Abstract
Tumorigênese é acompanhada por mudanças no padrão de metilação do DNA. O nosso objectivo foi testar uma nova abordagem para a identificação dos transcritos a nível transcrição todo, que são regulados por metilação do DNA. A nossa abordagem é baseada na comparação dos dados obtidos a partir de perfis transcriptoma de amostras humanas primárias e em modelos de cultura celular in vitro. As células epiteliais foram recolhidos por LCM do normal, adenoma, e as amostras do cólon tumorais. Utilizando a análise de expressão de genes, foram identificados genes regulados negativamente nos tumores em comparação com tecidos normais. Em paralelo 3000 genes regulados positivamente foram determinados em HT-29 de cólon modelo de cultura de células de adenocarcinoma após o tratamento desmetilação de ADN. Dos 2533 transcritos mostrando uma expressão reduzida nas amostras tumorais, 154 tinha uma expressão aumentada como um resultado do tratamento desmetilação de ADN. Cerca de dois terços destes genes tinham diminuído de expressão que já nas amostras de adenoma. Expressão de cinco genes (
GCG
,
NMES-1 |,
LRMP
,
FAM161B
e
PTGDR
), foi validado utilizando RT-PCR.
PTGDR
mostraram resultados ambíguos, por isso, foi ainda estudado para se verificar a extensão da metilação de ADN e o seu efeito sobre o nível de proteína. Os resultados confirmaram que a nossa abordagem é adequado para triagem de todo o genoma dos genes que são regulados ou inativadas por metilação do DNA. Atividade desses genes possivelmente interfere na progressão tumoral, portanto genes identificados podem ser fatores-chave na formação e na progressão da doença
Citation:. Spisak S, Kalmar A, Galamb O, Wichmann B, Sipos F , Péterfia B, et al. (2012) Screening Genome-Wide de genes regulados pelo DNA metilação no desenvolvimento do cancro do cólon. PLoS ONE 7 (10): e46215. doi: 10.1371 /journal.pone.0046215
editor: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, Estados Unidos da América
Recebido: 18 Abril de 2012; Aceite: 28 de agosto de 2012; Publicado: 1 de outubro, 2012 |
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa e Tecnologia, Hungria (TECH_08-A1 /2-2008- 0114 subvenção), por o Gabinete húngaro Nacional de Inovação, e pela Fundação Nacional de Investigação dinamarquês. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Alterações de expressão gênica, incluindo a ativação de oncogenes e inativação de supressores de tumor, são responsáveis pela formação e desenvolvimento de cancro colorectal (CRC) [1], [2]. Para além das alterações acumulando-se na sequência de ADN, a disfunção do sistema de regulação epigenética pode também levar à formação aberrante do epitélio do cólon ao longo do processo progressivo de carcinogénese [3], [4]. No entanto, não é claro quais os eventos moleculares afectar as actividades de genes individuais e se é uma ligação directa ou um efeito indirecto [5], [6], [7].
Um dos processos epigenética que influenciam a expressão do gene é a metilação do DNA, uma modificação pós-replicativo de ADN que ocorre predominantemente em regiões do genoma rico em dinucleótidos CG, assim chamadas ilhas CpG [8]. Modificação de bases por adição de um grupo metilo fisicamente pode inibir a ligação de factores de transcrição, e também permite o recrutamento de proteínas de domínio metil-CpG de ligação (por ex .: MDB1-3, MeCP2) às regiões promotoras, que pode reprimir a iniciação da transcrição [ ,,,0],9]. alterações aberrante do padrão de metilação específico do tecido são frequentemente manifestada de duas maneiras: (i) hipometilação global, que ocorre em todo o genoma, com o envelhecimento, e (ii) hipermetilação local do 5 ‘regiões reguladoras na tumorigénese, o que geralmente leva à diminuição ou cessado a actividade de transcrição dos genes afetados [10], [11], [12]. Hipermetilação mediada por alterações na regulação dos genes desempenham um papel chave durante o desenvolvimento de diversos tipos de tumor, incluindo cancro colo-rectal, e também mostram um padrão específico de tumores [13].
