Sumário

Nanog1 humana é um (aa) fator de 305 aminoácidos contendo homeodomain transcrição crítico para a pluripotência das células de carcinoma embrionário (CE) estaminais embrionárias (ES) e. células cancerosas somáticos predominantemente expressa um homólogo retrogene de Nanog1 chamado NanogP8, que é -99% semelhante ao Nanog no nível AA. Embora o M.W previsto de Nanog1 /NanogP8 é ~ 35 kD, ambos têm sido relatados para migrar, por transferência de Western (WB), na massa molecular aparente de 29-80 kD. Se todas essas bandas de proteínas relatados representam proteínas Nanog autênticos não é clara. Além disso, estudos bioquímicos detalhados sobre Nanog1 /NanogpP8 têm faltado. Ao combinar WB usando 8 anticorpos anti-Nanog1, imunoprecipitação, espectrometria de massa, e estudos utilizando proteínas recombinantes, aqui nós fornecemos

evidência direta de que a proteína Nanog1 em NTERA-2 células da CE existe como várias espécies MW de ± 22 KD a 100 kD com uma grande banda de 42 kD detectável na WB. Em seguida, demonstram que as proteínas recombinantes NanogP8 (rNanogP8) feitos em bactérias usando cDNAs de várias células cancerosas também migram, em desnaturante de SDS-PAGE, em ~28 kD e 180 kD. Curiosamente, os anticorpos anti-Nanog1 diferentes apresentam reactividade diferencial em relação rNanogP8 proteínas, que podem formar espontaneamente espécies de proteína de alta M.W. Finalmente, mostra-se que a maioria das linhas celulares de cancro em cultura a longo prazo parece expressar a níveis muito baixos de proteína ou diferentes NanogP8 endógena que não pode ser facilmente detectada por imunoprecipitação. Ao todo, o estudo revela propriedades bioquímicas únicas de Nanog1 em células da CE e NanogP8 em células cancerosas somáticas

Citation:. Liu B, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen I, Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 em NTERA-2 e recombinante NanogP8 de células cancerosas Somatic Adote conformações múltiplas de proteínas e Migrate às espécies M.W múltiplas. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10.1371 /journal.pone.0090615

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Janeiro, 2014; Aceito: 29 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, por concessões do NIH (R01-CA155693), Departamento de Defesa (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), o Centro MDACC para o cancro da epigenética e RNA Centro-Laura concessão John Arnold Foundation (D. G. Tang) e por dois Grants Center (CA166672 CCSG-5 P30 e ES007784). C. Jeter, M. Pessoa, e C. Liu foram apoiados, em parte, por CPRIT RP120394, CPRIT RP110782, e DOD bolsa de pós-doutoramento (PC121553), respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dr. Dhyan Chandra é um membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

Nanog1 (comumente chamado Nanog) é codificada pelo

gene NANOG

localizado na Chr . 12p13.31 (Fig. S1A). O gene tem 4 exões e codifica um factor de transcrição homeodomínio que é crucial para a auto-renovação de células estaminais embrionárias (ES) de células [1], [2]. Nanog1 sobreexpressão em células ES de ratinho (mESCs) supera o requisito de factor inibidor de leucemia para a manutenção da pluripotência [1], [3], enquanto ruptura de

nanog

resulta na diferenciação MESC a endoderme extraembryonic [4]. A sub-regulação de Nanog1 CES em humanos (hESCs) também leva à perda de pluripotência e diferenciação de linhagens de células extraembryonic [5]. Além disso, em associação com outros fatores de reprogramação, Nanog1 supera barreiras de reprogramação e promove a reprogramação de células somáticas [6], [7]. Assim, Nanog1 é um elemento constitutivo do núcleo da rede transcricional para sustentar a auto-renovação das CES.

Nanog1 proteína humana tem 305 aminoácidos (AA) e 5 subdomínios funcionais, isto é, o domínio N-terminal (ND ), homeodom�io (HD), domínio C1-terminal (CD1), o domínio rico em triptofano (WR) e C2-terminal do domínio (CD2) [8] – [11] (Figura 1A).. O ND está envolvido na interferência de transcrição e a região C-terminal contém o activador de transcrição. O domínio HD é necessário para a localização nuclear Nanog e de transactivação e a região WR medeia a dimerização da proteína Nanog, que é necessária para a actividade de pluripotência [12], [13]. De interesse, humana

Nanog

tem 11 pseudogenes [14], entre os quais

NanogP8

, localizado na Chr. 15q14, tem uma armação de leitura aberta completa [14], [15] (Fig. S1B) que possui um elemento Alu no homóloga 3′-UTR a um em

Nanog1

gene, sugerindo que

NanogP8

é um retrogene em vez de um pseudogene. NanogP8 tem, pelo menos, 6 nucleótidos conservada (NT) diferenças em comparação com Nanog1, o que pode provocar algumas alterações aa [15].

