Abstract

Purpose

O câncer de pâncreas é uma neoplasia agressiva com campo metastático características da doença e resistência à quimio-radioterapia convencional. RLIP76 é uma proteína da membrana celular multi-funcional que funciona como um transportador principal via do ácido mercaptúrico, bem como regulador chave de complexos de receptor-ligando. A este respeito, foi investigada a importância da segmentação RLIP76 em PI3K /Akt e os mecanismos de regulação da resposta a quimio-radioterapia.

Projeto de Pesquisa e Métodos

A sobrevivência das células foi avaliada por MTT e formadoras de colônia ensaios. os níveis celulares de proteínas e a fosforilação foi determinada por análises Western blot. O impacto sobre a apoptose foi determinada pelo ensaio de TUNEL. Os efeitos anti-câncer de RLIP76 alvo intervenções

in vivo

foram determinados utilizando camundongos modelo de xenotransplante do cancro pancreático. A regulamentação do transporte de doxorrubicina e radiação sensibilidade foram determinadas por estudos de transporte e ensaios formadoras de colónias, respectivamente.

Resultados

Nossos estudos atuais revelam um modelo abrangente para o papel de RLIP76 na regulação dos níveis de proteínas fundamentais como PI3K, Akt, e-caderina, CDK4, Bcl2 e PCNA que são de importância específica na transdução de sinal de cascatas de sinalização a montante críticos que determinam a proliferação, apoptose e diferenciação de células de cancro do pâncreas. esgotamento RLIP76 também causou acentuada e sustentada regressão da BxPC-3 tumores de câncer de pâncreas humanos estabelecidos no modelo de ratinho de xenoenxerto nu. RLIP76 acabou por ser um importante regulador do transporte da droga junto com contribuindo para a resistência à radiação no câncer de pâncreas.

Conclusões /Significado

RLIP76 representa um alvo mecanicamente significativa para o desenvolvimento de intervenções eficazes em agressivo e cancros pancreáticos refratários

Citation:. Leake K, Singhal J, Nagaprashantha LD, Awasthi S, Singhal SS (2012) RLIP76 Regula PI3K /Akt Sinalização e quimio-radioterapia Resistência no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (4): e34582. doi: 10.1371 /journal.pone.0034582

editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Janeiro, 2012; Aceito: 07 de março de 2012; Publicação: 03 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Leake et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH Grant CA 77495 ea Fundação Cancer Research of North Texas. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre os homens e mulheres [1]. Aproximadamente 95% dos tumores malignos no pâncreas surgem a partir do tecido exócrino. Entre malignidades exócrinas pancreáticas, 80% a 90% são adenocarcinomas ductais [2], [3]. Menos de 20% dos pacientes com cancro do pâncreas têm doença que é macroscopicamente confinadas ao pâncreas ao diagnóstico com o resto dos pacientes com metástases viscerais localmente avançada e distantes, normalmente envolvendo o fígado [4]. cancros pancreáticos possuir múltiplos aberrações nas cascatas de sinalização celular e são caracteristicamente conhecido para o seu fenótipo invasivo e refractariedade aos modos convencionais de terapia. O tratamento do cancro do pâncreas é frequentemente satisfeitas com resultados desapontantes devido ao desenvolvimento de resistência à terapia consequente para a activação de um certo número de proteínas promotora da sobrevivência que transdução de sinais a partir de moléculas de sinalização extracelulares, tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de transformação de crescimento (TGF ), ou factores de crescimento semelhantes à insulina (IGF1) [5], [6]. Estudos moleculares também têm caracterizado os mutações do oncogene K-ras em 80% ou mais de adenocarcinomas ductais [7]. A via PI3K /Akt desempenha um papel importante na transdução de sinal de receptores de factores de crescimento a montante, bem como K-ras oncogénicas [8] – [12]. PI3K sinalização /Akt também representa um eixo potente e fundamental do relé de sinal que determina a sobrevivência basal e resistência aos efeitos apoptóticos de quimio-radioterapia em uma variedade de cânceres, o que torna PI3K /Akt um foco central das investigações mecanicistas em câncer pancreático [13], [14]. Atualmente, não existe um tratamento eficaz para o câncer de pâncreas e quimio-radioterapia convencional tem mostrado um sucesso muito limitado na melhoria da sobrevida dos pacientes. A taxa de sobrevida global de pacientes com câncer pancreático é ~ 5%. Por isso, a investigação dos mecanismos de ação dos novos alvos que podem regular as alterações moleculares que conduzem a sobrevivência de câncer pancreático e refratariedade à terapia facilitará o desenvolvimento de intervenções eficazes para câncer de pâncreas [4], [15].

