Abstract

Fundo

O desenvolvimento de vacinas contra o câncer eficazes continua a ser um desafio. Apesar do papel crucial das células dendríticas plasmocitóides (PDCs) em respostas anti-tumorais, seu potencial terapêutico ainda não foi elaborado. Nós exploramos a relevância do HLA-A * 0201 correspondeu pDCs alogênicos como vetores para a imunoterapia.

métodos e resultados

A estimulação de PBMC de HLA-A * 0201

+ doadores por HLA a * 0201 combinados pDCs alogénicas pulsadas com péptidos derivados de tumores desencadeadas níveis elevados de respostas de células T citotóxicas específica para o antigénio funcionais e (até 98% de tetrâmero

+ células T CD8 +). A vacina pDC demonstrado eficácia terapêutica forte anti-tumoral in vivo, como demonstrado pela inibição do crescimento do tumor num modelo de rato humanizado. É também induziram respostas de células T específicas do tumor altamente funcionais ex vivo a partir de PBMC e de TIL de doentes com melanoma I-IV fase. Respostas contra Mela, GP100, tirosinase e Mage-3 antígenos atingiu níveis tetrâmero até 62%, 24%, 85% e 4,3%, respectivamente. As células T sensibilizadas com vacinas PDC especificamente matou próprias células tumorais de melanoma autólogos dos pacientes. Esta vacina pDC semi-alogénica foi mais eficaz do que as vacinas baseadas em DC convencionais mielóides. Além disso, a concepção de uma vacina pDC dota-lo com um forte potencial de aplicação clínica no tratamento do câncer.

Conclusões

Estes resultados destacam HLA-A * 0201 correspondeu pDCs alogênicos como indutores potentes da imunidade do tumor e fornecer uma estratégia imunoterap�tica promissora para combater o câncer

Citation:. Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) A estratégia de vacina do cancro do romance baseado em HLA-A * 0201 Matched células alogénicas plasmocitóides dendríticas. PLoS ONE 5 (5): e10458. doi: 10.1371 /journal.pone.0010458

editor: Graham Pockley, da Universidade de Sheffield, Reino Unido

Recebido: 04 de dezembro de 2009; Aceito: 07 de abril de 2010; Publicado em: 04 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Aspord et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer du (ACI-63-04 e Cancéropôle 2004-05) e Etablissement Français du Sang. J. Charles era um destinatário de doações da Academia Nacional de Medicina e Cancéropôle 2004-05. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O desenvolvimento de vacinas eficazes para tratamento de câncer representa um grande problema de saúde pública [1]. Uma vez que os linfócitos T citotóxicos (CTL) capazes de reconhecer e lisar células malignas, muitas tentativas terapêuticas têm sido concebidas para potenciar as respostas de CTL. células dendríticas mielóides (MDC) vacinas baseados sucedido na indução de células T específicas em pacientes, mas sem eficácia clínica suficiente [2], [3]. transferência celular adotiva de células T efetoras anti-tumorais amplificado ex-vivo de TIL regressão tumoral objectiva induzida [4], [5], mas a complexidade desta estratégia tem dificultado o desenvolvimento de largura. Portanto, existe uma forte necessidade de novas estratégias de imunoterapia para superar as limitações dos actuais protocolos.

Até agora, a indução de respostas de células T específicas para ambas as estratégias imunoterapêuticas adoptivos e activa foi baseado em mDCs [6 ] – [8]. células dendríticas plasmocit�des (PDC) são no entanto os jogadores chave na imunidade [9], [10] com um papel nas respostas imunitárias específicas do tumor [11]. pDCs diferem de mDCs em muitos aspectos, tais como a expressão de TLR, perfil de migração e respostas imunes desencadeantes. pDC também são capazes de captura de antigénios, processamento e apresentação [12] – [15]. pDC pode estimular o primário específico (mela) e a memória (Flu) respostas autólogas de células T CD4 e CD8 imunes in vitro pulsadas com antigénio [16] – [19] e respostas de células T funcionais principais in vivo, como mostrado após a vacinação de ratinhos com CpG ou pDC activado por vírus [20] – [21]. pDC são encontrados dentro de diversos tumores em seres humanos [22] – [26], onde eles são pensados ​​para ser imaturo, tolerogénico ou associado com prognóstico pobre. No entanto, no melanoma, activação PDC TLR-G pode desencadear efeitos anti-tumorais potentes. Em ratinhos, a aplicação de imiquimod (TLR7-G) [27] ou a injecção intratumoral de CpG (TLR9-G) [28] inverteu a inibição funcional de pdc e promovendo assim a regressão do tumor. Além disso a administração local de CpG em pacientes com melanoma induziu o recrutamento e activação de PDC no linfonodos sentinela [29] e as células T CD8 específicas do tumor subsequentes associadas com benefício clínico [30]. O potencial de PDC no geração de respostas imunitárias específicas do tumor eficazes também foi demonstrada num modelo de rato [31]. As abordagens baseadas em PDC e agonistas TLR [32] são, portanto, promissores para o tratamento do cancro humano.

