez, e definido como a expressão genética relativa (a proporção de alvo /controlo). Todas as reacções foram realizadas em triplicado e normalizadas para GAPDH (Applied Biosystems, Carlsabad, CA).

Preparação de extractos nucleares e Western Blotting

células PC3 e PC3-cRap1 sub-confluentes foram lisadas em tampão frio nuclear (10 mM de HEPES, pH 7,9, MgCl2 1,5 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 5%), contendo inibidores de protease completos (EMD Chemicals, Paulsboro, NJ). A preparação foi centrifugada a 10000 g durante 15 min. O sedimento foi ressuspenso em 50 ul de tampão de alto teor salino (10 mM de HEPES, pH 7,9, NaCl 400 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 5%) e incubou-se em gelo durante 20 min. Após centrifugação a 14000 g durante 20 min, o sobrenadante foi recolhido e tomado como a fracção nuclear e armazenado a -80 ° C. As proteínas nucleares (50 ug /poço) de controlo e tratados 8CPT células sob condições de hipoxia como foram separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 7,5% e transferido para membranas de nitrocelulose (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). As membranas foram incubadas com anticorpo primário durante a noite (HIF-1α, 1:500; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO), seguido de 1 h de incubação com o anticorpo secundário anti-rato, acoplado a peroxidase de rábano (1:2500; Sigma, St. Louis, MO). reagentes quimioluminescentes foram usadas para visualizar as bandas imunorreactivas. a-tubulina (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) serviu como o controle de carregamento

Transfection siRNA

Epac siRNAs (ON-TARGETPlus siRNA, Dharmacon) a 100 nM. foram transfectados em células PC3 por electroporação (223 v durante 23 ms). As células foram analisadas 48 horas após a transfecção.

Rap1 Ensaio de Actividade

níveis Rap1-GTP foram medidos usando um Rap1 Activation Assay Kit (Biolabs celular, San Diego, CA) seguindo o protocolo do fabricante.

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc.). Os dados são apresentados como média ± EP e comparados pelo teste t, teste de Wilcoxon e de um ou dois ANOVA, quando apropriado, seguido do teste t post-hoc relevante para determinar os valores de p. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo

As células foram tratadas como indicado, e os níveis de VEGF foram medidos por ELISA como descrito em Métodos.. (A e B) células PC3 ou PC3-cRap1; * P 0,05, n = 3. Células LNCaP ou LNCaP-cRap1 (C e D); * P 0,05, n = 2.

As células foram tratadas tal como indicado, e os níveis de VEGF foram medidos por ELISA como descrito em Métodos. (A) Reversão de efeitos 8CPT por H-89 em células PC3-cRap1; * P 0,05, n = 3. (B) Reversão de 6BzcAMP (6BN) efeitos por H-89 em células PC3-cRap1; * P 0,05, n = 3. (C) Reversão de efeitos 8CPT por H-89 em PC3-cRap1cells; * P 0,05, n = 3.

Resultados

8CPT inibe o crescimento de xenoenxertos de células da próstata expressando ativado Rap1

Para determinar o efeito da Rap1 ativado em próstata o crescimento do tumor, que injetaram em ratos atímicos com células PC3 que expressam Rap1A63E constitutivamente activada (PC3-cRap1) ou tratados com o 8CPT derivado cAMP. Para a entrega 8CPT, os animais foram tratados subcutaneamente com PBS ou 8CPT utilizando uma mini-bomba osmótica. 8CPT foi administrado numa dose de 2,5 umol mais de 28 dias, com base em um estudo piloto anterior que mostra que esta taxa de perfusão foi bem tolerada pelos ratinhos. Durante o período de infusão, os animais mantidos alimentos e consumo de água normal e não mostraram nenhuma evidência da função motora reduzida. Sem anormalidades patológicas grosseiras foram observadas nos principais órgãos, indicando a ausência de efeitos tóxicos na dose 8CPT dado. O primeiro dia de infusão foi designado como Dia 0, e os animais foram sacrificados após 28 dias de tratamento.