mercaptúrico via do ácido desempenha um papel crítico na regulação do celular antioxidante resistência potencial e quimio-radioterapia [16]. A glutationa (GSH) é um enxofre contendo pequena molécula nas células que é essencial para proteger as células de vários estímulos tóxicos que induzem a morte de células [17]. Durante o primeiro passo na via do ácido mercaptúrico, a glutationa celular S-transferases (GSTs) catalisam a conjugação de drogas de quimioterapia administradas e produtos de peroxidação de lípidos, consequente induzido a radioterapia, com GSH para formar glutationa-conjugados (GS-Es) [18 ]. GS-Es ainda são tóxicos para as células e devem ser effluxed para fora das células, a fim de proteger as células de morte celular. Durante o segundo passo da via metabólica do ácido mercaptúrico, GS-Es são effluxed para fora das células e este processo é mediado por bombas de transporte dependente de energia presentes nas membranas de células [19]. Nos nossos extensos estudos publicados anteriormente, mostrámos que RLIP76 é um transportador via do ácido mercaptúrico primária que remove GS-Es resultantes de produtos de peroxidação lipídica e os medicamentos de quimioterapia das células. Esta função de RLIP76 é mais importante para as células cancerosas em comparação com as células normais como a depleção de RLIP76 não mata as células normais, mas é muito eficaz para matar células cancerosas de quase todos os tipos de [20] – [24].

os nossos estudos publicados recentemente indicam que RLIP76 é também um GS-E transportador de stress-responsivo necessária para a endocitose dependente de clatrina-(CDE), que é necessária para a regulação da sinalização do receptor-ligando aos receptores de membrana de células [25]. No contexto de golpear resistência quimio-radioterapia de cancros pancreáticos e o papel fundamental da RLIP76 como um importante transportador de via do ácido mercaptúrico que é essencial para a sobrevivência e terapia de resistência em cancros, que investigou o papel de RLIP76 na regulação das proteínas de sinalização críticos envolvidos na retransmitindo as entradas a partir de múltiplas vias de sobrevivência a montante e mecanismos que contribuem para a resistência à quimio-radioterapia em câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

Materiais

a doxorrubicina (DOX, adriamicina) foi obtido de Adria Laboratories (Columbus, OH).

3H-GSH (3000 Ci /mmol) foi adquirido a Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

14C-DOX (actividade específica 44,8 Ci /mmol) foi adquirido a NEN Life Sciences (Boston, MA). Policlonal de coelho anti-humano de rec-RLIP76 IgG, bem como de IgG pré-imune foram preparados e purificados como descrito anteriormente [26], [27]. MRP (N19; cat # sc7774), o PGP (C19; cat # sc1517), Akt (cat # Sc8312), GAPDH (cat # sc32233), Bcl2 (cat # sc509), Bim (cat # sc11425), e ciclina B1 ( # sc595 anticorpos do gato) foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Columbus, OH). pAkt (S

473; cat # 05-736) anticorpo foi obtido a partir de Upstate Cell Signaling (Lake Placid, Nova Iorque). Os anticorpos contra PI3K (cat # 4292S), pPI3K (Y

458; cat # 4228) e PCNA (cat # 2586S) eram de sinalização celular Technologies (Danvers, MA). E-caderina (Cat # C3621), β-actina (cat # A5441), e CDK4 (Cat # DCS-35) anticorpos eram da Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO.) E Neomarkers (Fremont, CA) , respectivamente. TUNEL kit de detecção de fluorescência foi adquirida a Promega (Madison, WI). DNP-SG foi sintetizado a partir de CDNB e GSH de acordo com o método descrito por nós anteriormente [28]. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) aprovado. RLIP76 anti-sentido foi comprado de Biossíntese, Inc., (Lewisville, TX) [22], e RLIP76 siARN foi comprado de Dharmacon Research (Lafayette, CO), como descrito anteriormente [29].