antígenos tumorais normalmente desencadear respostas fracas. Em contraste, as respostas alogénicas dirigidos contra a não-MHC próprio são extremamente potentes. Interessantemente, a resposta alogénica mediada por células T CD4 + MHC de classe II promove-restritos indução espectador específico de células T [33], [34], conforme já mostrado com péptidos virais [35] e a regressão do tumor seguintes enxerto de pele alogénico [36]. Allogeneicity poderia, portanto, ser explorada para promover a imunogenicidade contra os antigénios tumorais [37] quando se considera um jogo HLA parcial entre a vacina e o paciente, mais conhecido como HLA idêntico allogeneicity.

Porque pDCs desempenham um papel fundamental no desencadeamento T respostas de células, a sua utilização poderia ser promissor como novas estratégias de imunoterapia. No entanto, o uso de pDC autólogo para a imunoterapia do cancro é difícil devido à escassez de estas células [38] e a possível alteração funcional das PDC colhidas a partir de pacientes portadores de tumores. Por conseguinte, explorou o potencial de HLA-A * 0201 alogénica combinado PDC para induzir imunidade anti-tumor HLA-A * 0201-restrito. Nós usamos uma linha única humana pDC celular (GEN) estabelecido a partir de leucêmica HLA-A * 0201

+ pDC com características fenotípicas e funcionais fechado para pDCs primários [39], [40], [41]. A estratégia consistiu em utilizar os PDC carregadas com péptido para induzir CTL específica para o antigénio HLA-A * 0201-restrito. Nós demonstramos aqui utilizando tumor e modelo viral antigénios do potencial da irradiado péptido-pulsado humano HLA-A * 0201 combinados linha alogénica pDC (GENiusVac) in vitro, o efeito terapêutico in vivo, em ratinhos humanizados, e a sua relevância clínica ex-vivo com células dos pacientes com melanoma. Nossos resultados destacam HLA-A * 0201 correspondeu pDCs alogênicos como indutores potentes da imunidade anti-tumor e fornecer uma nova estratégia imunoterap�tica promissora para combater o câncer.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

As culturas foram realizadas em meio RPMI 1640 com Glutamax suplementado aminoácidos não essenciais a 1%, piruvato de sódio 1 mM (Sigma), 100 ug /ml de gentamicina e 10% de FCS (todos da Invitrogen menos que seja notificado). linha de melanoma Me275 foi fornecido pelo Pr J-C Cerottini (Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, Epalinges, Suíça). linhas de melanoma COLO829 e A375, K562 e as linhas T2 foram adquiridas a partir da ATCC (LGC Standards, Molsheim, França). linha de melanoma Mel89 foi gerado em nosso laboratório (figura S1). CD45 anti-humano, CD3, CD8 Abs foram adquiridos da Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs foram adquiridos da BD Biosciences e mela humana anti- da Sigma.

Peptídeos e tetrâmeros

Foram utilizados os seguintes viral- e derivado de tumor HLA-A * 0201 restritas peptídeos (NeoMPS) ea correspondente iTag HLA-a * 0201 tetrâmeros (Beckman Immunomics): mela

26-35 (ELAGIGILTV), GP100

209-217 (IMDQVPFSV), tirosinase

369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3

271-279 (FLWGPRALV), FluM1

58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65

495-503 (NLVPMVATV).