Nem constitutivamente expresso Rap1 (PC3-cRap1 + PBS) nem tratamento 8CPT sozinho (PC3 + ​​8CPT) significativamente alterado o crescimento de tumores em xenoenxertos PC3 (Fig. 1A, 1C). No entanto, 8CPT reduziu dramaticamente o crescimento de tumores em xenoenxertos PC3-cRap1 (Fig. 1B, 1C). Análise dos pesos do tumor confirmou a 50% de decréscimo de tumores PC3 a partir de ratinhos tratados com cRap1-8CPT (Figura 1D.). Tanto o tratamento Rap1 e 8CPT activado foram necessários para este efeito, uma vez que nenhuma mudança nos tumores foi observada em 8CPT-tratada xenoenxertos PC3 ou PBS-tratada xenoenxertos RAP1.

(A e B) O inibidor de PKA, H-89 (2,5 umol), reverteu a inibição do crescimento do tumor e redução do peso do tumor mediada por 8CPT em xenoenxertos PC3-cRap1. tumores PC3-cRap1 de murganhos sujeitos a infusão com PBS, 8CPT, ou H-89 foram medidas e o volume do tumor determinada conforme descrito em Métodos; * P 0,05; N = 8 para cada grupo de tratamento. (C) CD31 e VEGF imunorreatividade em tumores PC3-cRap1 tratados como indicado. A imunocoloração foi medida como descrito em Métodos.

painéis superiores

: fotomicrografias representativas.

painéis inferiores

: Quantificação de coloração imuno-histoquímica de fatias de tumor; * P 0,05; N = 8 para cada grupo de tratamento; u.a. = Unidades arbitrárias.

8CPT inibe a angiogênese no PC3-cRap1 xenoenxertos

Para monitorar o efeito de 8CPT na angiogénese nos tumores de próstata, fatias de tumor fixados em formol foram imunocoradas com anticorpos para CD31 e VEGF, um marcador de células endoteliais e um factor pró-angiogénico, respectivamente. vasos sanguíneos intra-tumorais (CD31 +) foram identificados pela morfologia e contadas vaso (Fig. 2A). Os tumores do grupo de PC3 animais infundidos com PBS ou 8CPT tinham números semelhantes de vasos sanguíneos e níveis de imunorreactividade de VEGF (Fig. 2A, 2B). A imunorreactividade geral VEGF em tumores PC3-rato cRap1 foi aumentada em relação aos tumores de ratinho PC3 sem afectar significativamente a densidade capilar. Surpreendentemente, o tratamento com 8CPT, quando comparado com PBS, reduziu drasticamente a densidade de vasos e a imunorreactividade de VEGF em tumores PC3-cRap1. Estes resultados indicam que Rap1 constitutivamente activa induz a produção de VEGF, e 8CPT antagoniza o efeito. Além disso, 8CPT reduz a formação de vasos sanguíneos, o que pode contribuir para a inibição do crescimento do tumor da próstata nestes ratinhos.

8CPT reduz o crescimento contínuo do pré-formado da próstata tumores que expressam Rap1

Nas nossas experiências iniciais (Fig. 1), que injectado PC3-cRap1 células e tratou-se com 8CPT no mesmo dia (dia 0) para prevenir o crescimento do tumor. Para determinar se 8CPT também pode bloquear o crescimento de células tumorais em curso, que injetaram células PC3-cRap1 em ratos e lhes permitiu crescer em um tumor palpável antes do tratamento com 8CPT via mini-bombas osmóticas (Fig. 2C). Similar ao esquema anterior, o tratamento 8CPT de tumores pré-existentes causado uma redução superior a 43% em peso do tumor quando comparados com os animais infundidos PBS (Fig. 2D). Análise de proliferação de células tumorais por imunocoloração com o anticorpo Ki67 mostrou apenas uma modesta redução após o tratamento 8CPT, sugerindo que a redução no número de células é também devido à perda de células (Fig. S1). No entanto, a apoptose por si só é pouco provável que seja responsável, uma vez que a coloração TUNEL não mostraram uma diferença significativa (dados não mostrados). Os resultados indicam que 8CPT não só atua para impedir o crescimento do tumor, mas também reduz o crescimento contínuo de tumores pré-formadas.