Animais

Hsd: ratos nu /nu atímicos foram obtidos de Harlan, Indianapolis, IN. Os animais foram mantidos no Instituto de Pesquisas Beckman, City of Hope National Medical Center, Duarte, CA. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado (# 11016) pelo Instituto de Pesquisas Beckman, City of Hope National Animal Care Medical Center Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

linhas celulares e culturas

células vasculares endoteliais umbilicais humanas (HUVEC) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Fiemu Nwariaku, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, conforme descrito anteriormente (22-24), e cultivou-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 em meio EGM-2 kit de bala suplementado com 10% de solução (v /v) de FBS inactivado por calor e 1% (v /v) de Pen-Strep (P /S). cancro pancreático humano linhas celulares (BxPC-3 e Panc-1) foram adquiridos da American Type Culture Collection, Manassas, VA e cultivaram-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 em MEBM e meio RPMI-1640 meio suplementado com 10% (v /v) de FBS inactivado pelo calor, 1% (v /v), Pen-Strep solução de (P /S), 2 mM de L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 4,5 g /L de glucose, e 1,5 g /L de bicarbonato de sódio. Todas as células foram testadas para a

Mycoplasma

uma vez a cada 3 meses.

viabilidade celular MTT ensaio

O número de células /ml em uma alíquota de células em crescimento em fase log foi determinada por contagem tripano azul excluindo células em um hemocitómetro e 20000 células foram plaqueadas em cada poço de placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano. Após 12 h de incubação a 37 ° C, o meio contendo quer de IgG pré-imune ou anti-RLIP76 IgG (40 ug /ml de concentração final) foram adicionados às células. Após 24-48 h de incubação, 20 uL de 5 mg /mL de MTT foi introduzida a cada poço e incubou-se durante 2 h de exposição. As placas foram centrifugadas e o meio foi decantado. As células foram, subsequentemente, dissolvido em 100 ul de DMSO com agitação suave durante 2 h à temperatura ambiente, seguido por medição de OD

570 nm [30]. Oito cavidades replicadas foram usadas em cada ponto em cada uma das três medições separadas. Os valores de absorvância obtidos foram directamente ligada com uma folha de cálculo para o cálculo do IC

50, definido como a concentração de fármaco que reduz a formação de formazano por 50%. Depleção de expressão em células de RLIP76 RLIP76 siRNA e RLIP76 anti-sentido foram medidos como se segue: as células foram incubadas durante 3 h com 0-2 ^ g /cavidade de qualquer um RLIP76 siRNA usando Transmessenger Transfection Reagent (Qiagen) ou RLIP76 anti-sentido utilizando o reagente de transfecção Maxfect (molécula) de acordo com os protocolos do fabricante fornecidas

Clonagem, expressão procariótico, e purificação de RLIP76

a proteína purificada RLIP76. (1965 pb; 655 aa) foi obtida a partir de

e. coli

BL21 (DE3) que expressa o plasmídeo pET30a (+) contendo ADNc de comprimento completo correspondente à sequência de RLIP76. A purificação foi realizada usando resina DNPSG-afinidade, como descrito anteriormente e a pureza foi confirmada por análises de Western blot [26], [31].

reconstituição funcional de rec-RLIP76 purificada em lipossomas artificiais, e os estudos de transporte

purificada RLIP76 foi dialisada contra tampão de reconstituição (Tris-HCl a 10, pH 7,4, MgCl 2 mM de

2, EGTA 1 mM, KCl a 100 mM, sacarose 40 mM, BME 2,8 mM, BHT 0,05 mM, e 0,025% de polidocanol). Uma emulsão aquosa de asolectin de soja (40 mg /mL) e colesterol (10 mg /ml) foi preparada em tampão de reconstituição por sonicação e 0,1 ml desta mistura foi adicionada a 0,9 ml de alíquota de proteína de rec-RLIP76 dialisado e purificado. A mistura de reacção foi sonicada a 50 W durante 30 segundos. Vesiculação foi iniciada pela adição de 200 mg de SM-2 Bio-beads pré-equilibradas no tampão de reconstituição sem polidocanol. Vesiculação foi levada a cabo durante 4 h a 4 ° C, o SM-2 Bio-esferas foram removidas por centrifugação e as vesículas (lipossomas RLIP76) foram recolhidas. A fracção recolhida produz principalmente unilammelar vesículas com um diâmetro médio de 0,25 ^ m e proporção em volume intravesicular /extravesicular de 18 uL /​​mL. vesículas de controlo (Control-lipossomas) foram preparados utilizando uma quantidade igual de albumina ou proteína bruta de