(A) Representação esquemática da proteína humana Nanog e 8-nanog Abs anti utilizado neste estude. Mostrado em parênteses são epitopos de Abs individuais. ND, domínio N-terminal; HD, homeodomain; CD1 e CD2, o domínio C-terminal 1 e 2; WR, domínio rico em triptofano. O asterisco na ND indica o resíduo Leu61 reconhecido pelo mAb eBioscience (seta) a partir mapeado nossos estudos actuais. (B-H) WB análise NTERA-2 NE (N, dois lotes diferentes) ou citosol (C) usando 8 anti-Nanog Abs. Ab individuais está indicada na parte inferior e do lado esquerdo M.W. seta preta, a proteína 35 kD Nanog previsto; seta vermelha, o principal de 42 kD banda; . Setas verdes, bandas adicionais (especialmente após exposições mais longas)

Curiosamente, muitas células cancerosas somáticos foram relatados para expressar ARNm e /ou proteína [15] Nanog – [46]. Várias advertências estão associados com muitos destes estudos.

Primeiro

, ao nível do ARNm, estudos rigorosos empregando diferencial por RT-PCR combinados com sequenciação ou sensibilidade diferencial para a enzima de restrição AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] , [46], demonstraram que as células cancerosas somáticas preferencialmente expressar a transcrição da

NanogP8

gene (Fig S1B;. veja abaixo) em vez de

Nanog1

. Na verdade, temos observado que o

nanog1

locus é silenciado em algumas células cancerosas somáticas [15]. Nossa sequenciamento análises revelam que carcinoma embrionário células (CE) NTERA-2 expressam

Nanog1

mas não

NanogP8

mRNA Considerando que todas as células cancerosas somáticas (6 tipos diferentes, incluindo células derivadas de tumores de próstata primário) mostra 5 dos 6 diferenças nt específicas para

NanogP8

[15]. Entre as 5 alterações nt conservadas em

NanogP8

, um (nt759) deve resultar em aa alteração (Q253H), embora algumas células cancerosas mostrar outras mudanças nt conservadas não (ou seja, os polimorfismos), que também pode resultar em mudanças aa (por exemplo, L61P para HPCa6) [15]. Fazer a distinção entre Nanog1 e NanogP8 é importante porque as duas transcrições são derivados de loci genômica separados e têm diferenças nos níveis de sequência nt.

Second

, muitos estudos anteriores têm sido meramente correlativa sem sondando a importância funcional da expressão NanogP8 em células cancerosas. Usando o cancro da próstata humano (APC) como um modelo, que têm mostrado [15] que: 1) proteína NanogP8 é expressa como uma inclinação em células APC com NanogP8 nuclear prontamente detectável em apenas uma pequena fracção das células APC; 2) células que expressam proteínas NanogP8 estão aumentados em CaP primária em comparação com combinando tecidos benignos; 3)

NanogP8

proteína mRNA e NanogP8 são enriquecidas em CD44

+ e CD44

+ CD133

+ células CaP primárias; 4) knockdown shRNA mediada por

NanogP8

inibe a regeneração do tumor de próstata, mama e cólon células cancerosas; e 5) Os efeitos inibitórios da tumorais

NanogP8

knockdown estão associados com a inibição da proliferação celular e a expansão clonal de células de tumor e as perturbações de diferenciação. Nossos estudos recentes demonstram que a expressão NanogP8 inducible em células CaP em massa é suficiente para conferir propriedades de células-tronco do câncer (CSC) e promover o crescimento CaP independente de andrógeno [34] e que NanogP8 é enriquecido no indiferenciado (PSA

– /lo) CaP células e sua knockdown retarda crescimento do CaP resistente à castração [41]. Nossos estudos [15], [34], [41] apontam para possíveis funções pró-oncogênicos de NanogP8.

