Abstract

A metástase é a principal causa de mortalidade em pacientes com tumores sólidos. Identificar as moléculas exatas associados com CRC metástase pode ser crucial para entender o processo, que também pode ser traduzido para o diagnóstico e tratamento da CRC. Neste estudo, nós investigamos a associação de padrões de expressão de microRNA com a metástases em linfonodos de câncer colorretal. Entre estes miRNAs candidatos, a expressão de miRNA-145 foi significativamente relacionado com metástases em linfonodos da CRC. Ambos

in vitro

e

in vivo

estudo demonstrou que a regulação positiva de miR-145 pode melhorar a capacidade de migração e invasão de células de câncer colorretal, enquanto não se observou qualquer efeito sobre a proliferação. O mecanismo desta promoção está associada com a estabilização de HSP-27, uma proteína que desempenha um papel importante na promoção da metástase. Estes resultados podem ser cruciais para a compreensão CRC metástase e pode ser traduzido para o diagnóstico e tratamento da CRC

Citation:. Yuan W, Sui C, Liu Q, Tang W, An H, Ma J (2014) Up Regulamentação do microRNA-145 Associates com Linfonodo metástase no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10.1371 /journal.pone.0102017

editor: Rolf Müller, da Universidade Philipps, Alemanha |

Recebido: 10 Abril 2013; Aceito: 14 de junho de 2014; Publicação: 14 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (Grant não. 2011CB911004), o projecto de formação Beijing para os talentos de ataque (Z131107000513001), Programa Nova Beijing (Z131107000413066) e Pequim Natural Science Foundation da China (Grant no. 7122150). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) ocupa o terceiro tumor mais comum ea quarta causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1]. Apesar de muitos avanços foram feitos no tratamento de CRC nas últimas décadas, a taxa de sobrevida global de pacientes com CRC tem marginalmente alterado. O mau prognóstico e taxa de sobrevivência são devidos principalmente à metástase, assim, mais de um terço dos pacientes com CCR, em última análise desenvolver doenças metastáticas [2]. Portanto, identificar as moléculas exatas associados com CRC metástase pode ser crucial para entender o processo, que também pode ser traduzido para o diagnóstico e tratamento da CRC.

Os microRNAs (miRNAs) são 21- e 25-nucleotide único de cadeia, moléculas de RNA não codificante que exercem as suas funções por ligação para as regiões 3 ‘não traduzida dos seus alvos de ARNm correspondentes [3]. Estimou-se que um terço do total de genes humanos pode ser regulada por miARNs, indicando que miARNs têm papéis essenciais em processos fisiológicos e patológicos [4] – [5]. Um grande número de descobertas mostram que miARNs estão implicados em cancros humanos. A expressão inapropriada de miARN pode conduzir à expressão aberrante de produtos génicos que podem contribuir para a aquisição das marcas do cancro. Estas observações sugeriram a função de miARNs como supressores de tumores ou oncogenes [6] – [8].

Recentemente, mostrou evidências convincentes de que uma série de miARNs desempenham papéis cruciais no CRC metástase. Por exemplo, Asangani et ai. identificada mir-21 como promotor de metástase do CRC [9]. Liu et al relataram que o miR-499-5p reforçada invasão celular e metástase tumoral em CRC por segmentação FOXO4 PDCD4 e [10]. Okamoto K, demonstrou que a sobre-regulação de miR-493 durante a carcinogénese poderia impedir a metástase do fígado em CRC [11]. No entanto, a metástase resultou de uma complexa cascata de processos biológicos e os mecanismos moleculares exatos subjacentes CRC metástases estão longe de serem totalmente compreendidos.

Neste estudo, os perfis de expressão de miRNA em lesão CRC primária, com ou sem metástases linfonodais foram analisados ​​usando um microarranjo de miARN e quantitativa em cadeia da polimerase-transcrição inversa (qRT-PCR). A este respeito, miR-145 foi selecionado como ele exibido dramático aumento da regulação no CRC com metástases linfonodais em comparação com que, sem metástase ganglionar. Ambos

in vitro

e

in vivo

estudo demonstrou que a regulação positiva de miR-145 pode melhorar a capacidade de migração e invasão de células de câncer colorretal. Além disso, iTRAQ (tag isobárica para a quantificação relativa e absoluta) e rotulagem 2DLC-ESI-MS /MS (cromatografia líquida em tandem MS) foram utilizados para identificar proteínas celulares que foram directamente ou indirectamente regulada pela miR-145. Estes resultados sugerem que miR-145 pode desempenhar um papel importante na metástase do CRC pela estabilização da HSP-27.