E. coli não

expressar RLIP76. transporte dependente de ATP

14C-DOX e

3H-DNPSG na rec-RLIP76 reconstituído proteolipossomos foi realizada pela técnica de filtração rápida utilizando o protocolo exato descrito por nós anteriormente, onde foi estabelecida a eficiência de entrega para proteolipossomos [ ,,,0],26].

Preparação de fracções de membrana em bruto para análises de Western blot

fracções de membrana em bruto foram preparados a partir das linhas celulares de cancro e normais utilizando os procedimentos estabelecidos, como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, as células foram sedimentadas e lavadas com solução salina equilibrada (NaCl 138 mM, KCl 5 mM, KH 0,3 mM

2 PO?

4, Na 0,3 mM

2HPO

4, NaHCO 4 mM de

glicose a 3, e 5,6 mM, pH 7,4) três vezes. As células lavadas foram lisadas em Tris-HCl a 10, pH 7,4, contendo 1,4 mM de BME, PMSF 0,1 mM, BHT 0,05 mM, EDTA 0,1 mM e 0,5% (v /v) de polidocanol. Os lisados ​​foram sonicadas três vezes durante 30 segundos a 50W e incubou-se durante 4 h a 4 ° C com agitação ocasional. Após a incubação, a preparação resultante foi centrifugada a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C. O sobrenadante foi recolhido e sujeito a SDS-PAGE. Os níveis de proteína RLIP76 em células normais e de cancro foi medido por transferência de Western e ELISA, utilizando RLIP76 anti-IgG, como descrito anteriormente [29], [31]. Purificada rec-RLIP76 com a pureza avaliada através da análise da composição de aminoácidos foi usado para gerar curvas de calibração.

estudos de transporte em IOVS

vesículas de membrana bruta (interior-out vesículas, IOV) foram preparados a partir da normais (HUVEC) e linhas de células malignas (BxPC-3 e Panc-1) utilizando procedimentos estabelecidos, tal como descrito por nós para as células K562 [26]. Estudos de transporte de DOX e DNP-SG em IOVS foram realizadas pelo método tal como descrito anteriormente [26]. IOVS foram revestidos separadamente com 40 ug concentração final /ml de anticorpo anti-IgG RLIP76, anti-IgG de MRP1, ou IgG anti-Pgp e usadas para medir a captação dependente de ATP

14C-DOX. absorção dependente de ATP

14C-DOX foi determinada subtraindo a radioactividade (cpm) dos controlos sem ATP a partir de que um dos grupos experimentais contendo ATP. O transporte de DOX foi calculada em termos de /mg de proteína pmol /min IOV. O transporte de

3H-DNP-SG foi medido de forma semelhante

xenotransplantes tumorais modelo

Hsd:. Camundongos nu atímicos /nu foram obtidos de Harlan, Indianapolis, IN. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC). Trinta e seis ratos 10 semanas de idade foram divididos em seis grupos de 6 animais (tratados com soro pré-imune, mexidos siRNA, anti-sentido, anticorpos RLIP76, RLIP76 siRNA e ADN anti-sentido RLIP76 scrambled). Todos os 36 animais foram injectados com 2 × 10

6 células humanas do cancro do pâncreas (BxPC-3) As suspensões em 100 uL de PBS, por via subcutânea. Os animais foram examinados diariamente quanto a sinais de crescimento do tumor. O tratamento foi administrado quando a área de superfície do tumor excedeu ~42 mm

2 (47 dias após injecção das células tumorais, isto é, um dia de tratamento). O tratamento consistiu em 200 ng de anticorpos quer RLIP76, RLIP76 siRNA anti-sentido ou RLIP76 em 100 ul de PBS. Os grupos de controlo foram tratados com 200 ug /100 ul de soro pré-imune, e mexidos siRNA anti-sentido mexidos. Os tumores foram medidos em duas dimensões por pinças.