8CPT inibe Angiogênicas Indutores em células PC3-cRap1 Sob hipóxicos Condições

Para entender o mecanismo pelo qual o VEGF em 8CPT suprime próstata cRap1 xenoenxertos de tumor, desenvolvemos condições de cultura de células para imitar este efeito. células de tumor sólido, muitas vezes crescem sob condições de hipóxia e hipóxia promove a angiogênese. Portanto, foram analisados ​​os níveis de proteína de VEGF em meios isolados a partir de células pré-tratadas durante a noite com 8CPT no soro reduzida e, em seguida, tratado adicionalmente com CoCl

2 durante 6 horas para gerar condições de hipoxia semelhante. Em células PC3-cRap1, tratamento 8CPT diminuição da produção de VEGF apenas sob condições hipóxicas-like (CoCl

2) (Fig. 3A). Em contraste, não houve uma redução acentuada na produção de VEGF em células PC3 após o tratamento 8CPT com exposição concomitante de CoCl

2 (Fig. 3A). Estes resultados sugerem que a inibição induzida por VEGF 8CPT de expressão observada em tumores PC3-cRap1 pode ser recapitulado

In vitro

imitando um ambiente hipóxico.

HIF-1α é um factor de transcrição que heterodimérica é regulada positivamente em células tumorais hipóxicas e promove a angiogénese, permitindo a transcrição de genes pró-angiogénicos de VEGF como [30]. Para determinar se a inibição HIF-1α poderia ser o mediador do efeito 8CPT sobre os níveis de VEGF, analisamos a expressão da proteína HIF-1α em extratos nucleares de PC3 e células PC3-cRap1 tratados com 8CPT e CoCl

2. Como esperado, um significativo aumento do nível de proteína HIF-1α foi observada tanto no PC3 e células PC3-cRap1 seguinte CoCl

2 tratamento. No entanto, os níveis de proteína de HIF-1α diminuiu quando as células PC3-cRap1 mas não células PC3 foram pré-tratados com 8CPT (Fig. 3B). Consistente com esse resultado, observou-se uma diminuição significativa no mRNA VEGF apenas em células PC3-cRap1 tratados com tanto CoCl

2 e 8CPT (Fig. 3C).

8CPT regula a produção de VEGF em linhas de células da próstata tratados com um activador da fisiológica Rap1

Rap1 é activado por um certo número de factores endógenos incluindo Estroma 1α Derived factor (SDF-1α), uma quimiocina que se liga ao receptor CXCR4 e facilita homing de células derivadas de medula óssea [ ,,,0],31], [32]. Como mostrado anteriormente [31], o tratamento de células PC3 com SDF-1α durante 20 minutos, aumentou marcadamente o nível de activada endógena Rap1-GTP (Fig. S2). Nós não observamos níveis elevados de endógena Rap1-GTP em qualquer células PC3-cRap1 PC3 ou após o tratamento durante a noite de células com 8CPT. Estes resultados indicam que tanto o tratamento agudo ou SDF-1α Rap1 activação constitutiva mas não sustentada tratamento 8CPT leva a actividade Rap1 elevada em células de tumor da próstata.

Para determinar se Rap1 activada em resposta a SDF-1α atua de forma semelhante a constitutivamente Rap1 ativados, nós investigamos o efeito da SDF-1α e 8CPT em VEGF secretado. SDF-1α induzida a produção de VEGF em células PC3, quando em comparação com células não tratadas PC3 (Fig. 4a), e esta indução foi bloqueada em células PC3 expressando Rap1GAP, uma GTPase Rap1 Rap1 que inactiva (Fig. S3). Além disso, o tratamento com CoCl

2 induzida ainda mais a produção de VEGF em células PC3-estimuladas SDF-1α, semelhante à CoCl

2 tratamento de células PC3-cRap1 (Fig. 4A, 4B). Tal como acontece com as células PC3-cRap1, 8CPT inverteu a indução da produção de VEGF em células PC3 tratadas-SDF-1α sob condições hipóxicas.