Third

, as proteínas Nanog1 e NanogP8 previstos são -99% idêntica [15 ]. Consequentemente, o termo ‘Nanog “é muitas vezes usado para se referir genericamente a qualquer proteína (que também é o caso neste artigo). No entanto, a especificidade da maior parte dos anticorpos anti-nanog disponíveis comercialmente (que foram todos produzidos contra Nanog1; Tabela 1) para Nanog1 e, em particular, para NanogP8 permanece descaracterizada. Portanto, não está claro se as bandas de proteína Nanog putativos mostrado no Western Blot (WB), em que, frequentemente, apenas uma tira recortada é mostrado, ou a coloração das proteínas Nanog mostrado na imuno-histoquímica (IHQ) realmente representam a proteína Nanog.

Finalmente

, curiosamente, embora a massa molecular predicado de proteína Nanog (tanto para Nanog1 e NanogP8) é ~ 35 kD, numerosos estudos têm relatado proteínas Nanog putativos migrando, por SDS-PAGE, a massa molecular aparente de 29 de 80 kD em ES, CE, e células cancerosas somáticas (Tabela 1) [2], [5], [17], [24] – [26], [46] – [59]. Ainda mais intrigantes, o mesmo anticorpo parece frequentemente para detectar as bandas de proteína diferente ‘nanog’ (Tabela 1). Se todas estas espécies de proteínas Nanog putativos relatados são proteínas Nanog verdadeiros ainda tem que ser

diretamente

determinado.

O presente estudo foi realizado para abordar as duas últimas perguntas. Nós primeiro fornecer evidência direta de que a proteína Nanog1 em NTERA-2 células CE migra at 30 a ~ 100 kD. Em seguida, mostramos que as proteínas recombinantes NanogP8 também pode migrar em ~28 kD para ~180 kD. Estes resultados sugerem que as proteínas Nanog1 /NanogP8 provável adoptar conformações múltiplas. Finalmente demonstrar que as células cancerosas em cultura somáticas mais longo prazo parecem expressar níveis muito baixos de NanogP8 ou endógena bioquimicamente divergente de tal modo que ele não pode ser rapidamente imunoprecipitada para baixo pelos anticorpos anti-NanogP8 comerciais 8.

Materiais e Métodos

células e Reagentes

Várias linhas de células humanas de câncer, incluindo câncer de próstata (PC3, DU145, LNCaP), câncer de mama (MCF-7), carcinoma do cólon (Colo320) e melanoma (WM -562) células, foram obtidas de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) e cultivadas nos meios recomendados contendo 10% de FBS inactivado pelo calor (soro fetal bovino). células de teratocarcinoma (NTERA-2, clone D; CRL-1973) foram adquiridas da ATCC e cultivadas em mTeSR ™ 1 médio (stemcell Technologies, Vancouver, Canadá). kit de extracção nuclear foi a partir de Thermo Scientific (Rockford, IL). Oito anti-nanog anticorpos primários (ABS) foram obtidos a partir de empresas comerciais (Tabela 1; Fig. 1A). Abs secundária e de controlo foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. reagentes ECL foram comprados de PerkinElmer, Inc. (MA, EUA). A pesquisa atual não envolve experimentos com animais ou seres humanos (ou seja, indivíduos que vivem ou informações pessoais identificáveis). Todos os outros estudos aqui apresentados foram o investigador-iniciado e não necessitam de aprovação de outros órgãos reguladores.

siRNA- e shRNA mediada Nanog experimentos knockdown

Para os experimentos de siRNA knockdown (Fig. 2 ), utilizou siGENOME SmartPool siRNA contra Nanog1 humana e siCONTROL siRNAs não-alvo obtidos a partir Dharmacon (Lafayette, CO). As células plaqueadas 24 horas antes em placas de 6 poços foram transfectadas com ARNsi utilizando Lipofectamine 2000. 48 h mais tarde, as células foram colhidas para experiências WB.

(A) experimentos Nanog siRNA em células NTERA-2. células NTERA-2 foram transfectadas com um ARNsi de piscina específicas-Nanog durante 48 horas, colhido e utilizado para isolar o NE para WB com a Kamiya Ab. Os painéis da esquerda e da direita representam a filmes exposição de curta e longa (SE e LE, respectivamente) (notar que o painel inferior esquerdo é mais curta do filme exposta para ilustrar o knockdown significativa da banda 42 kD). Lamin A /C foi o controle de carregamento. UT, não transfectadas; NC siRNA, controle negativo (siCONTROL non-targeting) siRNAs; Nanog siRNA, SmartPool siRNA contra o Nanog. Vermelho, preto, e setas azuis indicam os principais 42 kD, menores de 35 kD e 48 bandas de proteína kDa, respectivamente, que foram reduzidos em cima Nanog knockdown. As setas referem-se verdes bandas adicionais que também apresentaram redução. (B) O WB foi realizada com o anti Nanog-pAb de coelho CS.