Colony ensaio de formação de

As células (0,1 × 10

6 células /500 mL) foram incubadas com antisense mexidos e RLIP76 antisense (10 ug /ml de concentração final) durante 24 h. Após 24 horas, aliquotas de 50 e 100 uL de foram ainda incubadas em 60 mm de tamanho de pratos de Petri, separadamente, num volume total de 4 ml de meio a em cada placa de Petri. Para as experiências de controlo de irradiação, e RLIP76-proteolipossomas (50 ug /ml de concentração final, 24 h), as células tratadas foram irradiados a 100, 200, 500 e 1000 cGy, utilizando Varian Clinac 2100C acelerador linear com feixe de fotões 6 MeV. Após 7 dias, as colónias aderentes foram fixadas, coradas com azul de metileno a 0,5% durante 30 min., E as colónias foram contadas utilizando Innotech Alpha Imager HP [32].

Efeito do RLIP76 anti-sentido sobre a apoptose pelo ensaio de TUNEL

células (~ 1 x 10

6) foram cultivadas nas lamelas e tratados com anti-sentido e mexidos RLIP76 anti-sentido (10 jig /ml de concentração final), em reagente de transfecção Maxfect (molécula). A apoptose foi determinada pela rotulagem de fragmentos de DNA com etiquetagem terminal de desoxinucleotidil-transferase dUTP nick end-ensaio (TUNEL) utilizando o sistema de detecção da apoptose Promega de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante [33].

Análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​com o teste t de Student desemparelhado de duas caudas ou comparadas por ANOVA de um factor e são expressos como a média ± DP. Para

in vivo

estudos, os valores de tratamento da toxicodependência foram comparados com os valores veículo de tratamento de controle. A

p

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão de RLIP76 em células de câncer de pâncreas

análises de Western blot dos extractos de proteínas de membrana. a partir de células de cancro pancreático humano normais e indicou a presença de quantidades relativamente maiores de RLIP76 em células de cancro pancreático em comparação com as células normais (Fig. 1a). Após a caracterização da expressão aumentada de RLIP76, temos investigado o efeito de inibição RLIP76 ou depleção de células de cancro do pâncreas. Os resultados de avaliação dos níveis de proteína RLIP76 como apresentado na Tabela 1 indicam as quantidades de proteínas totais de membrana em bruto obtidos a partir de 10

8 células no log-fase de crescimento. proteína RLIP76 representado 12 ± 2 ng /10

8 células normais e ~ 40 ± 3 ng /10

8 células de cancro do pâncreas, respectivamente (0,19% e ~0.61% da proteína total solúvel em detergente de membranas de normais e células de cancro do pâncreas, respectivamente). A expressão de RLIP76 em células de cancro do pâncreas estava na gama comparável em relação aos resultados de várias outras linhas de células em nossos estudos anteriores [22], [24], [29].

-se alíquotas de fracções de membrana em bruto de cancro pancreático células (BxPC-3 e Panc-1) e células de controlo normais (HUVEC) contendo 100 ug de proteína foram usadas para SDS-PAGE e Western blotting. Intensidade da proteína RLIP76 de comprimento completo (-95 kDa) da banda foi quantificada por densitometria de varrimento usando Innotech Alpha Imager HP. β-actina foi utilizado como um controlo interno (painel A). Impacto de anti RLIP76-IgG, RLIP76 siRNA e RLIP76 anti-sentido em células normais e de cancro do pâncreas: Efeito de anti-IgG de RLIP76 (40 ug /ml de concentração final) sobre a sobrevivência celular foi determinada pelo ensaio de MTT [29], [30]. Depleção de expressão RLIP76 por RLIP76 siRNA e RLIP76 anti-sentido (cada uma concentração final de 10 ug /ml) foi feita, utilizando Transmessenger Transfecção-Reagente-kit (Qiagen), e Maxfect Transfecção-Reagent (Molecula, Inc.), respectivamente, de acordo com o as instruções do fabricante. A sobrevivência das células foi medido pelo ensaio de citotoxicidade de MTT 48 h após o tratamento. Os valores são apresentados como média ± SD de duas determinações distintas, com oito repetições cada (n = 16), barras pretas, as células HUVEC normais; barras cinzentas, BxPC-3 de células de cancro do pâncreas (painel B) * p 0,05, ** p 0,01 em comparação com os respectivos controlos. Efeito de anti-sentido sobre RLIP76 PI3K e Akt sinalização em células de cancro do pâncreas: RLIP76 anti-sentido provocou a inibição da via PI3K /Akt em BxPC-3 e células Panc-1. As células foram tratadas com 10 ug /ml de anti-sentido RLIP76 durante 24 h e transferidas para imuno-pPI3K, PI3K, pAkt, Akt, Bim, Bcl2, ciclina B1 e CDK4. A mesma membrana foi despida e sondado para GAPDH para garantir um carregamento de proteína igual (painel C). diagrama de barras que mostra a quantificação dos respectivos Western blots. A linha pontilhada representa nenhuma mudança significativa como observado com antisense mexidos (painel D).

