Abstract
Objectivo
O câncer colorretal (CRC) desenvolvimento envolve subjacente alterações a nível genético /epigenética. Este estudo avaliou o papel da mutação do gene Kras e RASSF1A, FHIT e MGMT promotor do gene hipermetilação juntos /independente em CRC esporádica na população indígena e correlação com variáveis clínico-patológicos da doença.
Métodos
One cento e vinte e quatro tecidos cirurgicamente ressecados consecutivos (62 tumorais e igual número de controles normais adjacentes) do CRC esporádica primária foram incluídos e dados do paciente, incluindo características demográficas, de estilo de vida /alimentos ou beber hábitos, clínicos e perfis histopatológicos foram registrados. em cadeia da polimerase reação -. polimorfismo de fragmento de restrição e sequenciação directa de mutação de genes Kras e metilação específico-PCR para RASSF1A, genes FHIT e MGMT foi realizada
Resultados
mutação do gene Kras no códon 12 13 e metilado RASSF1A, FHIT gene MGMT e foi observado em 47%, 19%, 47%, 37% e 47% dos casos, respectivamente. O consumo de álcool e tabagismo foram significativamente associados com a presença da mutação Kras (códon 12) e metilação MGMT (p 0,049). fase de tumores e metástases correlacionada com a presença de Kras mutantes codão 12 (valores de p 0,018, 0,044) e RASSF1A metilado (valores de p de 0,034, 0,044), FHIT (valores de p de 0,001, 0,047) e (p-valores MGMT 0,018, 0,044 ) genes. Também foi observado efeito combinatório de gene de mutação /metilação (p 0,025). No geral, o estágio do tumor 3, tumores moderadamente diferenciados, presença de invasão linfática e ausência de metástase foi mais frequentemente observada em tumores com mutação Kras e /ou RASSF1A metilado, FHIT e genes MGMT.
Conclusão
inter-relação sinérgica entre esses genes em CRC esporádicos podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico /prognóstico na avaliação do estado patológico global da CRC
Citation:. Sinha R, Hussain S, Mehrotra R, Kumar RS, Kumar K, Pande P, et ai. (2013) Kras mutação genética e RASSF1A, FHIT e MGMT Gene Promotor Hipermetilação: Indicadores de estadiamento de tumores e metástases em Adenocarcinomatous câncer colorretal esporádico em Indian População. PLoS ONE 8 (4): e60142. doi: 10.1371 /journal.pone.0060142
editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de outubro de 2012; Aceito: 21 de fevereiro de 2013; Publicação: 03 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sinha et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é o terceiro mais comum. câncer em homens (663000 casos) ea segunda em mulheres (571000 casos), com cerca de 608.000 mortes estimadas no mundo inteiro, tornando-se a quarta causa mais comum de morte por câncer. Na Índia, a incidência estimada e mortalidade por CRC é 36476 casos e 25690 casos, respectivamente [1]. taxas de CRC são cerca de 2 a 5 vezes superior nos países desenvolvidos, em comparação com os países em desenvolvimento, que possam ser atribuíveis a uma gama de variações em um conjunto diverso de factores de risco e as práticas de diagnóstico [2], [3]. Estilo de vida relacionada predispondo fatores de risco modificáveis para CRC incluem sedentarismo, excesso de peso e obesidade, vermelho e consumo de carne processada, tabagismo e consumo excessivo de álcool [3].
CRC é uma doença heterogênea, com etiologia complexa e pode ser causada, em parte, por alterações genéticas e epi que podem actuar sinergicamente e transformar as células epiteliais em adenocarcinomas [4]. Uma alteração genética que ocorre em adenomas (10%), bem como os carcinomas (40%) no cólon e rectal do cancro é a activação oncogénica do gene Kras por mutações [5]. O proto-oncogene KRAS codifica uma proteína (p21-ras) que pertence à família de proteínas de GTP /GDP-ligação com a actividade de GTPase e está envolvido na transdução de sinais mutagénicos [6].
Epigenetic silenciamento de genes também desempenha um papel importante na inactivação de genes supressores tumorais na carcinogénese [7]. metilação anormal do DNA nas ilhas de CpG na região promotora inicia-se precocemente na tumorigénese e é um importante mecanismo epigenético subjacente à inactivação de genes supressores de tumor [8]. RASSF1 gene é um gene supressor tumoral putativo agindo em fase G1 /S de progressão do ciclo celular [9]. Gene silenciamento como resultado da metilação aberrante do promotor em RASSF1A pode ser um evento importante causador na tumorigénese e tem sido reconhecida como um marcador alternativo para regular negativamente a via de Ras [10].
O gene FHIT humano, um gene supressor tumoral , é um membro da família de genes tríade histidina [11]. A metilação do gene FHIT tem sido observado em vários tumores sólidos e uma perda abreviada ou completa da expressão de proteína FHIT foi demonstrado ser devido à metilação do gene que conduz à sua inactivação da transcrição e da progressão da doença [12]
.
o
metiltransferase-DNA 6-metilguanina (MGMT) é uma enzima de reparação do ADN removendo grupos alquilo do o
6 posição da guanina [13]. hipermetilação do promotor MGMT e gatilho silenciamento epigenético ocorrem frequentemente eventos como precoce na carcinogênese [14].
O presente estudo foi assim conduzido para estudar o papel da mutação genética no gene Kras e modificação epigenética em RASSF1A, FHIT e MGMT genes em conjunto ou de forma independente em adenocarcinomatous CRC esporádica na população indiana e sua correlação com as variáveis clínico-patológicas de CRC.
Materiais e Métodos
pacientes e Tissue espécimes
Um total de 124 cirurgicamente consecutivo ressecado amostras de tecidos frescos, compreendendo de 62 tecidos tumorais e 62 regiões de controle normais adjacentes (não mucosa saudável tumoral normal a 2 cm de distância do tumor) [15] do CRC esporádicos primários foram coletados para análise no presente estudo . Apenas os casos que preenchem os critérios de inclusão, tais como casos consecutivos com um diagnóstico primário de câncer colorretal submetidos a cirurgia inicial foram retomadas com o propósito deste estudo. Nenhum destes pacientes tinha recebido qualquer tratamento pré-operatório, na forma de radiação ou quimioterapia. Todas as amostras de tecido foram recolhidas no prazo de 10 minutos de ressecção. As amostras de tecido foram divididas em duas partes; uma parte foi enviada para o diagnóstico histopatológico e estadiamento e a outra metade foi armazenada a -80 ° C para análise molecular. graus histopatológicos e estadiamento clínico foram avaliados de acordo com os critérios da norma [16] por dois patologistas independentes com 5 casos classificados adenocarcinoma bem diferenciado, 41 adenocarcinoma moderadamente diferenciado, 15 como mal adenocarcinoma diferenciado e 1 paciente como adenocarcinoma indiferenciada, enquanto 8, 25, 25 e 4 pacientes foram classificados como fase 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Apenas histopatologia foram incluídos casos confirmados para análise molecular. Os detalhes de cada paciente relacionado ao seu perfil demográfico, hábitos, sinais e sintomas, história pessoal, investigações, perfil tumor incluindo relatórios de metástase e histopatologia, a continuação do tratamento e acompanhamento de informação também foi registrado. Em termos de hábitos alimentares, alimentos condimentados foi classificada como o uso de especiarias especiarias especialmente quentes e pimentões na dieta em cada refeição regular (3-5 gramas por refeição), a dieta vegetariana não foi considerado como o consumo de carne vermelha (pelo menos três vezes por semana) e de ácidos gordos da dieta foi julgado ingestão de dieta rica em gordura de qualquer tipo com o aumento do uso de óleos de cozinha em cada refeição ( óleo de 10 ml de mostarda por refeição). Todos os pacientes incluídos no estudo eram alcoólatras crônicos (média de utilização de álcool 100-150 ml por dia, pelo menos 3-4 vezes por semana), fumantes (pelo menos um maço de 10 cigarros por dia) e mastigadores de tabaco (4-6 maços por dia). O estudo foi aprovado pelos comitês de ética das instituições participantes e antes consentimento informado por escrito foi tomado dos pacientes antes da inclusão no estudo. O estudo foi realizado em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinki [17].
Extração de DNA
DNA genômico-alto peso molecular foi extraído de -300 mg de tumor e amostras de tecidos normais adjacentes pelo método padrão de digestão com proteinase K seguido de extracção com fenol-clorofórmio [18]. ADN quantidade /qualidade foi verificada por espectrofotometria (Nanodrop ND-1000 versão 3.6.0, Thermoscientific, Willington DE EUA) electroforese em gel de agarose /1% e armazenada para uso posterior, a -20 ° C.
Kras Análise Mutação
ADN foi amplificado numa mistura reaccional de 25 ul contendo 25 pmol de iniciadores tanto para a frente e reversa, 25 mM de cada dNTP e 0,2 U de Taq DNA polimerase. As sequências iniciadoras foram descritos noutro local [19]. Os iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados num sintetizador de ADN automatizado Applied Biosystems Aplicada (modelo 381A; Applied Bio-Systems, Foster City, CA, EUA) utilizando o método da fosforamidite e purificados em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Além disso, fragmentos de restrição análise de polimorfismo de comprimento foi feito com MvaI e BglI para verificar a presença de mutações no códon 12 e 13 do gene Kras. Os produtos da digestão foram então visualizadas por coloração com brometo de etídio sob luz UV, após electroforese em gel de agarose a 4%. Os resultados foram confirmados por sequenciação.
A metilação Polymerase Chain Reaction específico (MSP)
O DNA genômico foi modificada usando o Kit DNA EZ metilação ouro (Marketing Pro Lab, Delhi, India), conforme as instruções disponível seguido por PCR com iniciadores específicos metilados e não metilados para definir os padrões de metilação. As sequências dos iniciadores de cada promotor do gene para as formas tanto metilados e não metilados foram descritos anteriormente [7], [20]. Arranque a quente de PCR foi realizada e os produtos foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 2,5% e visualizados sob iluminação com UV, após coloração com brometo de etídio.
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas por métodos normalizados usando software SPSS computador (versão 16, SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). Exatas testes de teste ou qui-quadrado de Fischer foram usados como aplicável. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos em valores de p 0,05. A sobrevida global (OS) foi calculado pelo método de sobrevida de Kaplan Meier [21]
Resultados
Análise global com base no Demográfico Perfil clínico e sobrevivência do CRC pacientes
Dos 62 casos analisados, tumor estava localizado no cólon, reto e regiões retossigmóides em 66%, 24% e 10% dos casos, respectivamente. A maioria dos pacientes (76%) eram do sexo masculino. A média de idade dos casos incluídos no estudo foi de 55 anos no momento do diagnóstico. comorbidades como diabetes, hipertensão, tuberculose, etc foram relatados em 27% dos casos e 16% dos casos tinham uma história familiar de câncer, enquanto nenhum dos casos tinham uma história familiar de CRC. A perda de peso foi o sinal mais comum (63%, a média de duração de 6 meses), seguida de dor abdominal (57%, a média de duração de 1 ano) e sangramento pelo reto (50%, a média de duração de 3 meses). Dentre os fatores de estilo de vida, foi mais comumente observada alta ingestão de dieta gordurosa (52%), seguido pela dieta não vegetariana (48%) e alimentos ricos em especiarias (47%) (Tabela 1). O consumo de álcool e tabagismo foram observados em pacientes de 45% e 42%, respectivamente, em nosso estudo. A associação foi ainda mais evidente no caso de pacientes do sexo masculino, onde 60% e 53% dos pacientes tiveram os hábitos acima (os valores de p 0,001 0,001, respectivamente). O perfil bioquímico de todos os pacientes está incluído na Tabela S1. A sobrevida global dos pacientes foi de 94% em 1 ano com um seguimento médio de 2 meses (intervalo de 1-19 meses).
Análise de Kras mutações no códon 12 e 13 no CRC
Considerando o importante papel das proteínas Ras, particularmente Kras na carcinogênese, mutação do gene Kras foi analisado e observado em 47% (29/62) dos casos no códon 12 e em 19% (12/62) dos casos no códon 13 em região do tumor. A mutação também foi observada em 29% 18% regiões de controlo adjacentes e no codão 12 e 13, respectivamente. A ingestão de álcool, tabagismo e ingestão de comida picante foi observada mais frequentemente em pacientes com KRAS mutado códon 12, em comparação com aqueles com KRAS não mutado (59%, 69%, 55% vs. 33%, 18% e 39%, respectivamente) e foi estatisticamente significativa em relação aos hábitos de consumo de álcool e tabagismo (valores de p 0,047, 0,001) (Tabela 2). A maioria dos casos com mutação do gene Kras códon 12 eram característicos de estágio do tumor 3 (52%) e grau histológico moderadamente diferenciado (66%). estágio do tumor e metástases também foram encontrados para ser significativamente associada com a presença de Kras mutantes códon 12 (valores de p 0,018, 0,044). No entanto, a associação do grau do tumor e invasão linfática com Kras mutante não foi estatisticamente significativa (Tabela 3).
Análise de RASSF1A metilação do promotor no CRC
hipermetilação Promotor em RASSF1A gene foi observada em 47% (29/62) dos casos de CRC na região do tumor e em 13% dos controlos adjacentes. Dentre os fatores de estilo de vida, a frequência do consumo de álcool, dieta gordurosa e fumar era mais no caso de pacientes com RASSF1A metilado, em comparação com aqueles com RASSF1A não metilado (55%, 55% e 55% vs. 36%, 49% e 30% , respectivamente) (Tabela 2). Um número significativo de casos com gene metilado RASSF1A teve estágio do tumor 3 (45%) e grau moderadamente diferenciado (59%). estágio do tumor, metástase e invasão linfática significativamente correlacionada com a presença de RASSF1A metilado (valores de p 0,034, 0,044 e 0,048, respectivamente), porém, não houve associação do grau do tumor com RASSF1A metilado (Tabela 3).
Análise de FHIT metilação do promotor no CRC
metilado FHIT em 37% (23/62) dos casos de CRC. FHIT metilação também foi observada nos casos de 13% na região de controlo adjacente. Os pacientes com o gene FHIT metilado tinha uma maior incidência de dieta vegetariana e não gordos, em comparação com o grupo não metilado (61% e 52% vs. 41% e 51%, respectivamente). No entanto, não foi observada associação estatística (Tabela 2). A maioria dos casos com gene FHIT metilado foram estágio do tumor 3 (70%) e moderadamente diferenciado grau histológico (65%). estágio do tumor, metástase e invasão de presença linfático foram significativamente associados com a presença de FHIT metilado (valores de p de 0,001, 0,047 e 0,004, respectivamente). No entanto, não conseguimos observar qualquer associação entre o grau do tumor e FHIT metilado (Tabela 3).
Análise do MGMT promotor metilação no CRC
gene MGMT metilado foi observada em 47% (29/62 ) casos de CRC na região do tumor e em 13% dos casos nas regiões de controlo adjacentes. Além disso, o consumo de tabaco e álcool foi mais vulgarmente relatados por pacientes com o gene MGMT metilado, em comparação com o grupo não metilado (66% e 62% vs. 21% e 30%, respectivamente). A correlação foi particularmente evidente e conclusiva no caso de ingestão de álcool e tabagismo ea presença de metilação MGMT (valores de p 0,013, 0,001) (Tabela 2). Maior número de casos com gene MGMT metilado foram estágio do tumor 3 (52%) e grau moderadamente diferenciado (66%). estágio do tumor, metástase e invasão linfático foram encontrados para ser significativamente correlacionada com a presença do gene MGMT metilado (valores de p de 0,018, 0,044 e 0,048, respectivamente). No entanto, a associação de grau do tumor com o gene MGMT metilado não foi estatisticamente significativa (Tabela 3).
Combinatória Efeito da mutação genética em gene KRAS e epigenética Modificação no RASSF1A, Genes FHIT e MGMT em CRC
em comparação de ocorrência de mutação /metilação de um gene na presença de mutação /metilação de um outro gene, observou-se que os genes tinham a presença combinada de mutação /metilação, na maioria dos casos e os resultados foram considerados estatisticamente significativos (valores de p 0,025, 0,005) (Tabela 4). Apenas 15% (9/62) dos pacientes não mostraram a presença da mutação Kras ou RASSF1A, FHIT e metilação MGMT. Curiosamente, a mutação Kras /RASSF1A, FHIT e metilação MGMT foram mais comuns em pacientes com história prévia de consumo de álcool 89% (25/28), tabaco de mascar 86% (12/14), fumando 96% (25/26), dieta gordurosa 78% (25/32), a administração irregular de frutas 100% (18/18), a ingestão de comida picante 79% (23/29) e dieta não vegetariana 87% (26/30). Além disso, nenhum dos casos foi a presença de mutação /metilação na região de controlo adjacente somente e não na região do tumor. Além disso, uma comparação do perfil clínico com o efeito combinatório de variações nos genes em 62 pacientes com CCR esporádica foi realizada e verificou-se que as características clínicas foram mais frequentemente observados em doentes com o aumento do número de variações dos genes em termos de genética mutação no gene KRAS e /ou a hipermetilação do promotor em MGMT, FHIT e genes RASSF1A em CRC esporádicos (Tabela 5). No geral, o estágio do tumor avançado (97%), doença metastática (100%), moderada a tumores pouco diferenciados (84%) e presença de invasão linfática (92%) foram observados com maior frequência em tumores com Kras mutação (códon 12) e metilado RASSF1A, FHIT e MGMT genes. Além disso, o promotor hipermetilação em RASSF1A, genes FHIT e MGMT significativamente correlacionada com a presença de invasão linfática em contraste com mutação no gene Kras.
Discussão
O desenvolvimento de CRC é uma de várias etapas e modelo amplamente estudado na tumorigênese. mudanças subjacentes no nível genético e /ou epigenética pode estar envolvido no desenvolvimento global da CRC [4], [22]. Estudos recentes têm-se centrado sobre as mutações e padrões de metilação de vários genes implicados no desenvolvimento de CRC. CpG metilação do promotor de ilha para inactivação transcricional pode ocorrer em várias fases do cólon tumorigénese, que afectam diversos tipos de CRC para graus diferentes [23]. Identificar as interacções entre as alterações genéticas e epigenéticas podem ajudar na construção de perfis moleculares de diagnóstico personalizados e especializados eo desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais recentes [4]. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para elucidar o papel da mutação genética no gene Kras e modificação epigenética em RASSF1A, genes FHIT e MGMT no desenvolvimento de adenocarcinomatous CRC esporádica na população indígena.
dos 62 pacientes incluídos no estudo, os sinais e sintomas mais comuns relatados foram perda de peso (63%), dor abdominal (57%) e sangramento pelo reto (50%). Outros estudos também relataram sangramento nas fezes, dor abdominal, diarreia ou prisão de ventre como sinais importantes e sintomas indicativos de CRC [24].
A frequência global de mutação Kras códon 12 e 13 foi de 47% e 19%, respectivamente. A mutação também foi observada em 29% 18% regiões de controlo adjacentes e no codão 12 e 13, respectivamente. Este achado provavelmente aponta para o facto de que, embora a mucosa adjacente era normal e não tumoral em patologia, as alterações moleculares sob a forma de mutação pode já ter sido iniciado nesta região, também. Isto pode, portanto, ser envolvido na propagação da doença e, consequentemente, Kras mutação pode ser considerada como um marcador precoce de identificar a propagação da doença nas áreas adjacentes. Estudos conduzidos pelo mundo têm relatado a frequência da mutação Kras no CRC para situar-se entre 25-60% [25] e os tipos mais freqüentemente observados em mutações são G A transições e G transvers�s T [6]. análise de mutação Kras tornou-se cada vez mais importante no CRC para indicar a terapia de anticorpos anti-EGFR como um marcador preditivo no CRC [26]. Os ensaios clínicos com foco específico sobre este grupo são a necessidade emergente da hora.
Vários estudos apontam os fatores subjacentes e os mecanismos da carcinogênese colorretal e relataram o envolvimento de fatores de estilo de vida, incluindo a ingestão de gorduras, dieta, folato e a ingestão de álcool, no desenvolvimento de CRC [5], [27], [28], [29]. O alto consumo de gordura na dieta também está associada com um risco acrescido de tumores do cólon mutadas Kras [5]. No presente estudo, no entanto, nenhuma associação estatística foi observado e estes achados são suportados por outros [30], [31]. Estudos experimentais sugerem que os subprodutos como o malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal (4-HNE) pode ser construído e armazenado como resultado da peroxidação de 6 V-ácidos gordos poli-insaturados (PUFA), que por sua vez pode reagir com o DNA para formar aductos como aduto pyrimidopurinone de desoxiguanosina (M1G), resultando numa principalmente G a e G transvers�s T em bactérias [5]. É importante mencionar aqui que a incidência de CRC é de forma alarmante aumento na Índia, principalmente devido a alterações nos padrões de estilo de vida. estilo urbano de vida testemunhou a adição de várias modificações nos padrões dietéticos envolvendo aumento da ingestão de alimentos de lixo. Comida caseira está sendo gradualmente substituída por alimentos prontos fáceis de preparar. Frutas, vegetais e especiarias contendo quantidades aumentadas de ácido salicílico ter sido demonstrado que têm um efeito anti-cancro por meio da sensibilização das células normais para evadir a formação de tumor [32]. No entanto, a adulteração em especiarias e aumento da utilização de produtos químicos no processo de maturação artificial e crescimento de frutas e legumes diminuiu o potencial anticancerígeno destes alimentos. Magalhães et al [33] relataram que o risco de cancro do cólon aumentou com alta ingestão de carne vermelha e processada, mas nenhuma associação significativa foi observada com câncer retal. Tem sido sugerido que G4A transições na segunda base do codão 12 ou 13 do gene Kras no cólon humano pode ser devida aos compostos N-nitrosos, presente em carne processada de forma endógena ou formado [34]. aminas aromáticas heterocíclicas (AIH) poderia ser formado devido à alta temperatura de cozimento das proteínas da carne enquanto grelhar e fumagem de carne gera hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), como resultado de deixar cair a gordura em chamas [28]. Shin et al sugeriram o papel de tabagismo e consumo de álcool em carcinogênese colorretal. foi encontrado O tabagismo para conferir um maior risco de adenomas avançados e 3 ou mais adenomas do que para um único risco, ou adenomas individuais [35]. mecanismos biológicos potenciais para esta associação incluem a ação carcinogénico dos hidrocarbonetos aromáticos polinucleares (PAHs), nitrosaminas e aminas aromáticas, quer presentes em, ou produzidos por, tabaco [36] queima. Várias formas têm sido sugeridos para o efeito do álcool sobre o risco para CRC incluindo acetaldeído, um produto de oxidação do álcool [37]. Também tem sido observado que o acetaldeído microbianamente produzido a partir do etanol pode aumentar o risco de cancro do cólon através de deficiência de folato [38]. O álcool é um antagonista do metabolismo metil-grupo e podem contribuir para a metilação de ADN anormal ou pode aumentar o risco para CRC indirectamente através da supressão imunitária, atraso de reparação do ADN, a activação de pró-carcinogéneos do fígado por indução do citocromo enzimas P-450, ou alterações na bílis composição de ácido [39]. No presente estudo, a ingestão de álcool e tabagismo foram relatados em 45% (28/62) e 42% (26/62) dos casos, respectivamente. A associação era particularmente evidente no caso de pacientes do sexo masculino, onde 60% e 53% dos pacientes tinham esses hábitos e está de acordo com os achados de Cho et al [40].
As regiões promotoras dos genes supressores de vários tumores contêm ilhas de CpG e pode estar envolvida no silenciamento de genes por metilação do [22]. promotor RASSF1A metilação foi observada em 47% dos casos. Outros autores relataram a frequência de mehylation RASSF1A entre 16-81% dos casos no CRC [41], [42]. Tem o potencial para ser um biomarcador cancro ideal, que ocorre numa ampla gama de tipos de tumores e comparativamente não amplamente observados nos tecidos normais [10]. RASSF1A metilação também foi observado em apenas 8 casos na mucosa normal, sugerindo que o evento de metilação pode ter sido provavelmente iniciada na região adjacente também. Atuais e formadores de fumantes têm sido demonstrado que têm uma maior incidência de metilação RASSF1A ea incidência é ainda maior em tumores de um grau superior, fase posterior e os tumores mais invasivos ou metastáticos [10]. No presente estudo, 42% dos pacientes tinham uma história de fumar. Alguns estudos têm sugerido uma correlação inversa entre a metilação RASSF1A e mutação Kras no CRC [43]. Não é certo como RASSF1A afeta seu comportamento biológico, apesar da sua interacção directa /indirecta com Ras activada. No entanto, o nosso estudo mostrou uma sinergia entre estes dois genes que podem simplesmente enfatizam a importância de uma série de genes envolvidos na via de sinalização.
Foi observada
promotor FHIT metilação em 37% dos casos. promotor FHIT hypermehylation foi detectada em 20-71% dos casos em CRC por apenas dois autores [44], [45]. Sultana et ai sugeriram que o gene FHIT pode estar envolvido na etiologia de vários outros cancros do que o cancro cervical, no entanto, os dados de suporte é escasso [46]. Apesar de splicing alternativo de FHIT humano não está diretamente associada à carcinogênese, FHIT pode ser inactivado com freqüência por salto de exon, retenção de intron, e ativação do local de união enigmática dentro do exão 6 em CRC [47]. A expressão anormal do gene supressor de tumor FHIT candidato foi observada numa variedade de tumores humanos, mas pouco se sabe sobre a sua expressão durante a tumorigénese colorectal. Um estudo do Reino Unido mostrou expressão reduzida de FHIT numa pequena proporção de lesões pré-cancerosas do cólon e no aumento da proporção de cancros colorectais primários e metastáticos que sugerem que FHIT desempenha um papel no desenvolvimento e progressão de algumas carcinomas do cólon [48]. Nosso estudo recente demonstrou nova mutação missense no gene FHIT e interpretou o efeito no cancro do colo do útero mediada por HPV em mulheres indígenas [49].
promotor MGMT metilação foi observada em 47% dos casos no presente estudo. MGMT hypermehylation promotor foi detectada em 20-41% dos casos em CRC [8], [25], [50]. Além disso, a perda de MGMT foi encontrado para ser associada com mutações em Kras [14]. Sidhu et al [13] mostraram que a incidência de hipermetilação MGMT é significativamente maior entre os indivíduos com história de tabagismo, alcoolismo e ingestão de alimentos não-vegetarianos entre os casos de câncer de próstata, controles e pacientes com hiperplasia prostática benigna. Observou-se que o tabagismo (66%) e ingestão de álcool (62%) foram os fatores de estilo de vida mais comuns observados em pacientes com hipermetilação MGMT. hipermetilação MGMT têm sido provado ser preditores úteis de prognóstico e resposta em cancros gástricos e gliomas malignos [51], [52].
Brink et al [6] e Cejas et al [53] não revelaram associação estatística entre o estágio do tumor e metástases com a mutação Kras. No entanto, nossos resultados são concordantes com o observado por Mannan A [54], onde eles descobriram que mutações no KRAS estão significativamente associados com metástases em linfonodos e estágio do tumor, mas não com o padrão de crescimento de carcinomas do cólon. Kras mutações podem ser significativamente envolvido no desenvolvimento biológico da doença, por conseguinte, afectar o seu comportamento geral e a capacidade de resposta.
Com base nos resultados, a presença de combinatória Kras mutados (codão 12) e RASSF1A metilado, e MGMT FHIT genes melhor caracterizar estágio avançado do tumor, a doença metastática, tumores de grau superior e presença de invasão linfática do que quando considerados separadamente. A ocorrência conjunctional de mais do que uma variação pode actuar sinergisticamente para afectar a agressividade da doença e iniciar a formação de tumores nesses locais. Estas variações genéticas e epigenéticas trabalhar em uníssono para decidir o destino global da doença. Não está claro como a que ocorrer primeiro, hipermetilação DNA ou mutação genética. Em lesões cancerosas, a barreira de controle da propagação de metilação de ADN da região do promotor para o local de transcrição é abreviado, por conseguinte, desempenham um papel crítico no desenvolvimento do tumor, iniciação e progressão.
na sobrevivência Comparações entre o tipo selvagem /grupo não metilado vs. grupo mutante /metilado foram realizados, mas não foram estatisticamente significantes (p 0,05). Isto pode ser devido aos curtos seguem-se os dados e o facto de apenas um evento (morte) ocorreu entre o grupo de pacientes incluídos no estudo.
Tomados em conjunto, os dados demonstraram que a fase do tumor 3, moderadamente diferenciadas tumores, presença de invasão linfática e ausência de metástase foram observados com maior frequência em tumores com mutação Kras e RASSF1A metilado, FHIT e genes MGMT. Assim, estes marcadores podem ser usados na avaliação do estado patológico global da doença para a segmentação melhor este grupo heterogéneo de tipos de cancro. Em conclusão, a mutação genética no gene Kras e modificação epigenética em RASSF1A, genes FHIT e MGMT em CRC esporádicos estão associados com o desenvolvimento global da doença e podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico ou de prognóstico neste grupo de cânceres. A inter-relação sinérgica entre os fatores genéticos e epigenéticos em tumorigênese colorretal pode ajudar a melhorar a abordagem geral para esta doença.
Informações de Apoio
Tabela S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0060142.s001
(DOC)
Reconhecimentos
Os autores gostariam de agradecer a todos os pacientes e seus familiares para o apoio ea cooperação . Além disso, gostaria de reconhecer Rajiv Gandhi Institute Centro de Investigação, Delhi, India para fornecer as amostras biológicas e informação clínica e Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Nova Deli, Índia e Instituto de Citologia Oncologia Preventiva (ICMR), Índia para fornecer as principais infra-estruturas instalações e financiamento institucional.