PBMC, linha PDC PDC primária geração de isolamento e mDCs

de PBMC humanas foram obtidas a partir de HLA-A * 0201

+ doadores saudáveis ​​por centrifugação em Ficoll-Hypaque de gradiente de densidade (EUROBIO). A linha pDC GEN2.2 humana foi cultivada como anteriormente descrito [39]. pDC primários foram isolados a partir do sangue de HLA-A * 0201

+ dadores saudáveis. As DCs foram primeiro enriquecidas por depleção das células não desejadas usando o kit de pré-enriquecimento Pan DC (StemCell). As células recuperadas foram quer submetidos a BDCA4 + selecção (Miltenyi) ou marcado com um cocktail Linhagem, CD123, HLA-DR e anticorpos CD11c (BD) e classificados em um BD FACSAria com base na expressão de CD123 e HLA-DR e falta de Lin e marcadores CD11c. A pureza do PDC após espécie foi mais de 98%. mDCs foram diferenciados a partir de monócitos do sangue usando 500 U /mL de GM-CSF e 10 ng /ml de IL-4 (Tebu Prepotech, França) durante 6 dias. Este estudo foi realizado no âmbito de um procedimento aprovado pela Agência Sangue Francês Institutional Review Board. Todos os doadores assinaram formulários de consentimento informado.

Melanoma amostras de pacientes

As amostras foram obtidas a partir da fase I a IV pacientes HLA-A * 0201 de melanoma que assinaram formulários de consentimento informado. Usamos material extra que não foi necessária para o diagnóstico ou análise dos pacientes e não necessários procedimentos complementares. Portanto, de acordo com a regulamentação francesa, sem a aprovação ética foi necessário, mas informações e assinaram termo de consentimento dos pacientes. Os parâmetros clínicos são apresentados na Tabela S1. As amostras de sangue foram obtidas de 12 doentes e as PBMC purificadas por gradiente de densidade. amostras tumorais frescas foram obtidos a partir de 6 pacientes que foram submetidos a cirurgia para metástase em trânsito. As amostras foram digeridas e dilacerada em 2 mg /ml de colagenase D (Roche Diagnostics) 20 U /ml de ADNase (Sigma). Em seguida, as células tumorais foram isoladas a partir da suspensão de células por aderência e TIL enriquecida a partir da fracção não-aderente por gradiente de densidade.

T específicas para a indução de resposta in vitro de células

Gen Células foram carregadas com um primeiro ou vários péptido (s) de interesse. Resumidamente, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI isento de soro e ressuspensas a 1,10

6 células /ml. Foram adicionados β2-microglobulina (0,1 ug /ml final) (Sigma) e péptido (s) (1-10 uM final) (NeoMPS). Após 3 horas de incubação a 37 ° C, as células foram lavadas duas vezes, irradiadas com 30Gy e ressuspensas a 2,10

5 células /ml em RPMI com 10% de FCS. Péptido-carregado GEN foram depois co-cultivadas com semi-alogénica de HLA-A * 0201 de PBMC a uma razão de 1:10 em meio RPMI + FCS a 10% durante pelo menos 7 dias. As culturas foram re-estimuladas semanalmente com GEN carregado com péptido e 200 U /ml de IL-2 (Proleukine; Chiron). Em algumas experiências, pDCs ou mDCs primários não estimulados amadureceu com LPS (1 ug /ml) foram usadas as mesmas condições seguintes. Em algumas experiências de bloqueio anti-IFNa (50.000 U /ml) e anti-IFNp (25.000 U /ml), anticorpos (PBL laboratórios médicos) ou IgG de cabra de controlo foram adicionados no dia 0 e no dia 2 de cultura. respostas de células T CD8 específicas foram medidas por meio de rotulagem tetrâmero de PBMC inicialmente e em diferentes etapas da cultura. As células foram ressuspensas em HBSS com 2% FCS, coradas com CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetrâmero PE, CD3 PC7, anticorpos CD8 APC e analisados ​​por análise de citometria de fluxo FACSCalibur utilizando um software de busca e celular (Becton Dickinson). Para determinar os níveis de tetrâmero iniciais, pelo menos 1-2,10

6 eventos foram adquiridos.

Os ensaios in vitro funcionais

IFNy secreção e expressão CD107 por células tetrâmero + T CD8.

células T foram primeiro marcadas com iTag HLA-a * 0201 tetrâmero PE durante 30 min à temperatura ambiente, lavadas e estimuladas de novo com células T2 pulsadas com péptido (10:01 ratio) para 5 H30. Para a secreção de IFN-y, 1 ul /ml de brefeldina A (BD Biosciences) foi adicionado para a última 3 h. As células foram, em seguida, com anti-CD3 e anti-PC7 CD8 APC anticorpos e submetidos a coloração intracelular de IFN-y (BD Biosciences) marcado com superfície. Para a detecção de CD107, anticorpos anti-CD107a e CD107b FITC (10 ul /1.10