É bem conhecido, que a metilação de ADN afecta actividades de genes sem alterar a própria sequência de ADN, e pode ser revertido por agentes que actuam através da inibição de metilação de ADN, tais como 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza) desmetilação. Isto dá uma possibilidade teórica para desacelerar ou deter o desenvolvimento do tumor para, em caso de detecção precoce. No entanto, para uma melhor compreensão dos processos de metilação do DNA, e para a possibilidade de utilização de biomarcadores de metilação específico do cancro colo-rectal para o rastreio de pacientes, ou mesmo a alcançar a desmetilação do gene alvo-no futuro, os genes afectados precisam de ser identificados. Embora vários genes regulados por metilação têm sido relatados para ser associada com o cancro (incluindo cancro colorectal) desenvolvimento, um processo detalhado ainda permanece incerto [14], [15], [16], [17], [18], [19] .
Embora muitas estratégias estão disponíveis para avaliar a metilação do DNA em todo o nível do genoma, incluindo sequenciamento [20], [21] e sistemas de matriz [22], [23], estas abordagens podem ser suficiente apenas no caso de tecidos ou culturas de células, a partir do qual podem ser obtidas relativamente grande quantidade de material (ADN genómico) de partida, tipos de células diferentes como padrões de metilação têm distintas [24], [25], [26]. microdissecção de captura Laser (LCM) pode servir como um método de separação de células adequada [27]. No entanto, a quantidade limitada dos resultados da amostra coleccionáveis em uma desvantagem desafiadora no caso dos estudos de metilação, porque as técnicas de amplificação in vitro actualmente disponíveis pode não conservar o padrão de metilação. Em contraste, a expressão do gene podem ser analisados rotineiramente em células de laser microdissectados, que podem ser combinadas com a análise de microarray para reunir informações mesmo a partir de uma única célula em todo o nível do genoma.
Neste artigo apresentamos uma expressão gênica baseada abordagem que é adequado para de alto rendimento, um rastreio eficiente, todo o genoma para genes regulados por metilação, cuja expressão reduzida pode ser relacionado com a progressão do cancro. O potencial deste método foi demonstrado anteriormente, identificando 17 transcrições que foram reprimidos durante a progressão do cancro colo-rectal, e mostraram um aumento da actividade em células HT-29 após cancro colo-rectal 5-Aza tratamento [28]. Estendendo o estudo anterior, aqui nós relatamos 154 genes, que são provavelmente inibidas por metilação durante a progressão do cancro colo-rectal. A fiabilidade do método é apoiado por uma ampla gama de experimental e
in silico
métodos apresentados neste trabalho. A expressão de vários transcritos foi validado por RT-PCR. Nós revelamos a relação entre a expressão do gene e estado de metilação no caso do
PTGDR
gene por análise de RT-PCR, imuno-histoquímica, seqüenciamento bissulfito, e análise de HRM. Em PCA analisa normal, adenoma, e as amostras de CRC pode ser separado com êxito com base nos padrões desses 154 transcrições de expressão, tanto no nosso próprio conjunto de amostras e em conjuntos de amostras independentes obtidos a partir do banco de dados do GEO.
Resultados
Microarrays de amostras e tecido LCM HT-29 células
hipermetilação de várias regiões genômicas foram previamente comprovada a ser associada com a transformação oncogénica. Porque metilação da ilha (s) de CpG da região promotora de um gene pode reduzir a transcrição do gene, que procurou por genes com a diminuição da expressão em amostras de tumores de cólon humano em comparação com os tecidos epiteliais do cólon normais. mudanças de expressão em amostras de tumor podem resultar de eventos moleculares diferentes, incluindo os efeitos directos e indirectos de mutações [29], [30], [31]. No entanto, as alterações no padrão de expressão observado num modelo de cultura de células desmetilado pode prever que os genes são regulados por metilação de ADN (Figura 1). a expressão do gene em amostras de tecido foi estudada por microarrays HGU133 Plus2.0, e os dados obtidos foram analisados pelo (análise da significância dos microarrays) SAM algoritmo. Cerca de 2000 transcritos, pertencentes a cerca de 2500 conjuntos de sondas, foram identificados que tinha expressão diminuída nas amostras de tumor (Tabela S1).