Para os experimentos knockdown shRNA Nanog, lentivírus, incluindo pLL3.7, Nanog-shRNA e TRC-shRNA foram produzidos em 293FT embalagem células (Clontech Laboratories, mountain View, CA), utilizando os protocolos modificados descritos anteriormente [15], [60]. No início,-passagem 293FT células breves geneticina-seleccionado (6 × 10

6/15 cm de placa) foram transfectadas com o RRE (6 ug), REV (4 ug) e VSVG (4 ug) de embalagens plasmídeos, juntamente com um vector lentiviral (6 ug) usando Lipofectamine 2000 para efectuar a transfecção. Em 36-48 h, meios contendo vírus foram recolhidas e adicionou-se meio fresco. Após um adicional de 12-24 h de cultura, os sobrenadantes virais foram novamente colhidas, reunidas, e ultracentrifugado para produzir stocks virais concentradas. Os títulos individuais foram determinados para o vírus marcado com GFP, utilizando células HT1080. O não-GFP marcado vírus TRC-shRNA foi elaborado em paralelo e atribuído o controle de titulação (pLL3.7). As células alvo foram semeadas 24 h antes e infectou pelo densidade celular de aproximadamente 50% e colhidas para

in vitro

ou

in vivo

experimentos 48-72 h após a infecção.

bacteriana expressão e purificação de proteínas recombinantes Nanog (rNanog)

NanogP8

ou

Nanog1

de cDNA em cultivadas NTERA-2, MCF-7, e LNCaP células ou em CaP humana primária amostras (HPCa1, HPCa5, e HPCa6) foi amplificado por RT-PCR utilizando iniciadores LDF1 /LDR1 LDF1 (5′-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 ‘; 5′-LDR1 AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3’) e clonado em pCR2.1 [15]. Os fragmentos EcoRI /Notl ou BamHI /Sall contendo a sequência de codificação Nanog foram então subclonado nos mesmos locais em qualquer pET-28a (+) ou pET-28b (+) vector de expressão bacteriano para gerar proteínas de fusão marcadas com His. Após a verificação de inserção por análise de digestão com enzimas de restrição e sequenciação de ADN, os plasmídeos foram usados ​​para transformar células BL21 (DE)

3 bactérias competentes para expressar as proteínas de fusão. nanog proteína foi induzida por IPTG 0,5 mM durante 3-6 h a 37 ° C e sedimento bacteriano foi mantida a -80 ° C. Para a purificação, peletes bacterianos contendo marcada com His proteína Nanog foram lisadas em tampão de lise (NaH a 50 mM

2P0

4, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, cocktail de inibidores de protease, e 1 mg /lisozima ml ), sonicada durante 10 segundos (um pulso). Marcada com His Nanog no sobrenadante foi purificado por meio de esferas de níquel por instruções do fabricante (Qiagen).

WB usando proteínas recombinantes (rNanog), lisado celular total (WCL), ou extracto nuclear (NE)

rNanog proteínas foram obtido e purificado como descrito acima. WCL e NE (a partir de células de cultura) foram preparados como anteriormente descrito [15]. 50-80 ug de proteínas (rNanog e NTERA-2 NE) foram analisados ​​por 12,5% de SDS-PAGE e os geles foram transferidos para uma membrana de transferência Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA). A membrana foi bloqueada com não-gordo 5% de leite seco em TBST (10 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl e 0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente, e incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário. As membranas foram lavadas três vezes com tampão de TBST, depois incubados durante 1 h com anticorpo secundário 1:2000, e desenvolvido com reagente de detecção ECL Além disso WB (PerkinElmer).