Resultados semelhantes foram também observados em uma linha celular de menos agressiva, dependentes de androgénios tumor da próstata, LNCaP, que ou foi tratada com SDF-1α ou com estavelmente expressa constitutiva Rap1 (Fig. 4C, 4D). Estes resultados indicam que a regulação da produção de VEGF por 8CPT sob condições hipóxicas não se limita a um tipo de células e é observado em resposta à fisiológicos, bem como a activação constitutiva de Rap1.

8CPT regula a produção de VEGF A jusante do Rap1

Para compreender o papel da ativação Rap1 na regulação da produção de VEGF, estudos semelhantes envolvendo 8CPT ou CoCl

2 tratamento foram realizados em células PC3 não estimuladas ou SDF-estimulou-1a que expressam de forma estável Rap1GAP. Em geral, os níveis de VEGF foram reduzidos como resultado da expressão Rap1GAP (Fig. S4). Embora a indução devido ao SDF-1α foi totalmente suprimida, CoCl

2 ainda estimulou a produção de VEGF na presença de Rap1GAP, consistente com a estabilização de HIF-1α. Além disso, o pré-tratamento durante a noite com 8CPT ainda reduzida CoCl

2-estimulou a produção de VEGF, consistente com a nossa observação de que 8CPT actua a montante de HIF-1α para reduzir os níveis de expressão que (ver a Fig. 3B). Finalmente, o pré-tratamento 8CPT não reduziu a actividade Rap1 constitutiva (Fig. S2), sugerindo que ele actua a jusante de Rap1. Tomados em conjunto, os dados sugerem que 8CPT inibe a produção de proteína VEGF inibindo Rap1 ou indução hipóxica de HIF-1α.

8CPT regula a produção de VEGF via PKA em células de tumor da próstata

Embora 8CPT ativa Rap1 via Epac em células endoteliais [8], os nossos resultados actuais indicam que antagoniza 8CPT activado função Rap1 em células de tumor da próstata epiteliais, sugerindo que um mecanismo diferente é responsável. Consistente com esta hipótese, o esgotamento parcial de Epac1 e Epac2 por siRNAs não tem qualquer efeito sobre VEGF segregada em células PC3-cRap1 (Fig. S5), embora não possamos descartar um papel para Epac.

8CPT pode ativar PKA, embora a sua afinidade para Epac é 107 vezes maior [19], [33]. Para testar esta possibilidade, verificou-se se 8CPT estimula PKA em células PC3 e PC3-cRap1 usando VASP fosforilação como um indicador de activação de PKA. 8CPT activado PKA semelhante ao 6-benzoil-AMPc (6BzcAMP), um activador do PKA mais selectivo (Fig. S6). Em seguida, examinaram a capacidade de dois inibidores de PKA, H-89 ou PKI, para inverter a inibição da produção de VEGF mediada por 8CPT. O tratamento de células PC3-cRap1 expostos a CoCl

2 e 8CPT com os inibidores de PKA parcialmente resgatados da inibição da produção de VEGF em células PC3-cRap1 (Figura 5A;. A Fig. S7). Além disso, 6BzcAMP 8CPT mimetizado por inibição da produção de VEGF em células PC3-cRap1 sob condições hipóxicas, e esta inibição foi parcialmente revertida por H-89 ou PKI (Fig 5B;. A Fig. S8). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que 8CPT actua como um inibidor de factores pró-angiogénicos em células de tumor da próstata estimulada por RAP1 hipóxicas através da activação de PKA.

Para testar este mecanismo em tumores da próstata, determinou-se a inibição de PKA pode inverter a inibição do crescimento do tumor e angiogênese mediada pelo 8CPT