Resultados

1. Diferentes perfis de expressão miRNA de CRC com ou sem metástase linfonodal

Para investigar a associação de padrões de expressão de microRNA com a metástases em linfonodos de câncer colorretal, oito tecidos de câncer colorretal primário derivado do estágio II-III pacientes com câncer colorretal com (n = 4) ou sem (n = 4) metástases nos linfonodos foram recolhidas e os perfis de expressão de miARN deles foram determinados usando Agilent miARN microarray. Entre a sonda de miRNA humano único 851, 32 miRNAs foram identificados diferencialmente expressos em tecidos CRC entre o grupo positivo e negativo metástase ganglionar (

P Art 0,05). Vinte e um deles foram observados consideravelmente maior expressão no CRC com metástase axilar. Por outro lado, 11 deles foram underexpressed significativamente nos tecidos positivos CRC linfonodo metástases. análise de agrupamento não supervisionado com estes 32 miRNAs significativamente desregulados (21 miRNAs com superexpressão significativa e 11 miRNAs com a regulação negativa significativa) foi capaz de distinguir os CRCs com ou sem metástase ganglionar (Fig. 1A).

A. O resultado autenticada da análise de microarray. agrupamento hierárquico de 32 perfis de expressão miRNAs significativamente desregulados em tecidos colorretais primárias humanas de câncer derivadas de pacientes com câncer colorretal com (LNM-P, n = 4) ou sem (LNM-N, n = 4) metástase ganglionar. B.Validation de miRNAs selecionados previsto para ser desregulada no CRC, com ou sem metástase linfática utilizando qRT-PCR nos mesmos tecidos utilizados para a análise microarray. Os dados apresentados em B é representativa de três experiências independentes, e apresentados como expressão dobra normalizados para U6 ± DP (desvio padrão) .C. análise de QRT-PCR da expressão relativa de miR-145 em adicional 202 (LNM-N = 99; LNM-P = 103) Casos de tecidos CRC humanos, incluindo a amostra de tumor (T) e correspondentes amostra de tecido não-tumoral (NT) a partir do mesmo paciente. Cada amostra foi analisada em triplicado e normalizadas para U6. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

2. A verificação da expressão de miARN por análise de PCR em tempo real

para validar os dados de microarray miARN, foi realizada quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para analisar o nível de expressão de 11 miARNs que eram as mais significativamente miARNs desregulado ou que não foram relatados sua associação com metástase, incluindo miR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5p, -145, -376c, -29b, -95 e -1274a. Foi examinada a expressão de miARNs nos mesmos tecidos utilizados para a análise de micro-arranjo. Após a normalização com o controlo U6 endógena, os dados de qRT-PCR confirmou que a expressão de 8 miARNs mostrou-se consistente com resultados de microarray. Entre eles, a expressão de miARN-145 apresentado a diferença mais significativa entre tecidos de cancro de os dois grupos (Fig. 1B).

Para confirmar ainda mais o perfil de expressão de miR-145, a análise de qRT-PCR foi realizada em 202 amostras adicionais CRC (99 pacientes de CRC com metástases em linfonodos e 103 pacientes com CCR sem metástases em linfonodos) (ver Tabela 1 e Tabela S1). Como mostrado na Fig. 1C, o miR-145 foi underexpressed em espécimes de cancro colorrectal, com ou sem metástases em comparação com tecidos normais adjacentes, respectivamente, o que é consistente com relatos anteriores por outros [14]. No entanto, a expressão de miR-145 foi significativamente regulada para cima no CRC com metástases em linfonodos do que isso, sem metástase ganglionar. Esta mudança sugeriu que miR-145 pode desempenhar um papel importante na CRC metástase ganglionar.

3. A sobre-expressão de miR-145 não tem qualquer efeito sobre a proliferação das células HCT-8

Para determinar se a expressão de miR-145 afectam a função biológica de células de CRC, o modelo de sobre-expressa o miR-145 foi criado no HCT-8 células utilizando um sistema de lentivírus, que foi referido como células HCT-8-miR-145 neste documento. Os miR-145 níveis de células HCT-8-miR-145 e as células de controlo simuladas (HCT-8-NC) foram determinados utilizando qRT-PCR (Fig. 2A). A sobre-regulação significativa de miR-145 em células HCT-8-miR-145 foi observada em comparação com a de células HCT-8-NC. Para observar o efeito de miR-145 em células HCT-as 8, taxa de crescimento celular ou do ciclo celular foi avaliado por CCK-8 ou um ensaio FACS, respectivamente. Como mostrado na Fig. 2B e 2C, a taxa de proliferação da célula ou do ciclo das células HCT-8-miR-145 não se alterou em comparação com HCT-8-NC. Este resultado sugeriu que a sobre-expressão de miR-145 não influenciou significativamente a proliferação celular ou ciclo das células HCT-8.

(A) análise de qRT-PCR de miR-145 HCT-expressão em células transf ectadas com 8 a vector de expressão de lenti-miR-145 ou o vector de controlo negativo miRNA usando um sistema de lentivírus. (B) as taxas de proliferação de HCT-8-miR-145 ou HCT-8-NC células detectadas por CCK-8 de ensaio. (C) análise do ciclo celular de HCT-8-miR-145 ou as células por citometria de fluxo-NC HCT-8. Os dados representam média + DP de três experiências independentes.