A imunoprecipitação (IP)

recombinante proteínas (500 ug) ou NE (800 ug ou dependendo fins experimentais) foram incubadas com os anticorpos anti-nanog indicados durante a noite a 4 ° C. Em seguida, a solução foi incubada com proteína A /G-agarose (Sigma, MO, EUA) durante mais 1 h a 4 ° C. Após incubação, as esferas foram lavadas três vezes com tampão RIPA. As proteínas ligadas à proteína A-agarose foram eluídas com tampão SDS-PAGE de carga e fervida durante 8 minutos e sujeitas a SDS-PAGE.

diálise experiências de redobragem

Para isolar e purificar uma grande quantidade de rNanog, peletes bacterianas foram sonicadas 6 vezes com 10 segundos de pulsos. A solução de ultra-sons foi centrifugado a 10000 rpm durante 15 min a 4 ° C. As peletes foram lavadas com PBS frio por três vezes. O material precipitado foi o corpo de inclusão de proteína rNanog. Para dissolver o corpo de inclusão, foi utilizado um tampão contendo ureia 7 M e em seguida a solução foi submetida a diálise contra os tampões de 1,5 M, 0,6 M, 0,3 M e ureia 0,1 M (em NaCl 1,5 M, Tris HCl 10 mM, pH 7,0). A solução de diálise foi submetido a SDS-PAGE para determinar a existência de proteína Nanog solúvel.

Nanog identificação de proteínas (ID) por espectrometria de massa (MS) analisa

Três conjuntos de proteínas com base em MS ID experiências foram realizadas em ambos proteínas NE rNanog ou preparados a partir de células NTERA-2. Na

primeiro experimento ID

, nós imunoprecipitadas uma grande quantidade de NE celular NTERA-2 (~ 2 mg total) com a R D cabra pAb. Após lavagem (3x) com tampão RIPA, as proteínas ligadas à proteína G-agarose foram eluídas com tampão SDS-PAGE de carga e fervida durante 8 minutos e sujeitas a SDS-PAGE. O gel foi então corado com solução SYPRO Ruby. Fatias de gel /áreas que contêm as bandas de interesse foram cortadas, as proteínas eluídas, e submetido a digestão com tripsina. As digestões com tripsina foram analisados ​​por LC-MS /MS usando o Dionex final 3000 RSLCnano LC acoplado ao Thermo Orbitrap Elite. Antes da separação por HPLC, os péptidos foram dessalinizadas utilizando Millipore L-C18 ZipTip ponteiras seguindo o protocolo do fabricante. A 2 cm de comprimento x 100 mm I.D. C18 5 uM coluna armadilha (Coluna Proxeon FÁCIL) foi seguido por um 75 um I.D. × 15 cm de comprimento coluna analítica embalado com C18 3 material de um (Dionex Acclaim PepMap 100). O tampão A foi composta de ácido fórmico a 0,1% em água e tampão B 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo. Os dados foram adquiridos por 35 min utilizando um gradiente de HPLC de 5% de B até 45% B ao longo de 30 min com um caudal de 300 nl /min. A resolução FT-MS está definido para 120.000, e top 20 MS /MS são adquiridos no modo armadilha CID ion. Os dados em bruto foi processado usando SEQUEST incorporado em Proteome Discoverer v1.3 usando os seguintes parâmetros: tripsina completa digerir com o máximo perdeu clivagens, modificação carbamidomethylation fixa de cisteína, a oxidação modificação variável de metionina e deaminidation de asparagina e glutamina, em busca do proteoma humano de referência 2 de UniProt entre março de 2012 (80990 entradas). A precisão de massa para precursores foi definido para massa monoisotópico 10 ppm, para os iões de fragmento foi de 0,8 Da massa monoisotópico. Uma base de dados de engodo foi gerado a partir da base de dados humana UniProt e utilizado pelo péptido validador e andaime para calcular os valores falsos positivos. X! Pesquisas de banco de dados Tandem (O GPM, thegpm.org, versão de ciclone (2010.12.01.1)) foram realizadas embutido no andaime 3 Q + (Proteome Software) usando os mesmos parâmetros de busca como SEQUEST. Andaime foi utilizado para validação de peptídeos e proteínas identificações com filtragem de confiança de confiança de 95% para dois peptídeos, e um corte de confiança de proteínas de 99,9%. valores de peptídeos e proteínas de falsos positivos foram calculados como 0,02% e 0,1%, respectivamente, do andaime.

segunda

conjunto de experimentos usando o NE celular NTERA-2, foi realizado o IP conjunto usando Kamiya o pAb seguido pela R D pAb e os imunoprecipitados foram separados num espectrometria de massa por captura de iões linear (LTQ, Oorbitrap Velos) como descrito [61]. Simplesmente, os fragmentos excisados ​​foram descorados com solução de descoloração (40% de metanol, 50 milímetros de NaHCO