genes que estão inactivados pela hipermetilação pode ser reactivados pela remoção do metil grupos a partir das ilhas de CpG das suas regiões promotoras, que podem ser obtidos pelo crescimento das células na presença da DNA metiltransferase inibidor de 5-aza-2′-desoxicitidina. os níveis de expressão de genes em 5-Aza-tratadas e não-tratadas células de adenocarcinoma do cólon HT-29 foram comparados. Porque o tratamento com 5-Aza provoca a inibição dependente da dose da proliferação de células [32], [33], [34], ensaios MTT foram utilizados para optimizar a concentração de tratamento. Com base nos resultados de 10 uM 5-Aza foi aplicado no tratamento desmetilação de células HT-29. Porque o tratamento com 5-Aza não pode reativar genes completamente, foram considerados os 3000 melhores conjuntos de sondas que têm o mais alto log
valores 2FC ao nível de significância de p 0,025 a ser potencialmente regulada. Entre os transcritos de cerca de 2000 que mostraram transcrição reduzida nos tumores do cólon, 154 genes foram encontrados que mostraram maior expressão nas 5-aza-tratados células HT-29, utilizando os critérios acima referidos. Com base na análise de microarray estes são genes candidatos que são susceptíveis silenciados em tumores colorrectais por hipermetilação do ADN, quer directa ou indirectamente (Tabela S2). Curiosamente, 108 dos 154 transcrições tinha diminuído significativamente os níveis já nas amostras de adenoma (Figura S1) (Tabela S3). previsão região promotora foi realizada utilizando as ferramentas Plot EMBOSS CpG. Com base nos resultados de previsão e de análises de dados de microarray pública independente, foram seleccionados 6 transcritos para análise posterior. Essas transcrições pertencem ao
GCG
(glucagon),
NMES-1 | (mucosa normal específica esôfago 1, também chamado
C15orf48
),
LRMP
(proteína da membrana de restrição linfóide),
FAM161B
(família com semelhança de sequência 161, membro do B), e
PTGDR
(receptores de prostaglandina D2) genes, que também apresentaram expressão diferencial em nossa estudo piloto anterior [35], mas não têm sido associados a CRC antes, e
CDKN2B
, um gene supressor de tumores conhecido. A Figura 2 representa os padrões de este conjunto de 6 genes em nossos conjuntos de dados LCM de expressão. O mapa de calor mostra relativamente elevado de expressão do gene definido em tecidos normais, o que diminui durante a carcinogénese.
A expressão do gene supressor de tumores
CDKN2B
é mostrado para comparação. Sonda códigos de identificação e os nomes de genes estão indicadas à direita. As seis colunas indicam os resultados de microarray obtidos a partir de seis amostras individuais para cada tipo de tecidos. quadrados pretos indicam que a expressão do gene foi inalterada em que experimento. O grau de intensidade do vermelho ou verde indica que o nível de expressão do gene de alta ou baixa, respectivamente.
RT-PCR de validação Ensaios
microarray análises de transcrição de todos estes genes foi inibida nas amostras tumorais, mas mostraram diferentes graus de heterogeneidade nas amostras adenoma (Figura 2). Além disso, esses genes foram reactivadas com intensidades diferentes, como resultado do tratamento com 5-Aza em células HT-29. Na análise GCG microarray, EENM-1, e LRMP transcritos mostraram respostas fortes ( aumento de 2,5 vezes), enquanto FAM161B e PTGDR ARNm mostraram respostas mais fracas ( aumento de 1,5 vezes). Expressão de
CDKN2B
, como um gene supressor de tumor de metilação regulado bem conhecido, foi validada por RT-PCR antes [36]. Além disso, a expressão de cinco genes selecionados,
GCG
,
NMES-1 |,
LRMP
,
FAM161B
, e
PTGDR
, também foi testado no cólon do laser microdissecados independente e também em células HT-29 desmetilados por PCR em tempo real. As sequências iniciadoras de PCR aplicadas são apresentadas na Tabela S4.