6 células) (BD Biosciences) foram adicionados no meio no início do re-estimulação, na presença de Golgi STOP (0,67 ul /ml) para o última 4 h. As células foram então marcadas com anti-CD3 PC7 e anticorpos anti-CD8 APC. IFNy e coloração CD107 foram analisados ​​no tetrâmero

+ CD8 +, tetrâmero

-.. Células T CD8 + e células T CD4 +

Ensaio de citotoxicidade

actividade citotóxica específica de antigénio

foi medido através da realização de um ensaio de libertação de

51Cr padrão. células T efectoras foram classificadas a partir da co-cultura utilizando um kit de enriquecimento de células T humanas EasySep (Stem Cell). As células alvo (células T2 pulsadas com péptido, K562, células alogénicas ou células tumorais autólogas) foram marcadas com 50 uCi durante 1 hora a 37 ° C, lavadas 3 vezes e semeadas com células T efectoras no E indicada: razão T no fundo redondo de 96 placas -Bem. Após 4 horas de incubação, a radioactividade foi medida em 30 jil do sobrenadante sobre um contador de cintilação de microplacas Top NXT Count (Perkin Elmer). A média de medições em triplicado foi expressa como uma percentagem de lise especifica utilizando a fórmula:. (Libertação amostra – libertação espontânea) /(libertação máxima – libertação espontânea) x 100

in vivo ensaios funcionais em ratinhos humanizados

β NOD-SCID

2 m

– /- ratos imunodeficientes (NOD.Cg-Prkdc

SCIDβ

2 m

Tm1Unc /J) foram adquiridos de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor , EUA) e criado na Plateforme de Haute Technologie Animale (PhtA, La Tronche, França). Para as experiências de terapia ativa, ratos huPBL foram construídas através do transplante intraperitoneal (ip) 50.10

6 PBMC de dadores saudáveis ​​em β NOD-SCID subletal irradiado

2 m

– /- ratos (120-150 cGy). Os ratos foram ainda vacinados com 5.10

6 pulsado com péptido células irradiadas GEN por IP ou as rotas sc uma vez por semana. Resposta à vacinação foi analisada em diferentes pontos no tempo no sangue, lavagem peritoneal, do baço e dos gânglios linfáticos. Os órgãos foram digeridos 30 min a 37 ° C com 2 mg /ml de colagenase D (Roche Diagnostics). As suspensões de células resultantes foram lavadas com HBSS + FCS a 2%, corados utilizando os seguintes anticorpos anti-humanos (CD45 FITC, iTag HLA-A * 0201 tetrâmero PE, CD3 PC7, CD8 APC) e submetido a análise de citometria de fluxo. Para avaliar a eficiência terapêutica, 1.10

6 células tumorais humanas foram implantadas subcutaneamente no flanco de ratinhos humanizados, quer depois de 5 dias (profiláctico) ou 4 dias antes (terapêutico) da primeira vacinação. A vacinação foi repetida a cada semana. O tamanho do tumor foi monitorizado a cada 2-3 dias e o volume do tumor calculado utilizando a fórmula: (diâmetro curto)

2 × diâmetro longa /2. Para analisar as células T específicas no local do tumor e em DLN, os tecidos foram digeridos tal como anteriormente descrito e as suspensões de células foram submetidas a rotulagem do tetrero e citometria de fluxo. Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelo Comité Regional para Animal Ética Rhone-Alpes (CREEA) filiados ao CNRS.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando Mann-Whitney teste não paramétrico U e teste t não emparelhado utilizando software Prism.

Resultados

HLA humano combinado pDCs alogénicas induzir respostas de células T específicas de antigénio a partir de PBMC de dadores saudáveis ​​com um forte eficácia in vitro

para investigar o potencial de HLA idêntico alogénica pDC na indução de respostas de células T específicas para antigenes, comparamos a capacidade de carregado com péptido pDC primária classificados de sangue de dadores saudáveis, para induzir respostas de células T específicas em autólogo e alogénico de HLA-a * configurações 0201-correspondido. pDC conduziu a uma indução significativamente maior específica de células T em HLA-A * 0201 combinados configurações alogénicas em relação às condições autólogas (amplificação do número absoluto de células T específicas de mela em 7 dias: 35,6 ± 8,9 vs 17,9 ± 8,7, média ± SEM , p = 0,02) (Figura 1A e 1B, quatro experiências realizadas com três dadores diferentes). À medida que a escassez de pDC primária impede a sua utilização terapêutica ampla, foi utilizada a linha celular humana pDC (GEN) estabelecido a partir de leucémica HLA-A * 0201

