Abstract

Fundo

Vimentin é um filamento intermediário mesenquimais onipresente apoiando a integridade mecano-estrutural das células quiescentes enquanto participava de adesão, migração, sobrevivência e sinalização celular processos via conjunto dinâmico /desmontagem em células activadas. sarcomas de tecidos moles e alguns cancros epiteliais exibindo “epitelial para mesenquimal” fenótipos expressam vimentina. Withaferin-A, um composto bioativo derivado naturalmente, pode molecularmente alvo vimentina, por isso, procurou-se avaliar os seus efeitos sobre o crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

elucidando assim o papel da vimentina em drogas respostas induzidas.

métodos e resultados

Withaferin-a induziu apoptose marcada e decote vimentina em células tumorais que expressam vimentina, mas significativamente menor em células mesenquimais normais. Esta resposta pró-apoptótica foi anulada após knockdown vimentina ou por bloqueio da degradação vimentina induzida por caspase através de inibidores de caspases ou sobre-expressão de vimentina caspase-resistente mutado. Foram demonstrados efeitos pronunciados anti-angiogénicos de Withaferin-A, apenas com efeitos mínimos visto em células endoteliais não proliferativas. Além disso, Withaferin-A bloqueou significativamente o crescimento de tecidos moles sarcoma, recorrência local e metástases em um painel de tecidos moles experimentos sarcoma de xenotransplante. Apoptose, diminuição da angiogênese, e degradação vimentina foram todos vimos em amostras tratadas Withaferin-A.

Conclusões

Em função destes resultados, a avaliação da Withaferin-A, seus análogos, ou outro anti- abordagens terapêuticas vimentina em sarcoma de tecido mole e “epiteliais para mesenquimal” contextos clínicos é justificada

Citation:. Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, Bolshakov S, Liu J, et al. (2010) Vimentin é um romance Anti-Cancer Terapêutica alvo; Insights de

In Vitro

e

In Vivo

Mice heteróloga de Estudos. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10.1371 /journal.pone.0010105

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Setembro, 2009; Aceitou: 3 de março de 2010; Publicação: 16 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Lahat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela CA138345 NCI /NIH R01 subvenção (a DL) e uma subvenção de sementes Fundação Amschwand Sarcoma Cancer (a sudoeste). A caracterização linha celular MD Anderson Cancer Center e citogenéticas Instalações núcleo são ambos suportados por uma Grant Suporte NCI Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Composta por mais de 50 subtipos histológicos, sarcoma dos tecidos moles (STM) podem ser classificados em dois grandes grupos: aqueles com alterações genéticas específicas (translocações ou mutações pontuais) e cariótipo relativamente simples, e aqueles com complexo, aneuplóide desequilibrada cariótipos [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Uma melhor compreensão das aberrações moleculares dirigir o início e progressão de vários subtipos STS que pertencem ao primeiro grupo (por exemplo, mutações de c-kit em tumores estromais gastrointestinais [GIST] ou a 17; translocação 22 levando a PDGF-B sobre-expressão em dermatofibrossarcoma protuberante; [DFSP]), resultou em aplicações clínicas de terapias específicas eficazes (por exemplo, mesilato de Imatinib) com significativa melhoria do resultado [6]. Tais avanços terapêuticos são muito encorajadores e destacar a necessidade de identificar outros alvos moleculares novos em subtipos STS adicionais

A maioria dos STS pertencem ao segundo grupo abrigando cariótipo aneuploides.; este grupo consiste principalmente de histiocitoma fibroso maligno (HFM, também denominado sarcoma pleomórfico [UPS] não classificados), leiomiossarcomas, tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNST) e lipossarcoma indiferenciadas ou pleomórficas. Enquanto apresentação e doença manifestações clínicas variam de acordo com o subtipo histológico específico, como um todo, esses STS cariótipo complexos têm um prognóstico sombrio, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 50%. Apesar do controle inicial local (alcançado por cirurgia com ou sem radioterapia), a recorrência local e disseminação sistêmica comumente ocorrem ea falta de opções terapêuticas eficazes nestes cenários clínicos é o principal problema não resolvido na STS. Em contraste com a simplicidade genética de STS no primeiro grupo, a diversidade biológica e molecular de STS cariótipo complexos limita acentuadamente a identificação de aberrações únicos e específicos “vício oncogénica”. Embora desafiador, elucidando novas terapias que possam ter utilidade para uma ampla gama de STS cariótipo complexas é crucial.