5-Aza tratada células HT-29.
Para estudar o efeito de desmetilação, células HT-29 foram tratadas com 10? M 5- aza e a nível do grupo de gene seleccionado expressão foi examinada em comparação com as amostras de controlo tratados com acetato de etilo (solvente de 5-aza) (Figura 3). Após a desmetilação,
GCG
,
NMES-1
, e
LRMP
genes mostraram aumento da expressão, enquanto a transcrição da
gene FAM161B
não se alterou significativamente . Resultados semelhantes foram obtidos com um tratamento de 20 uM 5-Aza (dados não mostrados).
A análise dos dados foi realizada com o método Cp comparativo (ver Materiais e Métodos). Os genes foram considerados como estando regulada negativamente com valores inferiores a 0,5 (50% de decréscimo, linha a ponteado horizontal), e regulada positivamente com valores maiores do que 2 (aumento de duas vezes). GAPDH foi usada como um gene de controlo de arrumação. Cinza claro e escuro colunas cinzentas mostram os níveis de expressão de genes no adenoma e em amostras tumorais em relação a amostras normais, respectivamente. colunas tracejadas indicam a comparação de 5-aza tratadas e as células de controlo. desvios-padrão dos níveis de transcritos medidos foram calculados e são indicados para cada transcrição. intensidades gene de manutenção foram calculados para cada grupo.
amostras de tecido LCM.
Os resultados de RT-PCR foram comparados no cólon normal de mucosa-adenoma e cólon relações normais mucosa-tumorais em amostras de tecidos individuais. Destes, cinco amostras de adenoma e quatro de cinco tumorais epiteliais normais foram independentes dos que são utilizados na análise de microarray. Os resultados mostraram boa concordância com a análise microarray,
GCG
,
NMES-1
, e
FAM161B
genes foram reprimidos tanto no adenoma e as amostras de tumores, enquanto que
LRMP
mostraram redução da expressão somente nas amostras de tumor (Figura 3).
PTGDR
expressão mostraram resultados ambíguos para as experiências de RT-PCR. Não mostrou uma resposta forte para o tratamento de 10 uM 5-Aza, mas tinha cerca de 1,7 vezes maior expressão quando as células foram tratadas com 20? M de 5-aza. Além disso, os níveis de ARN PTGDR mostraram heterogeneidade nas amostras de tecido (Figura 4A), que, por conseguinte, realizada análises suplementares para revelar o fundo destas observações. valores de expressão para a sonda 215894_at PTGDR definir foram testados em conjuntos GEO independentes (Figura 4 B, C). Nestes conjuntos de amostras independentes, diminuição dos níveis de ARNm PTGDR já foram encontrados nas amostras de adenoma, que diminuiu ainda mais em amostras de CRC.
-PCR em tempo real e análise de dados foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Os genes foram considerados como estando regulada negativamente com valores inferiores a 0,5 (50% de decréscimo, linha a ponteado horizontal) (A) Expressão de distribuição valor do conjunto de sondas 215894_at (para
PTGDR
gene) no GSE8671 (B) e GSE18105 ( C) conjuntos de dados GEO. Os valores de P: Normal vs. Adenoma P = 0.000712; CRC vs. normal P = 0.0003797; LCM CRC vs. normal P = 0.0000004; LCM CRC vs. CRC P = 0,834.