+ pDC como uma fonte de HLA-A * 0201 combinados pDCs alogénicas. Para avaliar se a irradiado de HLA-A * 0201

+ linha pDC podem induzir respostas de células T específicas como por exemplo PDC primária in vitro, alogénica de HLA-A * 0201

+ PBMC de dadores saudáveis ​​foram estimuladas com o irradiado péptido-loaded Gen células. Para tanto do tumor (mela) e virais (gripe) -derived péptidos, obteve-se um aumento maciço de células T específicas após 7 dias de cultura, como detectado por meio de rotulagem tetrâmero (Figura 1C, a Figura S2). Esta indução foi ainda reforçada por estímulos de série a cada 7 dias com a linha pDC carregado com péptido, em combinação com a IL-2. Nós rotineiramente obtidos 5-25% de tetrâmero

células T CD8 + após 7 dias, 40-60% após 15 dias, e até 98% após 40 dias (Figura 1c). Tais respostas elevadas foram reproduzidos com células de dadores saudáveis ​​e 14-20 com vários antigénios derivados de tumores de melanoma, tais como mela, GP100, Tyr, MAGE-3 (Figura 1D), bem como os antigénios derivados de vírus (Figura S2). específico do tumor tetrâmero

+ respostas de células T atingiu médias de 22% para mela (intervalo de 2-60%), 0,3% para o GP100 (intervalo de 0-3%), 1,2% para Tyr (intervalo de 0-8%) e 0,84% para MAGE-3 (intervalo de 0-4%) em 20 dias. -respostas específicas multi também foram induzidos utilizando células GEN carregados com vários péptidos diferentes (não mostrado). Assim, HLA idêntico pDCs primários alogénicos ou a linha pDC eliciar fortes respostas de células T primárias específicas para o antigénio e de memória in vitro a partir de dadores saudáveis.

(A, B) autóloga ou alogénica de HLA-A * 0201

+ primária pDC classificadas a partir do sangue de dadores saudáveis, foram pulsadas com o péptido mela e usados ​​para estimular a HLA-a * 0201

+ PBMC. A resposta específica das células T foi analisada em d7 pela rotulagem tetrâmero. (A) Percentagem de células T específicas mela (gated em células T CD8 +). Um experimento representativo é mostrado. (B) Amplificação do número absoluto de células T específicas do D0 a D7 (4 experiências independentes realizadas com 3 doadores diferentes). (C, D) alogénica de HLA-A * 0201

+ PBMC de dadores saudáveis ​​foram estimuladas com o irradiado carregado com péptido a HLA-A * 0201

+ linha PDC e re-estimuladas semanalmente na presença de IL2. A especificidade das células T foi determinada por meio de rotulagem do tetrero e citometria de fluxo. (C) dotplots representativos gated em células T CD8 + (painel esquerdo) e as percentagens (painel da direita) de mela tetrâmero

células + T na cultura inicialmente e em diferentes pontos de tempo após a estimulação com a linha pDC carregado com péptido mela. Flu tetrâmero foi utilizado como controle. (D) gráficos de pontos representativos fechado em células T CD8 + (painel esquerdo) e percentuais de tetrâmero

+ células T CD8 + obtidos nos dias 7, 14 e 20 da cultura em direção Mela (n = 18), gp100 (n = 16 ), Tyr (n = 16) e MAGE-3 (n = 16) antigénios tumorais.

As células T específicas induzidas por HLA idêntico pDC alogénica exibiram uma actividade restrita de HLA-funcional in vitro

Examinámos ainda mais a funcionalidade das células T específicas induzidas por HLA-a * 0201 combinados linha pDC alogénica. O primeiro analisada a capacidade das células T específicas do tumor a secretar IFN-y e expressam CD107 sobre a re-estimulação. Quando adequado, as células T específicas MELA-co-cultivadas com células T2 carregadas com péptido e IFNy segregado CD107 expresso na presença do correspondente péptido mas não o controlo (Figura 2A). Obtivemos dentro tumorais reativa células T médias de 25% IFN

+ tetrâmero

+ T CD8 células sobre a re-estimulação específica em comparação com 5% em condições de controle (p = 0,007), e 50% CD107

+ tetrâmero células

+ T CD8 sobre a re-estimulação específica em comparação com 24% sob condições de controlo (p = 0,02) (dados não mostrados). Estamos próximos testaram sua citotoxicidade através da realização de teste de libertação