inibição RLIP76 ou exaustão causa citotoxicidade em células de câncer de pâncreas

Os efeitos citotóxicos iniciais de RLIP76 inibição em células de cancro pancreático foram avaliadas pela inibição RLIP76 utilizando anticorpos anti-IgG e RLIP76 depleção RLIP76 usando RLIP76 siRNA anti-sentido fosforotioato ou RLIP76 por um ensaio de sobrevivência de células MTT estabelecida [22], [30]. Proteína-A fracção de imunoglobulina purificada por afinidade obtidos a partir do soro pré-imune foi usado como controlo. Anti-IgG de RLIP76 utilizado nestas experiências foi previamente demonstrado por ensaio de imuno-difusão dupla de Ouchterlony para ser não-reactivo com quaisquer outras proteínas incluindo a Pgp ou MRP [31]. As células foram tratadas com IgG pré-imune, mexidos siRNA, mexidos anti-sentido, anti-IgG de RLIP76, RLIP76 siRNA anti-sentido ou RLIP76 durante 24 h. A citotoxicidade de todos os três RLIP76 agentes de direccionamento, RLIP76 siRNA, anticorpo e anti-sentido, foi preferencialmente dirigidos para as células malignas, em comparação com as células não malignas HUVEC, o que foi semelhante para as nossas observações com outras maligna (pulmão, melanoma, renal, da próstata ) e linhas de células não malignas [22], [24], [29], [34]. Em contraste com os resultados anteriores observados com cancros do pulmão ou do cólon (em que todas as três modalidades deu resultados semelhantes), RLIP76 anti-sentido foi significativamente mais eficaz em matar células cancerígenas pancreáticas do que o anticorpo RLIP76 (Fig. 1B). RLIP76 medeia a sobrevivência e proliferação de células cancerosas por vários mecanismos que incluem a desintoxicação reforçada dos produtos de peroxidação de lípidos, bem como a regulação das vias de sinalização intracelular [19], [25], [35]. A eficácia melhorada do RLIP76 anti-sentido foi uma descoberta surpreendente que estimulou investigação mais detalhada de depleção RLIP76 na regulação dos níveis de proteínas intracelulares críticos nas células de cancro do pâncreas.