PCR e HRM (High fusão resolução) Análise
Bissulfito específicas do
Para verificar se a região reguladora da
PTGDR
é de fato hipermetilado, foi realizada a análise específica do bissulfito de fusão PCR e de alta resolução sobre DNA genômico [37]. A série de diluições padrão foram utilizados para testar a sensibilidade dos nossos ensaios de GRH. De acordo com as curvas de fusão normalizados, o nosso ensaio era capaz de detectar a 2% do ADN metilado em 98% fundo não metilado. A percentagem de metilação de amostras de tecido foi estimado de acordo com as suas curvas de fusão normalizados em relação à série de diluições padrão. Todas as amostras normais de cólon mucosa curva de fusão normalizada caiu entre as áreas delimitadas pelos 0% -2% das amostras padrão. No caso de as amostras de tumor, 1 espécime estava na gama de metilação 0% -2%, 2 entre 2-25% e duas amostras mostraram metilação rácio mais elevado do que 25% (Figura 5). Análise da
PTGDR e região selecionada da linha de células HT29 mostrou que quase 100% de metilação. Para a validação, bissulfito sequenciação foi realizada para determinar o estado de metilação da região. (Figura S2.)
linhas tracejadas representam a série de diluições de padrão de ADN metilado artificialmente (0%, 25%, 50%, 75% e 100%). A linha preta a cheio representa os resultados obtidos a partir de uma amostra normal. linhas cinzas sólidas representam os resultados obtidos a partir de 5 amostras de tecidos tumorais independentes. A análise GRH pode distinguir metilação dos tecidos normais e tumorais com base na diferente conteúdo G: C na sequência promotora convertido pelo bissulfito. As regiões do promotor contendo citosinas metiladas mais, que não podem ser convertidos em uracilo por tratamento com bissulfito, tem temperaturas de fusão mais elevados. A temperatura de fusão é proporcional à razão entre as citosinas não convertidos.
Tissue Microarray Analysis, PTGDR Imunohistoquímica
O receptor de prostaglandina D2 foi ainda estudada por imuno-histoquímica utilizando TMA desliza para determinar a efeito da metilação do DNA no nível da proteína. amostras da mucosa do cólon normais mostraram forte imunomarcação citoplasmática epitelial, que diminuiu sequencialmente na fase de adenoma perto da superfície luminal. A intensidade da imunocoloração foi ainda mais reduzida durante a progressão e só expressão moderada poderia ser observada em amostras de tumor (Figura 6 painel esquerdo). Embora em algumas amostras tumorais adenoma e a expressão da proteína foi encontrado para ser semelhante ao que foi detectado no epitélio normal (figura S3). Uma diminuição PTGDR tendencioso expressão da proteína foi observada na progressão sequência adenoma-carcinoma (Figura 6 painel da direita).
Nas amostras normais (acima), coloração citoplasmática difusa predominantemente forte foi detectada, o que diminuiu moderadamente na amostras de adenoma (meio) e um fraco nível de coloração citoplasmática foi observada nas amostras de câncer colorretal (em baixo). O painel da direita mostra as parcelas de associação que representam tendenciosamente diminuindo a expressão da proteína PTGDR ao longo da sequência carcinoma adenoma. Para medir a associação de duas variáveis (expressão e estágio da doença), foi utilizado o teste do qui-quadrado. A altura (e profundidade de cor) das caixas é proporcional à diferença entre a frequência observada e esperada de pontuação. As caixas coloridas vermelhas para baixo indicam que a frequência observada é menor do que o esperado. Os itens, azuis para cima representam o oposto. pontuações imunocoloração PTGDR:
– Página 2 = nenhuma coloração; 0 = coloração fraca; 1 = coloração moderada; 2 = forte imunomarcação citoplasmática epitelial difusa.