51Cr utilizando células T2 carregadas com péptido e linhas tumorais de melanoma como alvos. células T específicas MELA-exibiram uma forte actividade citotóxica para as células T2 carregadas com o relevante, mas não com o péptido de controlo (Figura 2B). Obteve-se 88% de morte específica contra 13% sob condições de controlo (média de 8 experiências, p 0,001) (não mostrado). Além disso, as células T específicas de mela foram capazes de lisar a HLA-A * 0201

+ Mela

+ (Me275) mas nem HLA-A * 0201

+ Mela

– (A375) nem HLA -A * 0201

-MelA

+ (COLO829) células tumorais de melanoma (Figura 2B, Figura S1) que demonstram a HLA-a * 0201-restrição e especificidade antigénica desta actividade. Além disso, esta lise foi inibida por EGTA-MgCl2 ou pela depleção de células T CD8 (não mostrado), que em conjunto com a expressão de superfície CD107 sobre a re-estimulação específica, sugere um mecanismo que envolve a exocitose de grânulos citolítica das células T CD8. Tais capacidades funcionais foram observadas com células T tomadas em diferentes pontos de tempo da cultura 7-40 dias. Uma análise semelhante realizada com células T específicas do vírus demonstraram a capacidade de Flu tetrâmero

+ células T a secretar IFN-y e expressam CD107 em cima reestimulação específica, e as suas propriedades citotóxicas (Figuras S3A e S3B). Importante, observou-se apenas uma indução de resposta alogênico menor como atestado pela fraca ativação de tetrâmero não específica

– células T CD8 + e células T CD4 + no sentido de células GEN. Isto foi observado após uma estimulação (resposta Flu) (Figura S3C e S3D) mas estimulações também depois repetidas com a linha de PDC (resposta mela), através da medição de IFN-y-secretores (Figura 2C) e CD107-expressando células T (Figura 2D) mediante reestimula�o com T2 ou células GEN. Observou-se também a ausência do tetrero de actividade de células

+ T em relação às células GEN carregadas com um péptido irrelevante. Assim, a linha pDC elicia células T específicas do antigénio totalmente funcional com respostas alogénicas bystander menores.

células T específicas MELA-(A) induzidas pela linha pDC secretar IFN-y e expressam CD107 na superfície sobre a re-estimulação específica. As células a partir da cultura (dia 14) foram submetidos a rotulagem tetrâmero e estimuladas de novo com células T2 pulsadas com um péptido relevante ou ao controlo. produção de IFN-y foi avaliada por coloração intracelular e expressão de CD107 por adição de anti-CD107a + b anticorpos durante a re-estimulação. Dotplots são delimitação de tetrâmero

+ células T CD8 +. Representante de 8 experiências realizadas com 3 doadores no dia 8-40 da cultura. (B) As células T específicas MELA-induzidas pela linha pDC são citotóxicos. As células T foram seleccionados a partir da cultura e submetidas a um ensaio de libertação de

51Cr utilizando células T2 carregadas com péptido e células tumorais de melanoma como alvos. Representante de 8 experiências realizadas com 4 dadores a d13-40 da cultura. (C, D) de IFN-y a secreção e CD107 expressão foram avaliados como descrito em (A) depois de três estímulos de PBMC e analisadas no tetrâmero

+ células T CD8 + (barras brancas) e na tetrâmero não específica

– As células T CD8 + (barras cinza) e células T CD4 + (barras pretas) após re-estimulação com células T2 pulsadas com peptídeo ou GEN (4 experimentos para cada condição).

O HLA carregado com péptido combinado alogênico pDC A linha induz forte em respostas de células T específicas para o antigénio in vivo em ratinhos humanizado

O uso de HLA idêntico pDCs alogénicas como uma vacina requer a indução de respostas de células T específicas para o antigénio in vivo. Portanto, avaliamos o potencial vacina da linha PDC em um modelo humanizado de rato [42] construídos por xenotransplanting PBMC humana em ratinhos imunodeficientes NOD-SCIDβ

2 m

– /- ratos (huPBL modelo SCID). Vinte e quatro horas após a transferência intraperitoneal, CD45 humano