in vivo

. Após a injecção de ratinhos atimicos com células proliferando activamente PC3-cRap1, os animais foram tratados subcutaneamente com PBS, 8CPT, ou H-89 + 8CPT utilizando mini-bombas osmóticas. Tal como observado anteriormente, em ratinhos injectados com células PC3-cRap1, os tumores aumentar de tamanho ao longo do tempo, mas o crescimento do tumor foi significativamente reduzida após tratamento com 8CPT (Fig. 6A). No entanto, o tratamento simultâneo com 8CPT e H-89 inverteu a inibição do crescimento tumoral causado por 8CPT em xenoenxertos PC3-cRap1. De igual modo, a diminuição de 65% no peso do tumor de animais tratados com 8CPT foi resgatado pelo tratamento simultâneo com o H-89 (Fig. 6B). Finalmente, como mostrado na Fig. 6C, a análise imuno-histoquímica da proteína de expressão de CD31 e VEGF nas secções de murganhos sujeitos a infusão com PBS, 8CPT, ou H-89 + 8CPT indicado que o inibidor de PKA H-89 também inverteu a redução da imunorreactividade CD31 e VEGF mediada por 8CPT na PC3- xenotransplantes cRap1. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a inibição PKA poderia reverter a inibição inibição do crescimento do tumor e angiogênese mediada pelo 8CPT

in vivo

.

Discussão

Utilizando uma combinação de análises de ambos

in vitro

e

in vivo

sistemas, o nosso estudo fornece evidências de que um romance inter-relação entre Rap1, a EPAC e PKA regula a indução de tumor microambiente da angiogênese. Nós mostramos anteriormente que sustentou ativação de Rap1 por 8CPT /Epac ou cRap1 inibe a migração de células endoteliais e angiogênese [8], [9]. Para testar a importância de activação Rap1 num modelo de xenoenxerto de tumor da próstata, foram analisados ​​os efeitos de 8CPT ou cRap1 em células PC3. 8CPT não teve efeito sobre o crescimento do tumor em células PC3 parentais mas reduziu significativamente o tamanho do tumor não só mas também VEGF e a angiogénese em animais injectados com células PC3 que expressam cRap1. Surpreendentemente, 8CPT inibiu a indução de VEGF e o crescimento do tumor da próstata por um mecanismo que envolve a activação de PKA em vez de Epac /Rap1. Os nossos resultados indicam que a activação Rap1 em células de tumor da próstata promove a angiogénese sob condições hipóxicas semelhante através de HIF-1α e o VEGF, e activação de PKA antagoniza esta indução (ver esquema representado na Fig. 7). Além disso, os nossos estudos sugerem que as células endoteliais activam preferencialmente Epac em resposta ao tratamento 8CPT sustentada enquanto que as células epiteliais da próstata activam preferencialmente PKA.

Ambos Rap1 e PKA tem sido associada previamente a cancro num modelo de célula epitelial da próstata. linhas celulares de cancro da próstata independentes de andrógeno-dependentes e expressar endógena Rap1 [31], [34]. Rap1 é activada por uma variedade de factores de crescimento incluindo o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), a endotelina, e ácido lisofosfatídico (LPA), através de diferentes mecanismos, incluindo a activação de cAMP da EPAC [35]. Tratamento de LNCaP, mas não de cancro da próstata PC3 células com forscolina ou AMPc provoca a fosforilação Rap1 e activação pela proteína quinase A (PKA) [36], e activado Rap1 tem sido demonstrado induzir a via da MAPK por estimulação B-Raf [37], [ ,,,0],38]. No entanto, os resultados aqui descritos sugerem que um mecanismo diferente é responsável para efeitos observados. Primeiro, vemos os efeitos, tanto LNCaP e células PC3. Além disso, em vez de potenciar a actividade Rap1, PKA actua de forma antagonista para suprimir a produção de VEGF induzida por Rap1.

Rap1 tem sido implicada na progressão da tumorigénese em grande parte através da regulação da adesão celular e célula-célula junções. Por exemplo, Rap1 promove a invasão e metástase de células PC3 através da regulação da α4β3 integrinas aVp3 e [31]. Em contraste, um estudo recente relatou que 8CPT inibe a migração celular em células de cancro da próstata através da activação da EPAC [39]. Nossos resultados sugerem que este efeito poderia ser em parte devido à ativação de PKA por 8CPT, uma interpretação consistente com o antagonismo observado entre Rap1 e PKA em células de tumor da próstata. Os nossos resultados também sugerem que Rap1 activada em células de tumor da próstata sensibiliza as células para a inibição da actividade de HIF-1α pela PKA.