Genes Teste de metilação regulamentado em conjuntos de amostras /expressão Independentes por PCA
Para testar o poder discriminatório dos 154 genes selecionados, que são susceptíveis regulada por metilação durante a carcinogênese, nós testamos-los em dois conjuntos de amostras independentes da Expressão gênica Omnibus (GEO) arquivo de microarray público. Um dos conjuntos de amostras, GSE8671 [38], contém normal e adenoma, e o outro, GSE18105 [39] amostras, normais e tumorais. O último conjunto de amostras é especialmente adequado para validação, uma vez que contém ambas as amostras tumorais homogeneizados e LCM. Atividades de todos os 154 genes em nossa lista foram comparadas usando um método de redução de dimensão standard, análise de componentes principais (PCA) [40] que transforma o log multivariada
dados de 2 expressão em 2 dimensões. APC selecciona as direcções com a maior variância seguida gira e projecta os dados para este espaço. Calculou-se a matriz de transformação utilizando a 6 normal e 6 amostras de LCM de CRC (as amostras adenoma não foram usados durante o cálculo da matriz de transformação) e utilizada a matriz de transformação resultou projectar todas as amostras no espaço gerado pelos primeiros 2 componentes principais . Os dois primeiros componentes contém 81% da variância total cumulativo; portanto, pode-se esperar que eles representam fielmente a distribuição multivariada. A Figura 7A mostra que as amostras normais e LCM CRC são claramente separadas, e quando as amostras adenoma são projectadas para dentro do espaço APC, que estão localizados entre as amostras normais e de CRC, suportando a hipótese de que o adenoma é um estado de transição entre o normal eo fases CRC [2], [41]. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando apenas os seis genes listados na Figura 2 (dados não mostrados). O poder discriminatório dos 154 genes selecionados foi ainda validado utilizando conjuntos de dados previamente publicados. A projeção APC, que foi calculado utilizando apenas o nosso CRC LCM e amostras normais também pode separar completamente os subconjuntos normais e adenoma do estudo GSE8671 (veja a Figura 7C). Por outro conjunto de dados GEO, GSE18105, a separação é quase perfeito para amostras tanto o homogeneizado CRC e LCM CRC, apenas um ponto, marcado com uma seta na Figura 7B é erroneamente classificada. Para encontrar a razão da análise de erros de classificação distância euclidiana foi realizada em que esta amostra particular foi provado ser um outlier (Figura Suplementar S4).
Os principais componentes foram calculados a partir do registo de valores de
2-expressão os 154 conjuntos de sondas seleccionadas para as amostras-CRC normais no nosso conjunto LCM, e depois todos os 3 conjuntos foram projetados para o componente principal espaço de coordenadas. Note-se que este método pode ser considerado como uma classificação não-supervisionada, uma vez que não usar explicitamente as categorias no processo de análise de dados. Figura 7.A mostra que a transformação PC separa muito bem as amostras normais e LCM CRC e coloca as amostras adenoma entre amostras normais e CRC. Para validar nossa lista de genes marcadores potenciais, transformamos os dados de outros dois estudos independentes sobre as mesmas coordenadas de PC. Os dois estudos do Gene Expression Omnibus arquivo de microarray foram GSE18105 com, amostras normais CRC e LCM CRC e GSE8671 com amostras normais e adenoma. Para ambos os conjuntos a separação das categorias é bom, exceto para um ponto outlier no B marcado com uma seta (ver discussão no texto).
Discussão
Neste estudo apresentamos um romance rastreio de alto rendimento para a selecção de um grupo de genes, cuja expressão alterada do gene, devido ao padrão de metilação de ADN aberrante pode estar relacionada com o cancro. Atividade de tais genes podem inibir a progressão do câncer, portanto, a sua identificação poderia melhorar a determinação do prognóstico.
Em um trabalho anterior, desenvolvemos um sistema experimental para a identificação de genes de metilação regulada com base no exame dos níveis de expressão de genes em amostras de LCM clínicos e em 5-aza tratada células HT-29. 110 transcritos mostrou diminuição da expressão no desenvolvimento do tumor e foram identificados transcritos 71 regulada positivamente e um resultado do tratamento com 5-aza. 17 transcrições pertencia a ambos os grupos, e foram assumidos estas transcrições a ser regulado por metilação do DNA [28].
No presente trabalho foi utilizada uma estratégia de análise muito mais ampla, resultando na identificação de 2533 subregulado transcrições durante o desenvolvimento do tumor , 3000 e transcritos upregulated como um resultado de tratamento com 5-aza de células HT-29 (Figura 1). A metilação relacionadas 154 transcritos estavam presentes em ambos os grupos, isto é, tinha diminuído de expressão em tumores em comparação com células normais de cólon mucosa e mostraram um aumento da actividade após o tratamento desmetilação de células HT-29 do cancro do cólon. Por conseguinte, estes transcritos são provavelmente inibido por metilação, directa ou indirectamente, durante a progressão do cancro colo-rectal. A validade desta lista é apoiado por (i) a presença de muitos genes que foram encontrados anteriormente a ser reprimidos no cancro colo-rectal (por exemplo,
CHGA
,
FCGBP
,
GSN
,
LPP
,
MYH11
,
PLCG2
,
SST
,
NBL1
) [42], [43], (ii) a presença de vários genes conhecidos supressores de tumor (por exemplo,
CDKN2B
,
MTUS1
,
RASSF6
,
PDCD4
,
KLF5
,
CDS1
), e (III) com os resultados de análises de componentes principais realizadas em conjuntos de dados anteriormente publicados. Existem vários factores genéticos e ambientais que podem contribuir para a diminuição da expressão de genes em células tumorais. Nós estávamos interessados em genes que podem ser silenciados por metilação do DNA. Estudos anteriores mostraram que muitos genes são inactivados em linhas celulares de cancro colorrectal, no entanto, existem grandes variações entre as diferentes linhas de células [16], [17], sugerindo que nem todos os genes inactivados estão relacionados com tumorigénese. De acordo com a nossa hipótese, a actividade de vários genes identificados pela nossa abordagem pode interferir com a progressão do tumor. Esta hipótese é suportada pela presença do 2B inibidor de quinase dependente de ciclina (
CDKN2B
) e 2C (
CDKN2C
) genes supressores de tumor no conjunto de genes identificados. O gene de
CDKN2B
está localizado no cromossoma 9p21, um lugar geométrico no qual deleções ocorrem frequentemente em muitos tumores humanos primários, incluindo o carcinoma esofágico [44] e do cancro colo-rectal [45].
CDKN2B
, que foi regulada negativamente em nossas amostras tumorais adenoma colorrectal e também é silenciado por metilação do DNA em uma variedade de doenças malignas hematológicas [46].
CDKN2C
foi previamente relatado para ser inactivado por hipermetilação do promotor em células de Reed-Sternberg em Hodgkin, ea perda de CDKN2C mostrou correlação negativa com a sobrevida global dos pacientes [47]. O ácido retinóico receptor respondedor 1 (
RARRES1
) também é um gene supressor de tumor. A sua expressão é frequentemente regulados negativamente através de hipermetilação do ADN em vários tipos de tecidos malignos. Regulação negativa do
RARRES1
foi sugerido para ser relacionado para o estágio de progressão D do cancro colorectal [48]. Subexpressão de vários outros genes, identificados pela nossa abordagem, foi previamente descrito estar associado a cancro do cólon. Por exemplo, a proteína de ligação a metil-CpG de domínio, MBD4, que está envolvida na reparação de emparelhamentos incorrectos nos locais de CpG, é afectada por mutações frameshift em mais de 40% dos cancros do cólon microssatélites instável esporádicos [49]. O receptor de imunoglobulina polimérica humana (plgR) foi encontrado para ser underexpressed em tumores do cólon, e também em linhas de células de tumor do cólon [50]. Semelhante aos nossos resultados, o gene Ephrin-A5 (
EFNA5
) também foi relatada antes como um gene reprimidos no câncer de cólon [51]. A expressão do factor de transcrição POU classe de domínio 2 3 (POU2F3) foi diminuída no adenoma e do epitélio do cólon tumoral. ilhas CpG no
POU2F3
região reguladora são muitas vezes aberrante metilado no cancro do colo do útero [52].