+ células hematopoiéticas foram encontrados no local da injecção, mas também na circulação e órgãos linfóides (não mostrado). Uma injecção intra-peritoneal único do irradiado carregadas com péptido a HLA-A * 0201 combinados linha pDC alogénico induzidas respostas de células T fortes específicas para o antigénio em relação viral (FluM1, CMVpp65) e de tumor (mela) antigénios em huPBL ratinhos (Figura 3A). tetrâmero Humano

células T CD8 + foram encontradas não só no local de imunização (lavagem peritoneal), mas também na circulação (no sangue) e os órgãos linfóides (baço, nódulos linfáticos) (Figura 3A). Em seguida, avaliou se várias injecções semanais da linha pDC pulsadas com péptido pode melhorar o nível da resposta. Curiosamente, antigénio virai (Flu) induziu uma resposta de alta que atingiu um pico 7 dias após a primeira vacina e depois diminuiu, ao passo que a resposta a antigénio de tumor (mela) continuou a aumentar após a re-estimulações subsequentes (Figura S4). Dentro de todos os ratinhos huPBL vacinados (n = 22, 18 e 38) reconstituído com PBMC humanas (níveis basais de células T CD8 + tetrâmero + foram de 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) e 0,01% (mela) tetrâmero

+ T células) dos níveis de células T específicas recuperados nas diferentes órgãos foram entre 0,7 e 1,9% para FluM1, 1,1 a 5,9% para CMVpp65, e 0,2 a 1% de mela (Figura 3B). Assim, a linha pDC pulsadas com péptido induz respostas de células T específicas de antigénio fortes e generalizadas in vivo

(AB) imunodeficientes NOD-SCIDβ

2m

-. /- Ratinhos foram reconstituídos com 50,10 intraperitonealmente

6 humana HLA-a * 0201

+ PBMC de doadores saudáveis ​​e vacinados pela mesma via com 5.10

6 irradiados células GEN carregadas com péptido. indução de células T especifica foi analisada no local da injecção (lavagem), na circulação (no sangue) e os órgãos linfóides (baço, LN) por meio de rotulagem tetrâmero de células T humanas em suspensões de células. (A) A vacinação com células carregadas com péptido GEN induzida respostas específicas de células T in vivo. gráficos de pontos representativos de células tetrâmero marcado T induzidas após uma única vacinação com células GEN carregadas com péptido, em diferentes órgãos no dia 8 de vacina anti-viral (Flu, CMV) e no dia 10 para a vacina anti-tumoral (Mela) (delimitação de CD8 células

+ T). Um ratinhos por grupo é mostrado. Níveis iniciais de células T específicas dentro de PBMC eram de 0,04%, 0,14% e 0,003%, respectivamente. (B) os níveis de células T específicas antes (dia 0) e após a vacinação com GEN carregado com FluM1 (n = 22 ratinhos, 4 dadores, uma vacina), CMVpp65 (n = 18 ratinhos, 2 dadores, uma vacina) e mela ( n = 38 ratinhos, 4 dadores, 2-3 vacinas) péptidos nos tempos indicados em diferentes órgãos. Cada ponto representa um vacinados huPBL ratos (barras em média).

A vacinação com o HLA idêntico linha pDC alogênico proteger camundongos humanizados da progressão do tumor em ambas as configurações profiláticas e terapêuticas carregado com péptido

a seguir, investigou o potencial terapêutico desta estratégia em ratinhos humanizados ainda enxertados com tumores humanos. NOD-SCIDβ

2 m

– /- ratos foram reconstituídos intra-peritoneal com HLA-A * 0201

+ PBMC e subcutânea vacinado semanalmente com células GEN pulsado com péptido irradiadas antes ou depois de ser desafiado com tumor melanoma células. Numa configuração profilática, a injecção de ratinhos huPBL com células GEN MELA-carregada, em comparação com as células GEN Flu-carregadas, inibiu a HLA-A * 0201

+ Mela

+ o crescimento do tumor (Me275) em cinco experiências independentes (tumoral tamanho no dia 27 = 12 vs 77 mm

3, p 0,0001) (Figura 4A e 4C). Por outro lado, o crescimento do HLA-A * 0201

-MelA

+ (COLO829) e HLA-A * 0201

+ mela

– (A375) tumores de melanoma não foi afetada após a injeção de Mela ou Flu-carregado células GEN em três experiências independentes (Figura 4C), demonstrando a HLA-a * 0201-restrição e antigénio especificidade da terapia. Além disso, o PDC carregado com péptido também provocar respostas imunitárias protectoras contra tumores já estabelecidos. A vacinação de ratinhos huPBL-portadores de tumor com células MELA-GEN carregados inibiu o crescimento tumoral em comparação com células GEN Flu-carregados (tamanho do tumor no dia 25 vs 36 milímetros = 6