RLIP76 anti-sentido para baixo-regula PI3K /Akt em células de cancro do pâncreas

BxPC-3 e Panc-1 as células foram tratadas com anti-sentido RLIP76 durante 24 h seguida por análises de Western blot para estudar o impacto sobre as proteínas intracelulares críticos (Figs. 1C e D). PI3K /Akt constitutivamente activada na maioria dos tumores pancreáticos [11]. RLIP76 tratamento anti-sentido suprimiu significativamente a fosforilação de PI3K, um nó a montante do sinal de sinalização comum, que tranduces sinais mitogénicos consequente para receptores de membrana celular como factores de crescimento e integrinas. RLIP76 tratamento anti-sentido também reduziu significativamente os níveis de proteínas e a fosforilação da Akt em ambas as células BxPC-3 e Panc-1. Curiosamente, a fosforilação de Akt e PI3K não foi detectada em células HUVEC normais (dados não mostrados), o que é consistente com o entendimento geral de que a PI3K ou Akt são activados nas células transformadas [36]. A PI3K e Akt representar nós significativas de relê de sinal, que por sua vez regulam os alvos a jusante críticos que estão envolvidos na apoptose, proliferação e a manutenção do fenótipo de cancros. A activação de Akt conduz a repressão da expressão de E-caderina [37]. E-caderina é considerado um marcador de fenótipo epitelial normal e perda de E-caderina está associada a “transição epitelial mesenquimal (EMT)” e um fenótipo agressivo em cancros [38]. A activação de PI3K conduz a uma maior activação de mTOR, que suprime a expressão de pró-apoptótica Bim e favorece a sobrevivência e proliferação de células cancerosas [39]. O aumento dos níveis de anti-apoptótico Bcl-2 e ciclina dependente da cinase 4 (CDK4) foram mostrados para mediar a resistência à inibição de mTOR [40]. Depleção de RLIP76 por anti-sentido aumentou significativamente os níveis de pró-diferenciação marcador de E-caderina e proteína pro-apoptótica Bim, enquanto diminui os níveis de proteína anti-apoptótica Bcl-2, ciclina B1 e CDK4 em ambos BxPC3 e Panc-1, células de cancro do pâncreas. Assim, o esgotamento dos RLIP76 teve um impacto significativo sobre mediadores críticos do eixo de sinalização PI3K /Akt em câncer de pâncreas (Fig. 1C e D).

Efeito da depleção RLIP76 na sobrevivência clonogênica e apoptose

Nós confirmamos ainda mais o impacto do esgotamento RLIP76 na sobrevivência potencial e de proliferação celular, avaliando o potencial clonogênica e apoptose em células pancreáticas BxPC3. RLIP76 tratamento anti-sentido provocou depleção RLIP76 como detectado por Western blot (Fig. 2A) e inibiram o potencial clonogénico como determinado pelo ensaio de formação de colónias (Fig. 2B). O impacto de RLIP76 sobre a apoptose foi avaliada pelo ensaio de TUNEL. Os resultados do ensaio de TUNEL demonstrou não detectável a apoptose com anti-sentido anti-sentido mexidos enquanto RLIP76 causou apoptose nas BxPC-3 de células de cancro do pâncreas. Quantificação de fluorescência vermelha e verde por análise de imagem -J confirmou as conclusões fluorescentes qualitativas que o esgotamento RLIP76 por antisense foi eficaz na indução de apoptose (Fig. 2C).

O esgotamento dos RLIP76 por RLIP76 antisense usando análises de Western blot, pista 1 continha padrão, as pistas 2 e 3, contida fracção de membrana em bruto de cancro pancreático (BxPC-3), as células 24 h após o tratamento de RLIP76 anti-sentido e anti-sentido mexidos, respectivamente. Os resultados foram quantificados por densitometria usando Innotech Alpha Imager HP. β-actina foi utilizado como um controlo interno (painel A). eficiência em células BxPC-3 após o tratamento de antisense formadoras de colónias-, foi realizada por coloração das células com azul de metileno e as colónias foram contadas utilizando Innotech Alpha Imager HP. Os valores são médias ± S.D. de três experiências separadas. *** P 0,005 comparado com a ausência de tratamento anti-sentido ou mexidos (painel B). Apoptose em células BxPC-3 por RLIP76 antisense pelo ensaio de TUNEL, mexidos antisense (painel superior) e RLIP76 antisense (painel inferior) células tratadas. células em apoptose mostraram fluorescência verde e característicos de encolhimento celular. O diagrama de barras ao lado mostra analisa Imagem J de ensaio TUNEL representando percentual de TUNEL células apoptóticas positivas (verde) e células vivas normais (vermelho). * P . 0,05 (painel C)

esgotamento RLIP76 provoca regressão de xenoenxertos de cancro do pâncreas em ratos nus

in vitro

observações acima refletindo o anti- efeitos neoplásicas de esgotamento RLIP76 foram investigados

in vivo

ratos modelo de xenoenxerto de câncer pancreático. animais portadores de tumor com o estabelecido

s.c

. Os tumores de células de pâncreas BxPC3 implantados (~42 mm

2) foram tratados com 200 mg de qualquer um dos anticorpos RLIP76, RLIP76 siRNA ou RLIP76 antisense pelo

i.p.