Desde 1960 adiantados, plantas e micróbios têm rendido vários derivados naturalmente, pequenas moléculas úteis, orgânico que possua anti-câncer propriedades [7], [8], [9], [10].

somnifera

(ashwagandha) é uma planta medicinal utilizada na medicina tradicional indiana para tratar um amplo espectro de doenças [11], [12], [13], [14], [15]. Withaferin-A (WFA), um C-28-type ergostano lactona esteróide altamente oxigenado, é um composto bioativo isolado do

somnifera

. WFA exibe diversas atividades farmacológicas, incluindo anti-inflamatórios, efeitos imunomoduladores e antiangiogênicos [15], [16], [17], [18]. Várias linhas de evidência sugerem que o FPA tem propriedades anticancerosas, que se manifesta por direccionamento directamente células tumorais e, indirectamente, impedindo neovasculatura [associado a tumores [19], [20]. Estudos recentes têm mostrado que a WFA suprime o crescimento da mama e cancro da próstata células humanas ‘

in vitro

e

in vivo

induzindo a apoptose marcada [19], [21], [22]. -Induzida FMA do citoesqueleto arquitectura alteração [23], [24], [25], geração de espécies de oxigénio reactivo [26], [27], disfunção mitocondrial [26], e a inibição proteossomal [21], também têm sido sugeridos. As células normais, não tumorigénica foram encontrados para ser mais resistente do que as células de tumor à apoptose induzida por FPA [22]; seletividade para células malignas, poupando as células normais é uma característica altamente desejável de potenciais agentes terapêuticos anti-câncer.

Os mecanismos exatos da ação WFA não foram conclusivamente definida. Vários alvos moleculares têm sido propostos, incluindo o factor de transcrição NF-kB [28], [29]; a molécula de sinalização AKT [27]; as moléculas pró-apoptóticos PAR-4, FOXO-3, e Bim [22]; e os proteossomal β5 quimotripsina da subunidade [21]. Um estudo recente utilizou uma abordagem química e genética proteomic investigação [30], em que um análogo de FMA biotinilado foi utilizado como uma sonda para puxar para baixo WFA parceiros de ligação em células endoteliais. Esta estratégia conduziu à identificação de vimentina, um filamento intermediário do tipo III, como novo substrato FPA. Além disso, vimentina WFA-modificado foi encontrado para provocar efeitos pró-apoptóticos e anti-angiogénicos significativas, enquanto que knockdown vimentina resultou numa diminuição da sensibilidade WFA. Estas experiências oferecer uma visão sobre a atividade WFA e destacar a utilidade potencial de vimentina como um novo alvo anti-câncer terapêutica.

STS são mesenquimal e, portanto, todos expressam vimentina, independentemente do seu tipo histológico. Consequentemente, é plausível que as estratégias terapêuticas anti-vimentina pode provocar efeitos anti-STS em uma ampla gama de STS. Essa hipótese nos levou a determinar o impacto da WFA em STS cariótipo complexas

in vitro

e

in vivo

. Usamos linhas de células humanas representando leiomiossarcoma, MPNST, fibrossarcoma e UPS /lipossarcoma pleomórfico para avaliar o impacto de vimentina na sensibilidade WFA. Os nossos resultados sugerem que o STS são altamente sensíveis a FPA, um efeito que é muito mais pronunciada do que em cancros epiteliais vimentina-negativo. FPA induz uma degradação dependente de caspase de vimentina, resultando em apoptose independente de anoikis marcada e os efeitos anti-angiogénicos STS-associados. Os resultados suportam a avaliação da WFA ou seus análogos como estratégia clínica nova para pacientes portadores destas doenças devastadoras.

Resultados

células do Sarcoma são altamente sensíveis a WFA

Para avaliar o efeito da WFA em STS cariótipo complexo foi selecionado um painel de linhas celulares STS humanos representando fibrosarcoma (HT1080), leiomiossarcoma (SKLMS1), MPNST (STS26T), e alto grau pleomorphic sarcoma /lipossarcoma (PLS-1). Esta linha de células último foi recentemente criado em nosso laboratório (ver Dados S1 e Figura S1 para mais detalhes). O tratamento das células acima com FMA resultou numa diminuição significativa do número de células fixadas e marcadas alterações morfológicas, incluindo células-arredondamento e condensação nuclear (Figura 1A). Os efeitos de FMA ocorreu tão cedo quanto 2 horas após o início do tratamento e foram dose e dependente do tempo (Figura S2). ensaios de crescimento celular, demonstrou uma redução induzida por FPA, dependente da dose, no crescimento de células STS (Figura 1B). A média ± DP FPA IC

50 valores (após 24 h de tratamento) foram registadas como 0,4 uM ± 0,07, 0,41 M ± 0,03, 0,37 uM ± 0,12, e 0,53 uM ± 0,1, para HT1080, SKLMS1, STS26T, e PLS -1, respectivamente. De modo semelhante, doses baixas de FPA (0,5 uM) inibiu marcadamente a capacidade de formação de colónias de células STS (Figura 1C). Finalmente, o efeito de FMA em STS crescimento independente da ancoragem foi investigada. Todas as células STS avaliados demonstraram uma capacidade para crescer em agar mole; este crescimento foi anulada após 24 h de tratamento FPA (0,5 uM) (Figura 1D). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que as células STS humanos são altamente sensíveis aos efeitos inibidores do crescimento de WFA.

A)

tratamento WFA (1? M /24 h) resulta em alterações morfológicas marcados, incluindo células de arredondamento e condensação nuclear, em células STS;

B)

MTS ensaios demonstram uma diminuição induzida por FPA, dependente da dose, no crescimento de células STS;

C)

WFA (0,5? M /24 h) inibe marcadamente STS colónia de células capacidade de formação de medida após dez dias;

D)

WFA (0,5? M /24 h) anula STS crescimento celular independente de ancoragem medida após três semanas. Gráficos representam a média de três experiências repetidas ± SD.

WFA induz a apoptose marcada em células STS mas menos apoptose em fibroblastos humanos normais e células miogênicas

Para avaliar o efeito da WFA em STS sobrevivência celular, realizamos análises de anexina V /FACS. STS células foram tratadas com concentrações crescentes de FPA (0-5? M) durante 4 h e 24 h; uma indução significativa da apoptose era aparente mesmo dentro do curto espaço de tempo, especialmente quando foram usadas doses elevadas ( 2,5? M, P 0,05; Figura 2A). Um aumento da dose e dependente do tempo na apoptose de células de tumor foi observada em todas as células testadas. indução de apoptose também foi refletido no aumento observado na caspase 3 e clivagem PARP activada (análise de Western blot [WB]; Figura 2B)

A)

anexina-V /FACS análises que demonstrem marcada. apoptose WFA-induzida em células STS (barras pretas representam 4 h de tratamento WFA e barras cinzentas representam 24 h);

B)

WFA (1? M /24 hr) induz clivagem e PARP activação Casp-3) em células STS caspase-3 ((análise WB);

C)

células STS são resistentes a anoikis, em comparação com fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). FPA (1? M /24 h) induz a apoptose em ambas as células ligadas e STS flutuantes;

D)

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) fotografias retratando STS apoptose celular (grande condensação seta-nuclear, pequena formação de bolhas seta-citoplasmática) em resposta a WFA. A necrose é demonstrada em células STS flutuante;

E)

NHDF são mais resistentes aos efeitos de FPA (IC50: 3,7 ± 0,15 uM) em comparação com células STS. Gráficos representam a média de três experiências repetidas ± SD.

Em seguida, avaliamos se a apoptose induzida por WFA poderia ser atribuída à perda de células tumorais de aderência e descolamento da placa de cultura, resultando em anoikis. fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) foram submetidos a apoptose significativa quando cultivadas em suspensão, enquanto que as células resistentes a STS foram anoikis e nenhum aumento significativo na apoptose pode ser observado (Figura 2C). WFA apoptose de ambas as células STS anexados e flutuantes reforçada.

apoptose induzida por WFA foi ainda confirmada através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Sinais de apoptose, incluindo a condensação da cromatina e encolhimento citoplasma, foram evidentes dentro de 4 h. Após 24 h, foi observada marcada apoptose, juntamente com a perda da membrana nuclear e vesiculação citoplasmática; estes efeitos foram observados em ambas as células STS anexados e flutuantes. Flutuantes células necróticas STS também foram observados (~20-30% das células flutuantes totais).

Por último, foi avaliado o efeito da WFA em células mesenquimais normais (Figura 2E e S3). As culturas primárias de células humanas e NHDF musculares lisas intestinais (HISMC) foram tratados com doses crescentes de FPA durante 24 h. Contrariamente às nossas observações em células STS, diminui no número de células e alterações morfológicas foram evidentes por microscopia somente após altas doses de WFA ( 2,5 m). Média ± SD WFA IC

50 valores foram de 3,7 mM ± 0,15 e 3,2 mM ± 0,21 para NHDF e HISMC, respectivamente. Estes valores foram mais do que 9 vezes maiores que os observados em células de STS. Da mesma forma, FMA induziu uma taxa significativamente mais baixa de apoptose nestas células normais (P 0,05). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o FPA é um composto pró-apoptótica potente. células STS são altamente sensíveis a WFA, enquanto as células mesenquimais normais são mais resistentes aos seus efeitos.

WFA anula a migração de células STS e invasão

A seguir, avaliou o efeito da WFA sobre a migração celular STS e invasão. células STS foram pré-tratados com doses baixas de WFA (0,5 mM) durante 4 h, altura em que WFA foi lavado com cuidado e uma ferida zero ensaio de cura foi conduzida. Observou-se uma diminuição acentuada na migração (Figura S4A). Além disso, câmaras de Boyden modificadas foram usadas para quantificar o efeito da WFA sobre migração e invasão. STS células foram pré-tratados com uma dose baixa de FPA (0,5 ^ M) durante 4 h. Após a interrupção da WFA, as células foram lavadas e contadas; apenas as células viáveis ​​foram ainda utilizados. FPA migração significativamente inibida e invasão em todas as células STS examinados (P 0,05; Figura S4B).

Uma limitação potencial para estas experiências é que o impacto demonstrado pode reflectir os efeitos anti-apoptóticos ou inibidores do crescimento de FMA em vez de seus efeitos diretos sobre a motilidade e /ou invasão. Para abordar esta possibilidade, em conjunto com as experiências anteriores, que pré-tratados células STS com uma dose baixa de FPA (0,5? M durante 4 h) ou DMSO (controlo); com a interrupção da FPA, as células foram lavadas e contadas, e as células viáveis ​​foram re-plaqueadas. Contando celular no final do experimento revelou apenas uma ligeira diminuição ( 10%) no número de células viáveis ​​tratadas com FPA relativos ao número de células tratadas com controlo (dados não apresentados). Juntos, esses resultados sugerem que a WFA anula motilidade celular STS e invasão.

WFA induz a degradação vimentina e vimentina knockdown diminui a sensibilidade das células de WFA

Um recente vimentina identificados estudo como o alvo molecular WFA possível [30]. Portanto, avaliamos o efeito da WFA sobre a expressão e degradação vimentina. FPA tratamento resultou em níveis de vimentina de comprimento total diminuiu e aumento da expressão de produtos de degradação da vimentina em todas as células STS testados (Figura 3A). efeito WFA em vimentina é a dose e dependente do tempo; altas concentrações de WFA resultar na clivagem vimentina depois de apenas 4 horas de tratamento, enquanto a degradação vimentina é percebida após 24 h com doses mais baixas.

A)

tratamento WFA (5? M /4 h) Os resultados em níveis diminuídos de comprimento completo (FL), vimentina e expressão aumentada de produtos de degradação vimentina (VDP) em todas as células testadas STS. Um efeito dependente da dose nas células FPA SKLMS1 tratados durante 4 h é também mostrada. clivagem vimentina é notado secundária a baixas concentrações WFA após 24 h de tratamento;

B)

anti-vimentina SmartPool siRNA (20 nM) provoca uma diminuição marcada na expressão de vimentina em células SKLMS1 (WB). Vimentina knockdown substancialmente blocos FPA-induzida (1 pM /24 horas) a apoptose;

C)

vimentina endógena foi batido pela primeira vez no células SKLMS1 usando anti-vimentina antisense oligômeros fosforodiamidato morfolino. Depois de knockdown, vimentina foi vigorosamente re-expressos nas células (BM). Semelhante aos resultados de siRNA knockdown, anti-vimentina oligómeros morfolino bloqueia significativamente FPA-induzida (1 pM /24 horas) de apoptose. Re-expressão de vimentina restaura a sensibilidade SKLMS1 a WFA;

D)

células STS (SKLMS1 e PLS1) expressam níveis significativamente mais elevados de vimentina solúvel, em comparação com células mesenquimais normais (células de músculo liso: HA-SMC e HC-SMC e fibroblastos: NHDF). (NT siRNA = non alvo siRNA, Vim siRNA = anti-vimentina siRNA SmartPool; NT morfolino = non segmentação morfolino; Vim KD = vimentina knockdown)

Para determinar se o efeito da WFA em células STS é pelo menos parcialmente mediadas através vimentina, que optou por usar uma abordagem vimentina knockdown. Anti-vimentina SmartPool siARN provocou uma redução substancial na expressão de vimentina em células SKLMS1 (WB; Figura 3B). Vimentina knockdown

per se

não induziu apoptose significativa em células STS, em comparação com a simulação ou não-alvo transfecção siRNA. Como seria de esperar de acordo com as experiências acima, o tratamento FMA resultou em apoptose significativa em células transfectadas simuladas siRNA e não segmentação. No entanto, vimentina knockdown bloqueou substancialmente a apoptose induzida por FPA. Juntos, estes dados sugerem que a degradação vimentina induzida WFA é necessária para efeito terapêutico melhorado.

Para confirmar o papel potencial da vimentina na apoptose induzida por WFA, foi utilizada uma abordagem experimental de resgate. vimentina endógena foi batido pela primeira vez no células SKLMS1 usando anti-vimentina antisense oligômeros fosforodiamidato morfolino. Estes morpholinos alvo vimentina pré-ARNm, permitindo assim a re-expressão de vimentina forçado por transfecção de uma construção de vimentina resistente à presença contínua dos oligómeros morfolino. Depois de knockdown, vimentina foi vigorosamente re-expressos nas células (WB, Figura 3C); As células foram tratadas com FMA ou DMSO como controlo e submetido a análise de anexina V /FACS. Semelhante aos resultados de siRNA knockdown, tratamento anti-vimentina oligómeros morfolino bloqueou significativamente a apoptose induzida por FPA. Re-expressão de vimentina restaurado sensibilidade SKLMS1 a WFA (Figura 3C).

Tanto as células STS e células mesenquimais normais expressam vimentina. No entanto, como mostrado na Figura 2, FMA induz efeitos pró-apoptóticos em células mais significativas STS em comparação com células normais (isto é, fibroblastos mesenquimais e células do músculo). Os dados publicados anteriormente descritas (30) identificou WFA para vincular a vimentina tetramérica, solúvel. Assim, buscou-se avaliar os níveis dessa fração vimentina em células STS vs. normais. Tal como mostrado na Figura 3D, as células tumorais expressam níveis significativamente mais elevados de vimentina solúvel, livre, em comparação com células mesenquimais normais. Essa descoberta oferece uma possível explicação para os nossos efeitos diferenciais observados WFA.

degradação vimentina induzida WFA é dependente de caspase

Vimentin degradação comumente ocorre através da activação da via caspase. Para avaliar se a degradação induzida por vimentina FPA é um resultado da clivagem de caspase, que pré-tratados com STS Z-VAD (Promega, Madison, WI), um inibidor da pan-caspase, antes da terapia de FPA (durante 24 h). Z-VAD pré-tratamento resultou numa diminuição da degradação da vimentina em conjunto com níveis inferiores tanto de caspase-3 clivada e PARP activada (Figura 4A). Além disso, o pré-tratamento de Z-VAD revogada significativamente a apoptose induzida por FPA (após 24 h de tratamento FMA) em células STS (Figura 4B). Em seguida, depois de vimentina knockdown usando oligos morfolino, células SKLMS1 foram transfectadas para expressar, quer de tipo selvagem vimentina ou vimentina mutado em locais de clivagem de caspases (D85N e D259N). FPA (1 uM) induziu apoptose significativa em células transfectadas vimentina de tipo selvagem em que foram observadas vimentina degradação e a activação de caspase-3 (Figura 4C). No entanto, observou-se uma diminuição significativa na apoptose induzida por WFA em células que expressam o vimentina mutado, e percebemos uma diminuição dramática em ambos degradação vimentina e ativação da caspase-3 (Figura 4C). Tomados em conjunto, estes dados sugerem um possível ciclo vicioso induzido WFA, em que WFA ligação a vimentina provoca a sua degradação por caspases e disse que os resultados de degradação na ativação caspase adicional e apoptose.

A)

Pretreatement (4 h) de células com SKLMS1 resulta na diminuição induzida por FPA (24 h) a degradação vimentina em conjunção com os níveis mais baixos de ambos PARP clivada da caspase-3 e activado Z-VAD (um inibidor da pan-caspase);

B)

Z-VAD (4 h) pré-tratamento revoga significativamente induzida WFA) apoptose (24 h em células SKLMS1;

C)

Vimentin derrubado células SKLMS1 foram transfectadas para expressar, quer de tipo selvagem vimentina ou vimentina mutado em locais de clivagem de caspases (D85N e D259N). FPA (1? M /24 h) induz a apoptose em células acentuada vimentina transfectadas de tipo selvagem em que a degradação e vimentina activação de caspase-3 pode ser detectado (BM). Contudo, um decréscimo significativo na apoptose induzida em células que expressam FMA a vimentina mutado, é notado, bem como um decréscimo na degradação tanto vimentina e a activação de caspase-3. (WT Vim = tipo selvagem vimentina; Mut Vim = vimentina mutante; Vim FL = vimentina corpo inteiro, produtos VDP = degradação vimentina)

WFA induzida por desregulamentações moleculares são, ao menos em parte, mediada por vimentina

Vários mecanismos moleculares foram anteriormente propostos para subjacentes WFA efeitos anti-tumorigénica, incluindo a inibição da fosforilação de AKT [27], ab-rogação da função de NF-kB [20], [31], e a inibição directa proteossomal [21] . Em primeiro lugar, procurou avaliar se essas desregulamentações moleculares ocorrem em células STS em resposta ao tratamento WFA. Observou-se uma diminuição FPA dose e dependente do tempo nos níveis de pAKT, mas não os níveis de Akt total, em células STS (Figura 5A). Do mesmo modo, uma diminuição dependente da dose no NF-kB (p65) foi também demonstrada, embora este decréscimo ocorreu apenas após 24 h de tratamento. a actividade de NF-kB, por outro lado, foi mostrado que devem ser inibidas cedo após o tratamento, sugerindo que outros diminuíram a expressão de proteína de NF-kB que afectam a actividade de NF-kB mecanismos. Além disso, encontramos uma dose marcada e acumulação dependente do tempo de proteínas ubiquitinated, apoiando a inibição proteossomal induzida WFA nestas células.

A)

tratamento WFA induz uma dose e tempo – dependente na pAKT sem efeito sobre AKT total. Do mesmo modo, uma diminuição dependente da dose, na expressão de proteína de NF-kB (p65) também é visto, embora esta diminuição ocorre apenas após 24 h de tratamento. a actividade de NF-kB em células PLS1, como representado nos gráficos representando os resultados do ensaio de luciferase repórter, é mostrada a ser inibida cedo após o tratamento (4 horas). Uma dose acentuada e dependente do tempo de acumulação de proteínas ubiquitinadas também é mostrado;

B)

Vimentin knockdown em células SKLMS1 anula WFA (2,5? M /24 h) induzida inibição pAKT, diminuição da proteína NF-kB, e aumento dos níveis de ubiquitinação de proteínas. Da mesma forma, os blocos de vimentina knockdown FPA (1? M /4 h) induzida por diminuição da actividade de NF-kB. Gráficos representam a média de três experiências repetidas ± SD.

Nossos resultados sugerem um papel fundamental para vimentina em resposta das células de WFA. Assim, buscou-se avaliar se os efeitos da WFA sobre estes diversos caminhos podem, pelo menos em parte, mediada através vimentina. SKLMS1 células foram transitoriamente transfectadas com anti-vimentina de siRNA ou não segmentação de siRNA e, em seguida, tratada com FMA. Vimentina knockdown revogada WFA induzida por inibição pAKT, diminuição de proteínas e atividade bloqueio NF-kB, e aumento dos níveis de ubiquitinação de proteínas (Figura 5B). Estas experiências fornecem mais evidências de que os efeitos da WFA são mediadas através de vimentina e destacar novas funções potenciais vimentina.

WFA induz a apoptose em células endoteliais cultivadas em STS-condicionado media

De forma análoga ao tumores sólidos, STS consistem em ambas as células normais de tumor associado a tumores e; crescimento STS, migração e disseminação dependem de cross-talk entre os dois compartimentos. STS são geralmente altamente vascular e angiogénico, resultando em aumento do potencial metastático. Dados anteriores sugerem que WFA pode abrigar propriedades antiangiogênicas [17], [30]. Para expandir ainda mais estas observações iniciais e avaliar os potenciais efeitos anti-angiogénicos de FMA no contexto do microambiente STS, foi avaliado o efeito de FMA em células endoteliais cultivadas em meio de controlo normal (sem factores angiogénicos, imitando células endoteliais quiescentes) e em células endoteliais cultivados em meio STS-condicionado (CM; imitando proliferação de células endoteliais angiogénicos). Utilizou-se tanto endotelial humana (HDMEC) e células endoteliais de murino (LEC) e observou-se uma inibição do crescimento induzida por FPA significativamente maior em células endoteliais cultivadas em STS-CM do que no meio de controlo (média ± DP FPA IC

50: 0,42? M ± 0,16 vs. 1,4 ± 0,04 uM em HDMEC e 0,38 ± 0,09 | iM vs 2,3 ± 0,1 ^ M em LEC; P 0,05, Figura 6A). Da mesma forma, FMA induzida níveis mais elevados de apoptose em células endoteliais cultivadas em STS-CM do que no meio de controlo (Figura 6B).

A)

uma taxa significativamente mais elevada do FPA-induzida (24 h inibição do crescimento) é visto em células endoteliais (células da derme humana-HDMEC microvasos endoteliais e endoteliais de pulmão de murino células-LEC) cultivadas em STS meio condicionado (CM) do que no meio de controlo normal (RM);

B)

FPA (1? M /24 h) induz níveis mais elevados de apoptose em células endoteliais cultivadas em STS-CM do que no meio de controlo;

C)

WFA (1? M /24 hr) induz significativamente maiores taxas de degradação vimentina e ativação da caspase-3 em células endoteliais cultivadas em STS-CM do que em células endoteliais quiescentes;

D)

WFA (1 M) anula a migração e invasão de células endoteliais cultivadas em STS-CM;

E)

WFA (2 mg /kg) resulta em uma diminuição significativa no número médio de (vermelho) vasos sanguíneos CD31-positivas em relação ao tratamento controle DMSO em um

in vivo

ensaio gelfoam . CD-31 (vermelho) /TUNEL (verde) coloração dupla revela a apoptose de células endoteliais em ratinhos tratados com WFA. Os gráficos representam a média de três experiências repetidas ± DP. (Vim FL = vimentina comprimento total; produtos de degradação = vimentina VDP)

As células endoteliais são mesenquimais de origem e, portanto, expressam vimentina, para que avaliaram o efeito da WFA sobre a expressão de vimentina e clivagem em ambos os meios regulares e STS-CM. Curiosamente, FMA induzida significativamente maiores taxas de degradação vimentina e a activação de caspase-3 em células endoteliais cultivadas em STS-CM que nas células endoteliais quiescentes (Figura 6c). Em seguida, avaliou-se o efeito da WFA sobre a migração de células endoteliais e invasão. Semelhante à abordagem experimental descrito anteriormente utilizadas com as células STS, utilizou-se células endoteliais viáveis ​​pré-tratados com a curto prazo FPA (4 h), em ensaios de câmara de Boyden modificado. Como antecipado, STS-CM melhorada de migração de células endoteliais e invasão. Mais importante, WFA revogada migração e invasão de células endoteliais cultivadas em STS-CM, mas não daqueles cultivadas em meio normal (Figura 6D).

Por último, para confirmar que o efeito antiangiogênico observado WFA ocorre

in vivo

bem, foi realizada uma Gelfoam esponjas Gelfoam ensaio angiogênese foram incubadas em STS-CM e implantados subcutaneamente nos flancos de ratinhos SCID. Dois dias após o implante, os ratinhos foram tratados com injecção i.p. FPA (2 mg /kg; n = 4) ou DMSO (n = 4), durante 10 dias consecutivos; no final do estudo, os Gelfoams foram excisadas e submetidas a análise de IHC (Figura 6E). FPA tratamento resultou numa redução significativa no número médio de vasos sanguíneos CD31-positiva em comparação com o tratamento de controlo de DMSO (41 ± 7,2 vs 5,3 ± 6, respectivamente; P 0,05). CD-31 /TUNEL dupla marcação revelaram a apoptose de células endoteliais em ratinhos tratados com WFA. Estes resultados sugerem que o FPA potencialmente revoga o crescimento celular, inibe a migração e a invasão, e induz a apoptose em células endoteliais em proliferação, no microambiente STS.

sensibilidade epiteliais de origem “cancros de FPA é aumentada em células que exibem epitelial para mesenquimal ( EMT)

Nossa hipótese central é que as células que expressam vimentina são esperados para demonstrar uma maior sensibilidade WFA. Ao contrário STS, os cancros de origem epitelial mais comuns não expressam naturalmente vimentina. No entanto, os dados indicam que tanto substanciais invasão e metástase pode depender criticamente da aquisição de um fenótipo “mesenquimais” pela célula de cancro incipiente, [33], [34] [32]. Uma das principais características desta epitelial para mesenquimal, é induzida a expressão de vimentina. Tendo isto em conta, analisamos a expressão de vimentina em um painel de linhas celulares de carcinoma e avaliada a sua resposta a WFA. Três das células (MCF7, HT29, e TMK1) exibiu nenhuma expressão de ARNm vimentina e proteína, e os outros dois (MDA231 e A549) expressa vimentina (Figura 7A). As células que expressam vimentina foram significativamente mais sensíveis à FMA do que aqueles vimentina não expressam (Média ± DP FPA IC

50 valores nas células MDA231 e A549 foram 1,3 uM ± 0,42 e 1,8 uM ± 0,37, respectivamente, e 2,9 uM ± 0,31, 7,8 ± 2,34 uM, 3,1 uM 0,18 ± em células MCF-7, HT29, células e TMK1, respectivamente; P 0,05). Da mesma forma, FMA (1 uM durante 24 h) produziu uma taxa de apoptose significativamente maiores nas células de carcinoma que expressam vimentina (p 0,05; Figura 7B). análise WB revelou ainda os produtos de degradação vimentina em células MDA231 em conjunção com os níveis de caspase-3 e PARP activada expressão clivado melhorados (Figura 7C). Em contraste, apenas um mínimo ou nenhuma expressão de PARP clivada da caspase-3 e activada foi demonstrada em células HT29 e MCF7, respectivamente. Os dados aqui apresentados ainda apoiar o papel da vimentina como um alvo molecular WFA, sugerindo a possível eficácia terapêutica da WFA em cancros epiteliais que apresentam fenótipos EMT.

A)

induzidas WFA corresponde inibição do crescimento para o nível de expressão de vimentina em células de câncer de origem epitelial;

B)

FPA (1 uM durante 24 h) induz uma taxa de apoptose significativamente maiores nas células de carcinoma que expressam vimentina;

C)

WB análise demonstrando células degradação MDA231 vimentina em conjunto com os níveis de caspase-3 e de expressão PARP activada clivados melhorados.