3, p = 0,01) (Figura 4D-4F). Notavelmente, tetrâmero

+ células T CD8 + foram encontradas no local do tumor e no LN de drenagem (Figuras 4B e 4F), o que sugere que as células T tumor-reactivo induzidas pelo HLA idêntico alogénica pDC haviam migrado para o local de antigénio expressão e as células T foram capazes de matar células tumorais

(AC) imunodeficientes NOD-SCID β

2 m

-. /- ratos reconstituídos por via intraperitoneal com HLA-a * 0201

+ PBMC (ratos huPBL) foram semanal vacinados por via subcutânea com Mela irradiado ou células GEN Flu-carregados e desafiados 5 dias mais tarde com células tumorais de melanoma no flanco. (A) Acompanhamento da progressão do tumor. Um representante experimento de 5. (B) rotulagem Tetrâmero de tumor e de drenagem de suspensões de células LN de ratinhos huPBL vacinados com células MELA-GEN carregados que mostram a presença de células T específicas de mela (gated em células T CD8 +). (C) Os efeitos terapêuticos da vacina são HLA-A * 0201-restrita e específica de antigénio. o tamanho do tumor Comparativo 27 dias após a implantação de Me275, COLO829 e células de melanoma A375 em ratinhos huPBL vacinados com mela ou células GEN-Flu carregado (conjunto de 3 experiências independentes para cada tipo de tumor realizada com 6 a 14 ratinhos por grupo). (DF) imunodeficientes NOD-SCID β

2m

– /- murganhos reconstituídos por via intraperitoneal com HLA-A * 0201

+ PBMC (ratinhos huPBL) foram inoculados em primeiro lugar com células tumorais de melanoma Me275 no flanco e depois subcutaneamente vacinados com Mela irradiado ou células Flu-carregados GEN a partir da semana 4 dias depois. (D) Acompanhamento da progressão do tumor. Uma experiência representativa de tamanho 2. (E) Comparação do tumor 25 dias após a implantação do tumor (pool de 2 experiências independentes, 8 ratos /grupo). (F) rotulagem tetrâmero de tumor e drenar suspensões de células LN de ratinhos huPBL vacinados com células GEN mela-carregados que mostram a presença de células T específicas de Mela (delimitação de células T CD8 +).

O HLA correspondido linha pDC alogênico carregado com péptidos derivados de melanoma induz respostas de células T específicas de vários e altamente funcionais ex-vivo a partir da fase I-IV pacientes com melanoma

a seguir, investigou a relevância desta estratégia em pacientes com câncer. Foi testada a capacidade da linha de pDC pulsadas com péptido para desencadear ex vivo respostas específicas do tumor a partir de PBMC e linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) isoladas a partir de estádio IV de HLA-A * 0201

+ pacientes com melanoma (Tabelas S1 e S2 ). estimulações semanais de CMSP dos pacientes com a linha pDC pulsadas ou com mela, GP100, Tyr ou MAGE-3 péptido levou a um aumento em massa de células T CD8 + específicos para, pelo menos, dois de 4 antigénios de melanoma (Figuras 5A e 5B). O tetrâmero específico de tumores

respostas de células T CD8 + atingiram médias de 23% para mela (gama de 0,4-62%), 1,2% para o GP100 (gama de 0,05-3,5%), 0,3% para Tyr (intervalo de 0,01-2,5% ) e 0,2% para as células T CD8 + MAGE-3 (intervalo 0,03-0,72%), após 20 dias (tetrâmero de linha de base + variaram entre 0,02 e 0,03% em D0). Um paciente foi excluído da análise devido a uma resposta extremamente intenso (85% tetrâmero

células + T no dia 14) em direcção a TYR (Figura S5). Além disso, estimulações repetidas de patients’TIL com a linha pDC pulsadas com uma mistura de 4 péptidos de melanoma conduziu à amplificação maciça de células T específicos para antigénios de pelo menos 3 (Figuras 5C e 5D). específico de tumor tetrâmero

+ respostas de células T CD8 alcançaram médias de 39% para Mela (intervalo 12-59%), 7,4% para GP100 (faixa de 0,2-24%), 0,3% para TYR (faixa de 0,05-1,2%) e 1,1% para MAGE-3 (intervalo de 0,1-4,3%), após 20 dias, com níveis de linha de base 0 dias formato de 1,7, 0,2, 0,05 e 0,3%, respectivamente.