injeção. O ganho de peso era comparável com os controlos não tendo-tumorais, e não manifesta-toxicidade foi evidente. O tratamento com anticorpo RLIP76, RLIP76 siRNA anti-sentido ou RLIP76 resultou em reduções rápidas e dramáticas em tumores (Fig. 3A e B). O anticorpo RLIP76, RLIP76 siRNA anti-sentido ou RLIP76 tratados animais portadores s.c. estabelecidos tumores estavam vivos para ~298 dias sem qualquer evidência de recorrência. Houve crescimento descontrolado em todos os grupos de controlo tratados com soro pré-imune, siRNA mexidos e antisense mexidos e, portanto, os grupos de controlo foram censurados por ~49 dias (Fig. 4). A eficácia de redução do tumor foi evidente volumes de tumor pesos no dia 47 após o início do tratamento (Fig. 3B). A eficácia da RLIP76 antisense em esgotando tumor RLIP76

in vivo

é demonstrado no Western blot para RLIP76 a partir de homogenatos tumorais (Fig. 3B, inserir). Seguindo o esgotamento RLIP76 e inibição, regressão de implantes tumorais foram vistos em todos os animais, sem quaisquer efeitos tóxicos evidentes, ou efeitos sobre o ganho de peso

Para estudos de xenoenxertos, foram utilizados trinta e seis 11 semanas de idade Hsd.: nu /ratinhos nu atímicos (Harlan, Indianapolis, IN) aleatoriamente seleccionados 6 animais de cada um em seis grupos como se segue: 1) de soro pré-imune, 2) mexidos siRNA, 3) mexidos ADN anti-sentido, 4) anticorpos RLIP76, 5) RLIP76 siRNA e 6) anti-sentido RLIP76. Todos os 36 animais foram injectados com 2 × 10

6 células humanas do cancro do pâncreas (BxPC-3) As suspensões em 100 uL de PBS, por via subcutânea em um flanco de cada nu /nu ratinho nu. Os animais foram examinados diariamente quanto a sinais de crescimento do tumor e os pesos corporais. Quando os tumores atingiram uma área de secção transversal de ~42 mm

2 (47 dias mais tarde), os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento como indicado na Figura 4. O tratamento consistiu em 200 ng de anticorpos RLIP76, siRNA anti-sentido ou em 100 uL PBS. Os grupos de controlo foram tratados com 200 ug /100 ul de soro pré-imune, siRNA ou ADN anti-sentido mexidos mexidos. Os tumores foram medidos em duas dimensões utilizando pinças. As medições do tumor são apresentados com todos os grupos de controlo (IgG pré-imune, mexidos ou siRNA anti-sentido) contra todos os grupos tratados (-RLIP76 anti IgG, RLIP76 siRNA, ou anti-sentido) (painel A). Tumor-peso é reduzido no dia 47 após o início de tratamento (painel B) e RLIP76 tumor é esgotado por anti-sentido (painel B, inserção). Os tumores foram excisados ​​48 h depois de anti-sentido para o tratamento, pesados ​​e homogeneizados, e aliquotas contendo 100 ug de proteína de cada, foram carregadas para SDS-PAGE de Western blotting contra IgG anti-RLIP76 (n = 3; pistas 1-3, anti-sentido mexidos tratados, e as pistas 4-6, RLIP76 anti-sentido-tratado). Os resultados foram quantificados por densitometria. Membrana foi despida e re-sondadas com anticorpo β-actina para verificar a carga de proteína igual, * p 0,05 em comparação com os respectivos controlos. A análise Western blot dos lisados ​​de tecido de tumor: base mecanicista para a inibição do crescimento do tumor por RLIP76-anti-sentido foi determinada nos lisados ​​de tumor de controlo e RLIP76-ratinhos tratados anti-sentido. Os tecidos tumorais foram homogeneizados, e ~ 70 ug de proteína foi resolvida em SDS-PAGE e sondadas para pPI3K, PI3K, pAkt, Akt, PCNA, Bim, E-caderina, ciclina B1 e CDK4. As manchas foram retirados e sondado para GAPDH para garantir um carregamento de proteína igual (painel C). diagrama de barras representa análises de densitometria. A linha pontilhada representa nenhuma mudança significativa como observado com antisense mexidos (painel D)

Hsd:. camundongos nu atímicos /nu foram obtidos de Harlan, Indianapolis, IN. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC).