Abstract
O receptor de andrógeno (AR) é o principal alvo terapêutico no cancro da próstata. Durante os últimos 70 anos, a terapia da privação do andrógeno (ADT) tem sido o principal foco terapêutico. No entanto, alguns pacientes não se beneficiam, e esses tumores que respondem inicialmente à ADT eventualmente evoluir. Um mecanismo recentemente descrita de um tal efeito é o crescimento e efeitos de promoção da sobrevivência de AR que são exercidas de forma independente de ligandos do AR, testosterona e di-hidrotestosterona. No entanto, os genes alvo AR independente de ligandos específicos que são responsáveis por este efeito não foram bem caracterizados. Mostramos aqui que
C-Myc,
que é um mediador chave de crescimento do cancro da próstata independente do ligando, é um gene alvo chave AR independente do ligando. Usando microarrays análise, descobrimos que
c-Myc
e os níveis de expressão AR fortemente correlacionados entre si em tumores de pacientes com câncer de próstata resistente à castração (CRPC) a progredir apesar ADT. Nós confirmamos que a RA regula diretamente
c-Myc
transcrição de uma forma independente do ligando, que
AR
e
o crescimento de células de câncer de próstata independente do ligando c-Myc
supressão reduz e que a expressão ectópica de c-Myc atenua os efeitos anti-crescimento de supressão de AR. Mais importante, o tratamento com o inibidor JQ1 bromodomain suprimida função de c-Myc e suprimiu a sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligando. . Nossos resultados definir uma nova ligação entre duas proteínas críticas no cancro da próstata – AR e c-Myc – e demonstrar o potencial da AR e terapias para melhorar o controle do câncer de próstata c-Myc-dirigida
Citation: Gao L, Schwartzman J, Gibbs A, Lisac R, R Kleinschmidt, Wilmot B, et al. (2013) receptor andrógeno Promove Ligand-independente cancro da próstata progressão através de c-Myc regulação positiva. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10.1371 /journal.pone.0063563
Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 30 de outubro de 2012; Aceito: 02 de abril de 2013; Publicado em: 21 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta publicação tornou-se possível com o apoio do Instituto de Pesquisa Clínica e translacional Oregon, conceder número KL2 RR024141 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde (JA). Este trabalho também foi apoiado pelo Cancer SPORE /Instituto Pacific Northwest próstata Nacional do Câncer (P50CA097186) (JA, PN, IC), o Departamento de Defesa (PC093509) (PSN), um Prêmio Cientista Clínica de bordo Medical Research Institute Young (JA ), um Wayne D. Kuni Joan E. Kuni Award Foundation Scholar Kuni (JA), e um prêmio do cancro da próstata Foundation Young Investigator (JA). Com agradecimentos especiais a Platt Eléctrica, Bruce Burns, e O Fundo de família das queimaduras da Fundação Comunidade Oregon por seu apoio filantrópico deste trabalho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é o câncer mais comum em homens nos Estados Unidos, com 241,740 novos casos esperados deste ano [1]. Apesar de triagem e tratamento precoce, o câncer de próstata comumente se repete, e 28,170 homens estão previstas para morrer de câncer de próstata este ano [1]. Quase todas estas mortes por câncer de próstata são atribuíveis ao metastático, câncer de próstata resistente à castração (CRPC) que progrediu apesar da terapia da privação do andrógeno (ADT) -. O tratamento mais comum para pacientes com recorrentes ou câncer de próstata avançado
ADT funciona através da redução dos níveis do potente AR ligandos de testosterona e di-hidrotestosterona (DHT), ou interferir com a ligação de ligandos de androgénio para a proteína do receptor de androgénio (AR), o principal alvo terapêutico no cancro da próstata [2]. Apesar ADT, incluindo novos e tratamentos mais potentes, todos os cancros da próstata, eventualmente, progredir [3], [4]. Na progressão, o AR é ubiquamente expressa [5], [6].
Existem várias explicações possíveis para mecanismos dependentes de AR de progressão apesar da supressão ou interferência com ligantes de andrógenos. Estas incluem a síntese de androgénio intratumoral, a geração de variantes de transcritos constitutivamente activas AR, AR, a amplificação do gene de activação de mutações Ar, ou a activação de AR por factores de crescimento [7] – [16]. É também agora evidente que a proteína AR pode promover a activação de AR vias independente do ligando distintos de percursos activados por ligandos canónicas da AR em CRPC [17]. No entanto, os genes alvo AR jusante críticos deste tipo que representam a sobrevivência de células AR dependente, independente do ligando o câncer de próstata não foram totalmente esclarecidas. O estudo de tais genes e os mecanismos pelos quais alvo AR AR regula a sua expressão irá melhorar a nossa compreensão da castração-resistência e conduzir à identificação de proteínas-chave dependentes AR cuja actividade pode controlar o crescimento e sobrevivência das células CRPC. Tais metas e caminhos que naturalmente se tornam grandes prioridades para o desenvolvimento de drogas.
Para entender genes que podem conta para esse efeito, nós nos concentramos em
c-Myc
. Isto porque: 1)
c-Myc
superexpressão promove o desenvolvimento do câncer de próstata [18]; 2)
c-Myc
é regulada positivamente em cancro da próstata dependentes de androgénio ligando e ainda mais supra-regulada em CRPC [19], [20]; e 3) relatórios anteriores demonstraram que c-Myc, como AR, contribui para o crescimento de células de cancro de próstata independente de ligandos [21]. A nossa análise dos dados antes que localizada AR locais de ligação ao longo do genoma por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) mostrou que a AR se localiza um elemento potenciador da
c-Myc
gene [17]. No entanto, não ficou claro se
c-Myc
era um gene alvo AR direta e se ligantes andrógeno eram necessárias para a regulação AR de
c-Myc
expressão.
Nós determinamos que
c-Myc
regulação positiva em tumores humanos CRPC correlaciona-se com
AR
regulação positiva, e nós confirmou que
c-Myc
é um gene alvo AR direta usando cromatina imunoprecipitação (CHIP ensaios).
c-Myc
supressão alcança os mesmos efeitos globais como
AR
supressão e
c-Myc
superexpressão atenua os efeitos anti-crescimento de
AR
supressão. Enquanto AR promove
c-Myc
expressão, o tratamento com ligantes de andrógenos não aumentou
c-Myc
expressão. Assim, AR promove a expressão de
c-Myc
de forma independente do ligando, e
c-Myc
é um gene chave alvo AR.
Finalmente, nós tratamos células de câncer de próstata com a JQ1 BET bromodomain inibidor que suprime a expressão de c-Myc [22], [23]. O tratamento com JQ1 alcançado o mesmo efeito global como
c-Myc
RNAi e reduziu a sobrevivência das células do câncer de próstata em condições esgotado com ligando andrógenos.
Nossos estudos esclarecer que
c-Myc
é um gene alvo AR chave androgénio independente do ligando, que contribui para a sobrevivência independente de ligando-AR mas dependente de androgénio de células do cancro da próstata. Nossos resultados também demonstram o potencial de terapias direcionadas-AR ou terapias c-Myc-dirigidas no câncer de próstata como adjuntos a ADT.
Resultados
AR e
c-Myc
são em consonância Expresso em metastático CRPC
ambos AR e c-Myc são caminhos críticos de sobrevivência no cancro da próstata, e os níveis de ambos Expression
AR
e
c-Myc Quais são comumente aumentada em tumores humanos CRPC progredir apesar ADT [24], [25]. No entanto, era desconhecido se superexpressão de
AR
e
c-Myc
estava ligada com a outra em tumores CRPC humanos. Portanto, determinamos os níveis de expressão
AR
e
c-Myc
utilizando microarrays de expressão gênica em 140 tumores CRPC humanos versus 15 amostras de próstata normais. Em seguida, examinamos a associação de
AR
regulação positiva e
c-Myc
regulação positiva nos tumores CRPC humanos.
AR
níveis de mRNA em amostras CRPC foram fortemente associada com níveis
c-Myc
mRNA (correlação de Pearson = 0,3698, 95% de intervalo de confiança: 0,2172-0,5048, valor de p 0,0001 ) (Figura 1A). Também foi calculado o odds ratio para
c-Myc
e
AR
regulação positiva nestes espécimes CRPC. Houve uma associação estatisticamente significativa com a
AR
regulação positiva e
c-Myc
regulação positiva (OR = 3.528, 95% de intervalo de confiança 1,347-9,240, valor-p: 0,0108 pelo teste exato de Fisher) (Figura 1B).
A) Z-scores (para espécimes de próstata normais) de
AR
contra
c-Myc
expressão de mRNA em 140 metástases CRPC humanos. O coeficiente de correlação de Pearson, regressão linear, e teste de F para a inclinação significativamente diferente de zero foram realizados para cada par de genes. B) Relação de teste e as probabilidades exato de Fisher na tabela de contingência analisar a co-ocorrência de tumores com
AR
ou
c-Myc
z-score superior a 2.
AR Repressão reduz o crescimento de AR resistente à castração células cancerosas da próstata Ligand-dependentes e AR Ligand-independentes
Nós suprimidos expressão do
AR
com RNAi em células de câncer de próstata cultivadas em despojado com carvão, soro depletado de ligando de androgénio.
AR
RNAi reduziu o crescimento celular de ambas as células LNCaP dependente do ligando de androgénio e seus derivados CRPC chamados LNCaP-abl (Figura 2A). De nota, ambas estas células expressam apenas o AR transcrito de comprimento completo.
AR
supressão com ARNi na linha celular 22RV1 CRPC que expressa tanto AR de comprimento completo e uma variante de transcrito AR obteve o mesmo efeito (Figura 2A). Em todas as linhas de células, a supressão de AR reduzidos crescimento celular sem induzir a apoptose (dados não apresentados), sugerindo um defeito na proliferação. Assim, apesar de depleção ligante de andrógeno,
AR
supressão reduz ainda mais o crescimento de células de câncer de próstata.
A) LNCaP, abl e 22RV1 células foram transfectadas com 50 nM de controle não-alvo (NTC) ou
AR
oligonucleotídeos RNAi. As células foram transferidos para soro despojado com carvão no dia da transfecção. O crescimento celular foi determinada 5 dias mais tarde para LNCaP e 6 dias mais tarde para abl e CRPC 22RV1 com o método de exclusão de azul de tripano. B) para a expressão de imunotransferência AR. As bandas menores no imunoblot AR em células 22RV1 reflectem a presença de uma variante de transcrito de AR [7]. B) LNCaP, abl e 22RV1 células foram transfectadas com 50 nM de NTC ou
c-Myc
RNAi oligonucleotídeos. As células foram transferidos para soro despojado com carvão no dia da transfecção. O crescimento celular foi determinada 5 dias mais tarde para as células LNCaP e 6 dias mais tarde para abl e 22RV1 com o método de exclusão de azul de tripano. Immunoblot para a expressão da proteína c-Myc. C) As células LNCaP com superexpressão estável do vector vazio (EV), ou c-Myc foram gerados. Estas células foram transfectadas com 50 nM de controlo não específico (NTC) ou oligonucleótidos de ARNsi de AR. O crescimento celular foi determinada 6 dias mais tarde com o método de exclusão de azul de tripano. Immunoblot para a expressão da proteína de AR e de c-Myc. As bandas mais elevadas no imunoblot de c-Myc nas células de c-Myc-sobre-expressam ectopicamente representam a expresso de c-Myc. * Significa p . 0,05 em relação ao NTC
c-Myc Repressão recapitula os Efeito da AR Repressão e c-Myc superexpressão Atenua a actividade anti-tumoral de AR Repressão
Para determinar se c-Myc também influenciou o crescimento celular independente cancro da próstata de ligantes de andrógenos, que suprimiu
c-Myc
usando RNAi. Como
AR
regulação baixa,
c-Myc
infra-regulação suprimiu o crescimento independente de ligante de LNCaP, abl, e 22RV1 células (Figura 2B). Além disso, nós simultaneamente suprimida
AR
e
c-Myc jogue com RNAi. Co-supressão de ambas as proteínas não reduziu o crescimento celular mais do que a supressão de qualquer
AR
ou
c-Myc
por si só (Figura S1).
Nós também demonstrou que
c-Myc
superexpressão conferida crescimento independente de ligando às células LNCaP dependente do ligando propagadas a longo prazo em condições de castração, que é concordante com um relatório prévio (Figura S2) [21]. Em seguida, nós suprimida
AR
com RNAi em células LNCaP com superexpressão vector vazio ou
c-Myc Comprar e crescimento celular quantificado.
c-Myc
superexpressão foi protetora contra os efeitos do crescimento supressivas de
AR
RNAi (Figura 2C). Isso demonstra que
c-Myc
contribui pelo menos parcialmente aos efeitos do AR sobre a promoção da sobrevivência das células do câncer de próstata independente do ligando.
AR, mas não andrógenos Promover c-Myc Expressão
a
c-Myc
oncogene é normalmente regulada positivamente em cancro da próstata, e
C-Myc
regulação positiva promove a sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligandos [21]. No entanto, a dependência do
expressão de c-Myc
na AR não tinha sido estabelecida. Assim, examinamos publicado anteriormente dados de microarray chip que AR localizada ao longo do genoma de células LNCaP dependente do ligando de androgénio e seus derivados Abl CRPC [17]. AR foi relatado para ser ligado a um elemento potenciador da
c-Myc
gene em ambas as linhas celulares. Portanto, o próximo utilizado chip para confirmar estes resultados.
Primeiro, as células cresceram em soro depletado de ligando despojado com carvão, androgénio e determinado o efeito do tratamento com o ligando de androgénio R1881 em ocupação AR e acetilação da histona, uma marca de transcrição ativa, no
c-Myc
elemento potenciador usando o chip. Também foram avaliados os efeitos de tratamento R1881 no gene bem descrito, activado pelo ligando
KLK3
. AR e altos níveis de acetilação da histona estavam presentes na
c-Myc
potenciador mesmo quando as células foram cultivadas em soro empobrecido-ligando (Figura 3A). Além disso, a adição de R1881 de cultura não aumentou a ocupação AR ou acetilação de histona a
c-Myc
(Figura 3A). Isto contrasta com o efeito de R1881 no
KLK3
gene enhancer- aumentou enriquecimento da AR e acetilação das histonas (Figura 3A).
LNCaP, abl, e 22RV1 células foram cultivadas em despojado de carvão- de soro durante 72 horas e depois tratou-se com 10 nM R1881 (ou veículo de etanol) durante 4 horas. A) Cromatina imunoprecipitação foi realizada para determinar o enriquecimento de AR e histona H3 acetilação (AcH3) no
c-Myc
e
KLK3
elementos intensificadores. B) qRT-PCR foi realizado para determinar os níveis de ARNm de
KLK3
e
c-Myc
em relação à actina. C) A imunotransferência foi realizada para determinar os níveis de proteína de AR, c-Myc, e actina. * Significa p 0,05 em relação ao veículo
A seguir, determinou o efeito do tratamento R1881 na expressão de
c-Myc
ou
KLK3
.. tratamento R1881 aumentou
KLK3
expressão (Figura 3B). No entanto, o tratamento R1881 não aumentou
c-Myc
expressão. Figura 3B, C).
Em seguida, trataram células de câncer de próstata com MDV3100, um potente e novo antagonista de andrógeno [26]. tratamento MDV3100 expressão de suprimida
KLK3
mas não afetou a expressão de
c-Myc
. (Figura S3). Estes resultados apoiam ainda mais a noção de que ligantes de andrógenos não promovem a expressão de
c-Myc
.
Para determinar se a AR era capaz de regular
c-Myc
em um forma independente do ligando, usamos RNAi para suprimir a expressão de
AR
e medidos
c-Myc
expressão. supressão mediada por ARNi de
AR
reduzida de ARNm de c-Myc e expressão de proteína (Figura 4A, B). Realizamos ensaios chip e confirmou que
AR
RNAi reduziu AR e acetilação das histonas do
c-Myc
potenciador (Figura 4C). Esta foi mais significativa na linha celular 22RV1, apesar de fortes tendências também foram observados em células LNCaP e Abl. Assim,
c-Myc
é um gene alvo AR direta e
AR
RNAi suprime
expressão de c-Myc
pelo menos em parte, através de esgotamento de acetilação AR e histona de
c-Myc
potenciador. Nós também sobre-expressa AR na linha celular de cancro da próstata M12 que normalmente não expressam AR. AR sobre-expressão aumentada de ARNm de c-Myc e a expressão da proteína (Figura S4). Isto apoia ainda mais a noção de que a AR ativa
expressão de c-Myc
de forma independente do ligando.
LNCaP, abl e 22RV1 células foram transfectadas com 50 nM de controle não-alvo (NTC) ou oligonucleótidos de ARNi de AR. As células foram então cultivadas em soro despojado com carvão durante 96 horas. No final do tratamento, as células foram colhidas para extrair ARNm e proteína. A) qRT-PCR foi realizado para determinar os níveis de
c-Myc
relativa para
actina
. B) A imunotransferência foi realizada para determinar os níveis de AR, c-Myc e actina. C) tratamentos paralelos foram realizados e as células foram reticulado e processado para o chip para determinar AR e histona H3 acetilação enriquecimento (AcH3) no
c-Myc
potenciador. * Significa p 0,05 em comparação com NTC
Supressão AR recapitula os Efeito do c-Myc Repressão
A seguir, determinar se a supressão da
AR
RNAi-mediada. recapitulado o efeito da supressão mediada por ARNi de
c-Myc
de expressão da bem descrita
c-Myc
genes alvo (Figura 5) [27], [28]. Ambos
c-Myc
RNAi e
AR RNAi
expressão reduzida do
c-Myc
gene -activated
E2F1
; Por outro lado,
c-Myc
e
AR
RNAi tanto o aumento da expressão do
c-Myc
gene -repressed
CDKN1A
(Figura 5). Relatórios recentes demonstram que os genes mitóticas, incluindo
KIF11
,
AURKB
, e
TPX2
, são os principais genes-alvo c-Myc [29] – [31].
AR
ARNi recapitulado o efeito de c
-Myc
RNAi e expressão também reduzida desses genes (Figura 5). Isto demonstra que a supressão de AR destrói a função de c-Myc e a expressão de genes alvo c-Myc bem estabelecidos.
células LNCaP e ABL foram transfectadas com 50 nM de controlo não específico (CNT) e ou a)
AR
ou B)
c-Myc
RNAi oligonucleotídeos. As células foram transferidos para soro despojado com carvão no dia da transfecção e colhidas 96 horas mais tarde. QRT-PCR foi realizada para determinar os níveis de
c-Myc
genes-alvo indicadas em relação ao
actina
. * Significa p 0,05 em comparação com NTC
O BET Bromodomain Inhibitor JQ1 Suprime c-Myc Função e reduz celular AR Ligand-independente cancro da próstata sobrevivência
Nossos resultados demonstram que
c-Myc
é um importante gene alvo AR, mas que
expressão de c-Myc
não é activado por ligantes androgênicos. Atualmente, as terapias para suprimir a expressão AR ainda não estão disponíveis. No entanto, trabalhos recentes mostram que um inibidor de BET bromodomain chamado JQ1 suprime a expressão de c-Myc e da função de c-Myc, porque
c-Myc
é um gene alvo bromodomain [22], [23]. Por isso, trataram células de câncer de próstata com JQ1. JQ1 tratamento reduziu o ARNm e os níveis da proteína de c-Myc (Figura 6A, B) e suprimiu função de c-Myc, conforme medido por c-Myc expressão do gene alvo (Figura 6B). Finalmente, como
c-Myc
ARNi, o tratamento com concentrações nanomolares JQ1 reduziu a sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligando (Figura 6C).
LNCaP, abl, e 22RV1 células foram cultivadas em charcoal- despojado de soro e tratadas com o veículo, 50 nM, 250 nM ou 500 nM JQ1 a cada 24 horas durante 72 horas. A) A imunotransferência foi realizada para determinar os níveis de proteína de c-Myc. B) qRT-PCR foi realizado para determinar o nível de ARNm de
c-Myc
e c-Myc tem como alvo os genes
KIF11, CDKN1A, TPX2
, e
relação ao AURKB
actina
. * Indica P 0,05 comparado com o veículo. C) A viabilidade celular foi determinada no final do tratamento com o método de exclusão de azul de tripano. p . 0,01 para o 250 nM e 500 nM doses veículo vs. em todas as três linhas celulares
Discussão
é bem apreciado que a AR é um factor crítico de próstata a sobrevivência de células cancerosas e que as contas de AR para a progressão para CRPC fatal apesar do tratamento com ADT [24]. Em muitos casos androgénios persistir intracelularmente dentro de tumores CRPC apesar dos níveis séricos de castração de androgénios [24], [32]. No entanto, os mecanismos de ligando-independentes mas AR-dependentes de androgénio que também promovem a sobrevivência de células CRPC têm sido relatados. Estes incluem a activação de AR pela IL-6, a amplificação do gene de AR, AR e variantes de transcritos que não possuem o domínio de ligação ao ligando de androgénio [7] – [9], [15]. Todos estes mecanismos podem contribuir para a progressão do cancro da próstata, apesar ADT uma vez que nenhum alvo são directamente pela ADT.
Recentemente, foi demonstrado que a proteína AR promove a expressão de um gene distinto programa a partir do seu ligando-androgénio canónica dirigido alvos em células CRPC [17]. Um tal exemplo é o gene alvo AR
UBE2C
que promove a proliferação do cancro da próstata independente do ligando [17]. Qual dos outros produtos de genes induzida por RA é crítica para a sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligando tem sido pouco clara. Nosso trabalho demonstra que o
c-Myc
oncogene é um tal gene alvo AR independente do ligando.
c-Myc
é comumente regulada no cancro da próstata, e
c-Myc
superexpressão transforma células epiteliais prostáticas normais em modelos de ratos geneticamente modificadas de câncer de próstata e confere a sobrevivência das células do câncer de próstata independente do ligando, mas a dependência do
expressão de c-Myc
na AR não era clara [18], [20], [21], [33]. Mostramos aqui que
AR
e
c-Myc
são comumente regulada no CRPC, e confirmou que
AR
e
c-Myc
upregulation fortemente correlacionados entre si em uma grande série de tumores de pacientes CRPC metastático (Figura 1).
Nós confirmou que
AR
supressão leva à perda de expressão de c-Myc em linhas celulares de cancro da próstata expressando completa -length AR (LNCaP e Abl) e em outro 22RV1 linha de células CRPC que expressa tanto AR de corpo inteiro e uma variante AR transcrição. Embora não podemos excluir um papel para a variante AR transcrição in também promover a
expressão de c-Myc
, os nossos resultados com AR RNAi em LNCaP e Abl e os nossos resultados com superexpressão AR em células M12 demonstrar que full-length AR é capaz de ativar
c-Myc
expressão (Figura 4, Figura S4).
Como
AR
RNAi,
c-Myc
RNAi reduziu o câncer de próstata a sobrevivência das células em condições de depleção de ligandos de androgénio enquanto o co-supressão de
AR
e
c-Myc
não foi mais eficaz do que qualquer um sozinho de supressão de proteína (Figura 2, Figura S1).
c-Myc
superexpressão confere sobrevivência independente do ligando às células cancerosas da próstata (Figura S2), que corresponde a um relatório prévio [21]. Também mostrou que
c-Myc
superexpressão atenuou a actividade anti-tumoral de
AR
supressão com RNAi (Figura 2C). Assim, C-Myc contribui para efeitos de AR em promover a sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligando.
Apesar do facto de que promove a expressão de AR
c-Myc
, o tratamento com o ligando de androgénio não aumentou
c-Myc
expressão (Figura 3). Além disso, o tratamento com ligandos de androgénio não aumentou a ocupação AR no
c-Myc
potenciador (Figura 3). Isto contrasta com os efeitos de estimulação de androgénio na expressão do
KLK3
gene, um gene activado por androgénio bem descrito, e ocupação AR no
KLK3
potenciador (Figura 3). Para confirmar ainda que AR promove a expressão de
c-Myc
de forma independente do ligando, que trataram células de câncer de próstata com o novo e potente antagonista de andrógenos MDV3100 [26]. O tratamento com MDV3100 em um recente estudo de fase III randomizado, controlado por placebo melhorou a sobrevida global de pacientes com CRPC [34]. No entanto, em alguns pacientes, não há resposta do tumor, e a progressão da AR permanece no núcleo [3], [6], [34]. Embora o tratamento MDV3100 reduzida expressão de
KLK3
, o tratamento MDV3100 não teve efeito sobre
c-Myc
expressão (Figura S3). Estes dados suportam ainda mais a noção de que a AR promove
expressão de c-Myc
de forma independente do ligando.
c-Myc
é um factor crítico para a progressão do cancro da próstata independente de ligando (Figura 2, Figura S2) [21]. Portanto, no futuro, será importante para medir
c-Myc
expressão e função em tumores de doentes CRPC progredir apesar da interferência de androgénio mais completa com drogas tais como MDV3100
.
Devido à importância de
c-Myc
como um contribuinte a jusante aos efeitos do AR sobre a sobrevivência de células de câncer de próstata independente do ligando, que trataram células de câncer de próstata com o JQ1 inibidor BET bromodomain, uma droga conhecida para suprimir a expressão de genes alvo bromodomain; os primeiros dos quais era
c-Myc
[22], [23]. Em estudos anteriores, o tratamento JQ1 in vitro e in vivo suprimida a expressão e função c-Myc e suprimiu o crescimento do tumor sem toxicidade significativa [22], [23].
Nós confirmamos que o tratamento JQ1 de células de câncer de próstata utilizando nanomolar concentrações alcançado os mesmos efeitos gerais como a supressão mediada por ARNi de
c-Myc
– ARNm de c-Myc e a depleção de proteínas, a supressão da função de c-Myc, e supressão da sobrevivência de células de cancro de próstata independente de ligando (Figura 6 ). À luz do envolvimento de
c-Myc
em processos fisiológicos críticos, tendo como alvo a proteína c-Myc, em geral, vários tipos de células, através da administração a longo prazo pode ser indesejável [35], [36]. Os ensaios clínicos serão necessários para determinar a segurança de inibição bromodomain. No entanto, os resultados até à data, incluindo o nosso, sugerem que esta é uma estratégia anti-tumoral promissora para o tratamento de CRPC (Figura 6) [22], [23].
Finalmente, que os controlos AR expressão dos seus genes alvo, tais como
c-Myc
de uma forma específica para tecidos sugere que o agente ideal para a supressão de
expressão de c-Myc
em células de cancro da próstata ter por alvo especificamente AR, em si. De facto, os nossos estudos esclarecer que androgénio ligando-independentes mas AR-dependente
c-Myc
regulação positiva do gene é um mecanismo pelo qual a proteína AR promove a sobrevivência independente de ligando de células cancerosas da próstata. Os nossos estudos suportam o merecimento de esforços no sentido de suprimir a função independente de ligandos de AR e de expressão de genes alvo importantes AR independente de ligandos, tais como
c-Myc
(Figura 7). Drogas capazes de suprimir a expressão AR só agora estão começando a entrar testes. Estas drogas incluem degradadores AR seletivos e oligonucleotídeos anti-senso ar [37] – [40]. Nós aguardar os resultados destes estudos clínicos para determinar a segurança, especificidade e eficácia destes agentes em homens com cancro da próstata avançado.
Actualmente, as terapias de privação androgénica que interferem com a activação pelo ligando de androgénio da AR são utilizados principalmente para tratar esta doença. Estas terapias suprimir a função dependente do ligando andrógeno da AR e suprimir a expressão de genes-alvo (AD) AR dependente do ligando andrógenos. No entanto, apesar destes tratamentos progressão do câncer de próstata é inevitável. A AR também promove a expressão das vias independente do ligando de androgénio, tais como
c-Myc
. O
c-Myc
gene é comumente regulada no cancro da próstata e contribui para a progressão do cancro da próstata independente de ligante de andrógeno. Este modelo sugere fortemente que as terapias AR ou c-Myc-dirigidos iria complementar as estratégias de privação de androgénios atuais.
Métodos
Cultura de Células
LNCaP e 22RV1 células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em soro bovino fetal despojado-carvão a 10% para todas as experiências. células Abl, um derivado de LNCaP CRPC, foram uma oferta do tipo Zoran Culig, PhD e foram cultivadas em RPMI com soro de bovino fetal a 10% de carvão-descascada. células cancerosas da próstata M12 expressando vector vazio ou AR foram um presente amável de Stephen R. Plymate, PhD, e cultivadas como descrito anteriormente [9].
Para experiências de RNAi, LNCaP e as células ABL foram transfectadas com oligonucleotídeos de RNAi (
AR
: 5′-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 ‘, e
C-Myc
: 5′-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3′) usando DharmaFECT 3 (Dharmacon) reagente de transfecção para uma concentração final de 50 nM [41]. 22RV1 células foram transfectadas com ARNsi de oligonucleótidos utilizando Lipofectamine2000 (Life Technologies) de reagente de transfecção para uma concentração final de 50 nM. As células foram colhidas nos pontos de tempo indicados após a transfecção.
R1881 (Sigma) foi ressuspenso em etanol a 100%. MDV3100 foi comprado (Selleckchem) e ressuspensas em DMSO. JQ1 foi adquirido a Sigma e ressuspensas em DMSO. O crescimento celular foi determinado no fim do tratamento com o método de exclusão de azul de tripano (Life Technologies) seguindo as instruções dos fabricantes. Todas as experiências de cultura de células foram realizados com amostras em triplicado biológicos e confirmado em experiências repetidas.
células LNCaP com superexpressão estável de c-Myc ou o vector vazio foram gerados por transfecção de células de LNCaP com pcDNA-DEST40-
c- myc
(gentilmente cedido por Rosalie Sears, PhD) ou pCMV6-AN-His (Origene) e selecionando com G418.
Colony-formação Ensaio
200.000 células LNCaP com superexpressão estável de vector vazio (EV) ou
c-Myc
foram semeadas em placas de 10 cm. RPMI com soro fetal despojado com carvão bovino a 10% suplementado com 300 ug /ml de G418 e 10 ug /ml tratamento bicalutamida foi adicionado às células em dias alternados durante 14 dias. Em seguida, as células foram fixadas com formaldeído a 4% e coradas com syto60 (Invitrogen). As imagens foram tiradas com Licor sistema de imagiologia Odyssey.
imunotransferência
Immunoblotting experiências foram realizadas como descrito anteriormente [42]. imagens finais foram obtidos com o sistema de Licor de imagem Odyssey. Os anticorpos primários usados foram: AR (N-20, Santa Cruz); actina (Sigma) e c-Myc (Epitomics). Anticorpos secundários foram adquiridos à Licor.
QRT-PCR
O ARN foi extraído a partir de sedimentos de células armazenados em RNAlater reagente (Life Technologies) utilizando um kit de isolamento de ARN total Magmax (Life Technologies) ou Trizol ( Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop). 250 ng-1 ug de ARN (normalizado para cada experiência) foi sujeitos a transcrição reversa usando um kit High-Capacity cDNA de transcrição reversa (Life Technologies) com iniciadores aleatórios. Tempo Real (QRT) -PCR foi realizada utilizando um termociclador 7500 rápida (Life Technologies) com o seguinte programa de ciclos: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg, 60 ° dissociação C durante 1 min de recozimento /extensão /ler. reações RTPCR 10 mL simplex contido 1X Taqman mastermix padrão universal, sonda de hidrólise 1X Taqman e modelo de cDNA RNA equivalente a 10 ng. beta-actina humana (# 4326315E) foi usado como um controle endógeno. Primer informação é incluída na Tabela S1.