3 em água) e submeteu-se em gel de digestão utilizando 100 ng de tripsina em NH 50 mM

4HCO

3, pH 8,5, durante 12 h. Os péptidos foram em seguida extraiu-se com acetonitrilo e secou-se num secador de Speed-Vac (Savant Thermo). Cada amostra seca foi dissolvido em 20 ul de solução a 5% de metanol /95% de água /0,01% de ácido fórmico e injectado no sistema Surveyor HPLC (Thermo Finnigan), utilizando um amostrador automático. Uma coluna C18 de 100 mm x 75 ^ M (5 um, 300 um diâmetro de poro, PicoFrit; New Objective) com fases móveis de A (ácido fórmico a 0,1% em água) e B (ácido fórmico a 0,1% em metanol) foi usada, com um gradiente de 5-95% de fase B ao longo de 45 min seguido por 95% de fase B durante 5 min a 200 nL /min. Os péptidos foram directamente electrosprayed no (LTQ Oorbitrap Velos (Thermo Scientific), utilizando uma fonte de nanospray. O LTQ foi operado no modo dependente de dados para adquirir espectros de fragmentação dos 20 iões fortes sob o controlo directo do software Xcalibur (Thermo Scientific). Obteve espectros MS /MS foram pesquisados ​​contra-alvo chamariz do banco de dados RefSeq humana em Proteome Discoverer 1.2 Interface (Thermo Fisher) com o algoritmo de Mascot (Mascot 2.1, Matrix Science). modificação variável de acetilação (lisina), di-Glycine (lisina), fosforilação ( serina e treonina) e de oxidação (metionina) foi deixada. Além disso, a modificação estática de DeStreak (Cisteína) foi deixada. A tolerância massa precursor foi confinado dentro de 10 ppm com tolerância massa fragmento de 0,5 dalton e um máximo de duas clivagens perdidas permitido. afectadas peptídeos foram filtrados com 5% de falsos descobrir taxa e sujeito a verificações manuais.

terceiro

ID experiência, proteínas rNanog1 /rNanogP8 foram purificados e fatias de gel contendo várias bandas de proteínas foram usados ​​em MALDI -TOF identificação /TOF conforme descrito anteriormente [62]. digestões com tripsina foram analisados ​​utilizando um 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF /TOF (AB Sciex, Foster City, CA). As amostras foram dessalinizadas com μC18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) com eluição directamente sobre o alvo de MALDI utilizando a matriz α-ciano-4-hidroxicinâmico em 5 mg /ml em 67% de acetonitrilo /0,1% de ácido trif luoroacético. MS e MS /MS espectros foram adquiridos automaticamente usando 4000 Explorer Series V RC1 3.0. Até 20 picos com S /N 20 foram seleccionados para o MS /MS de fragmentação, excluindo os picos matriz, tripsina, e queratina. processamento de pico adicional e pesquisa de banco de dados foram realizadas utilizando GPS Explorador v3.5. V2.0 MASCOTE ou V2.2. Os espectros foram comparados com o banco de dados Swiss-Prot incluindo sequências Humanos (01 de setembro de 2009, 20495 entradas). Os parâmetros de pesquisa escolhidos foram clivagem por tripsina /P com até 2 perdeu clivagens, modificação fixa de carbamidomethylation de cisteína e modificações variáveis ​​de acetilação da proteína N-terminal, oxidação da metionina e ácido piroglutâmico modificação de resíduos de glutamina péptido N-terminal. A pesquisa de banco de dados utilizado tolerância massa 50 ppm de massas MS monoisotópico e 0,2 Da para MS /MS, até 100 picos com S mínima /N 15 foram selecionados para o MS, e até 65 iões do fragmento com S mínima /N 3. A busca saída combina as pontuações de MS busca e de pesquisa MS /MS usando um algoritmo Mowse probabilística. A pontuação MASCOTE é definido como -10 * logP, onde P é a probabilidade de que o jogo observado é um evento aleatório. A MASCOTE marcar 56 que corresponde a p . 0,05 é escolhido como o ponto de corte para um sucesso significativo, e as proteínas que excedam o valor de corte são relatados

Resultados

Sete dos oito anti-Nanog anticorpos detectar, em WB, a maior 42 kD e menores de 35 bandas kD em NTERA-2 NE

Human

Nanog1

gene (gi 13376297), localizada na Chr. 12p13.31 e expresso principalmente em células ES e EC, tem um 915-pb grelha de leitura aberta (Fig. S1A). Ele codifica uma proteína de 305-AA que é comumente referido como Nanog (Fig. 1A). Nanog1 proteína humana é previsível que tenha uma massa molecular de ~ 35 kD. Curiosamente, as proteínas que migram a nanog putativos massas moleculares aparentes de 29-80 kDa em WB foram relatados em ES, CE, e células cancerosas somáticas (Tabela 1). Não está claro, no entanto, se essas espécies de proteínas Nanog relatados representam verdadeiramente as proteínas Nanog. Para resolver esse problema e para determinar diretamente a massa molecular (es) de proteína Nanog endógena, realizamos primeiro analisa abrangente WB nas células CE NTERA-2 utilizando 8 comercial anti-Nanog (isto é, anti-Nanog1) anticorpos (Abs), dirigido contra diferentes regiões da proteína Nanog humana (Figura 1A;. Quadro 1, os primeiros 8 Abs). Entre os 8 anti-Nanog Abs, quatro [Kamiya Rb PAB, SC (Santa Cruz) de cabra pAb N17, Cell Signaling (CS) Rb pAb e Rb mAb] são direcionados para a ND, dois (SC Rb pAb H-155 e R D pAb de cabra) para o terminal C, e um (BioLegend Rb pAB) para o HD (homeodom�io), enquanto que outro (mAb eBioscience) é criado contra a proteína de comprimento completo humana Nanog1 (Fig 1A)

WB Os resultados revelaram que os anticorpos diferentes exibidas reactividade distinta e cada anticorpo detectado múltiplas bandas em NTERA-2 NE (que incidiu sobre expressão nuclear como Nanog é um factor de transcrição nuclear) com PM de ~28 kD de -100 kD (Fig . 1B-H). Especificamente, os resultados demonstraram que:. 1) o mAb eBioscience mostrou a

limpa

e mais

reactividade específica, detectando apenas uma banda forte de ~42 kD (Fig 1B, seta vermelha) e uma banda fraca de ~ 35 kD (Fig. 1B, seta preta) na NE sem bandas imunorreactivas no citosol com 3 min de exposição da película (fig. 1B). Por outro lado, o mAb eBioscience exibiu a menor sensibilidade entre os 8 anticorpos. O kD banda 35 e outra banda ~ 65 kD no NE tornou-se evidente após o tempo de exposição prolongada (15 min; A Fig. 1B). 2) O Kamiya pAb mostrou

o segundo mais limpo

reactividade (Fig. 1C). Após a exposição curta (10 segundos), ele detectou uma forte banda de 42 kD com uma muito fraca banda de 35 kD no NE (Fig 1C;. Setas vermelhas e pretas, respectivamente). No citosol, é detectada a banda 42 kD e várias outras bandas (Fig. 1C). Após uma exposição mais longa (2 min), a Kamiya pAb também detectadas três bandas superiores em ~48 kD, ~ 65 kD e ~ 90 kD em ambos NE e citosol (Fig. 1C, seta verde no painel da direita). 3) Ambos CS Rb pAb e mAb foram

The Sims anticorpos mais sensíveis, tais que eles detectados os proeminentes 42 kD e 35 kD bandas com apenas 1-5 exposição sec (Fig. 1D). Ambos os anticorpos também detectou várias bandas adicionais (Fig. 1D, setas verdes). 4) o PAB SC cabra (N17) detectou um 42 kD banda óbvia e uma 35 banda kD fraco, juntamente com duas faixas superiores de ~55 kD e ~58 kD (Fig. 1E). 5) O BioLegend Rb pAb foi o “mais sujo” Ab e detectou uma série de bandas fortes no citosol e só fraco 42 kD banda no NE (Fig. 1F, seta vermelha). 6) O SC Rb Pab (H-155) detectado o óbvio 42 kD banda e o mais fraco 35 kD banda (Fig. 1G, setas vermelhas e pretas, respectivamente), juntamente com várias outras bandas a 100 kD, 70 kD, 58 kD e ~28 kD (Fig. 1G, setas verdes). 7) Finalmente, a R .. D pAb de cabra detectada uma banda aparente de 42 kD e uma banda menor de 35 kD (Fig 1H, setas vermelhas e pretas, respectivamente), juntamente com várias bandas adicionais (Fig 1H, pontas de seta verde) .