Para avaliar a precisão da nossa abordagem, medimos a expressão de cinco genes por RT-PCR em amostras de tecido independentes. Estes genes foram também identificados no nosso estudo piloto anterior, mas elas não têm sido associados a CRC antes. No caso de dois genes,
GCG
e
NMES-1
, uma diminuição notável foi encontrada na expressão do gene já em fase de adenoma. Ambos os genes apresentou uma reactivação forte como resultado de um tratamento de desmetilação de células HT-29, sugerindo que estes genes são inactivados por hipermetilação do promotor. O
NMES-1 gene
(igualmente nomeado como
C15orf48
) é expressa ao longo do trato gastrointestinal saudável e é frequentemente reprimidos em carcinomas de células escamosas do esôfago [53]. metilação aberrante do
NMES-1 região
promotor também foi detectado em invasivo do câncer cervical (ICC), mas não em amostras cervicais normais [54]. A proteína codificada pelo gene do glucagon (GCG) é um preproproteína que é clivada em quatro péptidos maduros distintas. Estes péptidos estão envolvidos na manutenção da homeostase de nutrientes, e são reguladores da proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [55].
FAM161B
é um gene previsto, cuja contribuição para a carcinogênese ainda não foi relatado. Foi underexpressed em ambas as fases em nossas experiências, no entanto, não revelam uma activação notável como um resultado de tratamento com 5-Aza.
O receptor de prostaglandina D2 (
PTGDR
) gene está localizado no agrupamento de receptor de prostaglandina. Em estudos anteriores, o estado de metilação de
PTGDR
foi encontrado para ser correlacionado inversamente com a sua expressão em linhas celulares de neuroblastoma [56]. Os nossos resultados de microarray sugerido que o nível de ARNm PTGDR diminui ao longo da sequência adenoma-carcinoma em média. No entanto, a análise do nível de ARNm PTGDR por o nível de proteína PTGDR por imuno-histoquímica em amostras de tecido individuais por RT-PCR e mostraram heterogeneidade. Resultados semelhantes foram obtidos através da análise dos GSE8671 GSE18105 e de expressão de genes conjuntos de dados anteriormente publicados (Figura 4). Os ensaios de GRH detectado diferentes níveis de metilação de CpG na região promotora do PTGDR em amostras de cancro de cólon individuais. Estas observações sugerem que o
gene PTGDR
é silenciada pela hipermetilação DNA durante o desenvolvimento de certos tumores colorretais. No entanto, ele precisa de mais investigações se PTGDR silenciamento mostra uma correlação com o prognóstico da doença.
Os dados microarray juntamente com os resultados de validação sugerem que a metilação do DNA inativa parcialmente determinados genes já na fase de adenoma cedo. Esta observação pode ser importante para o futuro, porque após a detecção precoce de cancro colorrectal, terapias específicas para o gene ou métodos de activação de genes-alvo podem ter importância relevante. Curiosamente, os genes que são regulados negativamente na fase de adenoma nem sempre mostram uma actividade que diminui gradualmente ao longo da sequência adenoma-carcinoma, isto é, eles são expressos a um nível inferior no adenoma do que nas amostras de tumor. Além disso, observou-se maior uniformidade das amostras de adenoma de amostras de câncer colorretal no PCA análises de conjuntos de dados de expressão gênica (Figura 7C vs 7B). Esta observação sugere que certos genes que são necessários para ser inactivada por formação do adenoma são reactivados no tumor. É mais fácil obter esses padrões de atividade gênica por regulação epigenética reversível do que por mutações. mediada por metilação regulação pode afectar cerca de 60% dos promotores humanos [11], e permite o ajuste fino das actividades de genes para obter uma óptima combinação de expressão. Esta combinação óptima pode depender de vários factores e pode alterar durante a progressão tumoral. No entanto, por causa do número limitado de amostras neste trabalho, mais estudos são necessários para verificar a esta conclusão.
regulação negativa de muitos genes identificados pela nossa abordagem está relacionada com a tumorigênese. No entanto, mais estudos são necessários para responder se o conjunto de genes underexpresed apresentados neste estudo é específico para o cancro colorectal. Aplicando a nossa abordagem a outros modelos de tumor permitiria investigação do tumor-especificidade da hipermetilação mediada padrões de inativação de genes.
Materiais e Métodos
amostras
Coleta de Amostras
tecido obtido a partir cirurgicamente tecidos do cólon retirados foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado em -80 ° C até à sua utilização.