Em resumo, esta análise WB abrangente usando 8 anti-Nanog Abs eo NTERA-2 NE revelou que: 1) exceto para o BioLegend Ab, os outros 7-Nanog anti Abs todos os

comumente

reconhecer um dos principais 42 kDa e uma banda de proteína menor de 35 kD; 2) Três anticorpos produzidos contra o N-terminal, ou seja, Kamiya Rb PAB, CS pAb e CS mAb, dar resultados WB limpo após a breve exposição de filmes; 3) com uma exposição mais longa, todos os anticorpos detectar bandas de proteínas adicionais que variam de ~28 kD para 100 kDa. No entanto, diferentes Abs detectar diferentes padrões de bandas de proteínas reactivas; 4) No que diz respeito à sensibilidade, o mAb CS e CS pAb são os mais sensíveis seguido pelo Kamiya Ab enquanto que o mAb eBioscience é o menos sensível; 5) O BioLegend anti-Ab Nanog não detecta os 42 kD, tal como a principal banda proteica no NTERA-2 NE; e 6) anticorpos diferentes podem reconhecer preferencialmente diferentes bandas de proteína. Por exemplo, Kamiya o pAb, mas não o CS pAb ou mAb reagiu com a banda de 48 kD.

mediada por siRNA knock-down revela a banda da proteína de 42 kD, tal como a isoforma predominante de proteína Nanog em NTERA-2 células

Uma vez que a proteína Nanog previsto é ~ 35 kD, podemos inferir que a banda de proteína de 35 kD menor comumente detectada na WB mais provável é a proteína Nanog. Para confirmar esta conclusão e para determinar se o predominante de 42 kD e qualquer uma das bandas adicionais são também nanog proteínas, foram realizados experimentos de siRNA knock-down em células NTERA-2. Como mostrado na Fig. 2A, o Kamiya Rb pAb detectado consistentemente forte banda de proteína KD 42, que diminuiu em resposta ao Nanog siRNA. Além disso, o menor de 35 kD da banda e vários outros bandas mais fracas que migra a 48 kD, 65 kD, 75 kD e 90 kD, todos diminuíram em células tratadas com siRNA Nanog (Fig. 2a). Quando realizamos WB utilizando o CS Rb PAB, o Nanog siRNAs também derrubou a 42 kD e 35 kD bandas (Fig. 2B). Além disso, uma banda de 65 kD superior também foi reduzida (Fig. 2B). Note-se que a CS pAb não detectou 48 kD ou outras bandas superiores excepto a 65 kD da banda (Fig. 2B), consistente com os resultados anteriores WB com o CS pAb e mAb (Fig. 1D). Colectivamente, o siRNA knock-down experiências sugerem que

a proteína Nanog em células NTERA-2 parece migrar, na desnaturação SDS-PAGE, em várias massas moleculares incluindo aproximadamente

35

,

42

,

48

,

65

,

75

, e

90

kD com a banda de 42 kD ser o dominante “isoforma”

.

Caracterização de espécies de proteínas NANOG em NTERA-2 células por imunoprecipitação (IP), seguido por espectrometria de massa de identificação (MS) (ID)

Para substanciar os resultados knockdown siRNA, foram realizados dois conjuntos de experimentos de identificação de proteínas com base em MS.

No primeiro

, realizamos experimentos IP utilizando 500 ug de NE de NTERA-2 e somáticas células cancerosas e com 5 anti-Nanog Abs, ou seja, eBioscience mAb, Kamiya PAB, CS Rb mAb, SC pAb H155 , e R D cabra pab (figura 3;. A Fig. S2A-B; dados não mostrados). Todos os 5 anticorpos imunoprecipitadas a kD Nanog banda 42 em NTERA-2 NE. Por exemplo, quando o IP foi feito com a Kamiya pAb seguido por WB usando eBioscience mAb (Figura 3A, pista 9.) Ou R D cabra Pab (Fig. S2A, pista 10), a proteína de 42 kD foi imunoprecipitado. IP com o mAb Rb CS, também dirigido contra o terminal-N de Nanog, puxado para baixo a banda de 42 kD (WB usando o R D cabra pAb; A Fig. 3B, pista 9). Quando IP foi feito com o SC pAb H-155, dirigido para o terminal C de Nanog, seguido por WB usando eBioscience mAb (Figura 3C, pista 8.) Ou R D cabra Pab (Fig. S2B), o 42 proteína kD foi imunoprecipitado no NE NTERA-2. Como mostrado na Fig.