4. miR-145 promoveu a migração CRC e invasão

in vitro

e

in vivo

Nós posteriormente analisado se miR-145 contribuiu para mudar a mobilidade migratória das células CRC. Em comparação com o grupo simulado, a migração celular foi significativamente aumentada no HCT-8-miR-145 células em um ensaio de migração de células Transwell (Fig. 3A). Um resultado similar foi também observado num ensaio de invasão de células (Fig. 3B). Nós também determinou a capacidade de miR-145, para promover a migração em outras linhas celulares de CRC (SW480 e SW620). Como mostrado na Fig. S1 S1 no ficheiro, a sobre-expressão de miR-145 aumentou significativamente a capacidade migratória das células SW620, enquanto nenhuma alteração aparente em células SW480 (dados não mostrados). Colectivamente, estes resultados fornecem fortes evidências de que a regulação positiva de miR-145 poderia promover a migração celular e invasão

in vitro

. Porque a expressão do miR-145 em células HCT-8 exibiram a menor expressão em comparação com o que em outras células de CRC, o resto do trabalho foi focada sobre esta linha de células de CRC para ilustrar validação típico.

(A) células migração e invasão (B) ensaio de HCT-8-miR-145 ou HCT-8-NC. As imagens foram representantes de pelo menos três experiências independentes. Número médio do número de células por campo de migração a partir de pelo menos três experiências independentes ± SD é mostrado pela figura coluna. **

P Art 0,01. imagens (C) Foto de mesentérica metástases em linfonodos de camundongos nus que foi injetado no fígado com células HCT-8-miR-145 ou HCT-8-NC seguido de sutura cirúrgica. Os animais foram sacrificados 2 semanas após a inoculação de células intra-hepática. (D) Incidência de mesentérica metástases em linfonodos em camundongos (mesa) e número de nódulos metastáticos visíveis no mesentério (figura coluna) significam. **

P

. 0,01

Para confirmar ainda mais essa noção, um modelo de ratinho nu transplante orthotropic foi estabelecido para estudar se a sobre-expressão de miR-145 poderia promover metástase de tumor

in vivo

. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa do peso ou volume dos tumores primários no fígado transplantado por ambas as células HCT-8-miR-145 e células HCT-8-NC. Nós também descobrimos que 100% dos ratos no grupo de miR-145 HCT-8 teve o mesentérica metástases em linfonodos eo número médio de nódulos metastáticos alcançou 149 ± 15. No entanto, não havia nenhum dos ratos no grupo de controle HCT-8-NC exibindo mesentérica metástases em linfonodos (Fig. 3C, 3D). Tomados em conjunto, estes resultados confirmaram que alto nível de miR-145 poderia promover a migração CRC e invasão

in vitro

e

in vivo.

5. Análise de proteínas diferencialmente expressos

Os resultados acima indicaram que miR-145 funciona como um miRNA prometastatic no CRC. Para objectivo de obter uma melhor compreensão das proteínas afectados quer directamente ou indirectamente por miR-145 sobre-expressão, HCT-8-miR-145 e as células HCT-8-nc foram lisadas e submetidas a rotulagem iTRAQ, 2DLC-ESI-MS /MS análise. Um total de 1117 proteínas diferentes foram identificados e quantificados, que foram filtrados, subsequentemente, com os parâmetros de filtro de exclusão seleccionados manualmente. Nós levou um 1,3 mudança dobra de corte para a relação iTRAQ para classificar proteínas como cima ou para baixo regulamentação. Este corte foi aplicada porque vários estudos iTRAQ anteriores realizados em nosso laboratório demonstraram que a variação técnica foi consistentemente abaixo de 30%, o critério de corte também foi aceite pela pesquisa anterior [12]. As proteínas foram consideradas para cima ou única regulada para baixo quando os seus rácios de expressão (HCT-8-miR-145 células vs. 8 HCT-NC-células) foram 1,3 (1 × 1.3) ou 0,77 (1 × 1.3) e mostrou significância estatística.

Assim, 13 proteínas foram visionadas de proteínas como diferencialmente expressos, incluindo 7 proteínas significativamente up-regulamentados e 6 proteínas extremamente regulada para baixo (Tabela S2, S3). Entre as 13 proteínas expressas diferencialmente, a sobre-regulação de proteína de choque térmico 27 ​​(HSP-27) foi validado utilizando western blot (Fig. 4A). Assim, optamos por HSP-27 para uma investigação mais aprofundada.

(A) Os níveis de HSP-27 de expressão foram examinados em HCT-8-miR-145 ou células HCT-8-NC por análise de transferência de western. (B) A expressão de HSP-27 de proteína foi detectada em tecidos normais e CRC adjacentes por ensaio Western Blot. Os rácios /actina relativos Hsp27 de bandas individuais são apresentados como a média + SD de valores obtidos a partir de todas as amostras de pacientes (tecido não-tumoral, n = 47; tecido tumoral LNM-P, n = 41; tecido tumoral LNM-N, N = 43). (C-D) miR-145 avançado HSP-27 Estabilidade em CRC Cells.HCT-8-miR-145 ou células HCT-8-nc foram incubadas com o inibidor da síntese proteica cicloheximida (CHX, 0,5 ug /mL) (C) ou inibidor de proteassoma MG-132 (5 fiM) (D) durante 24 horas. O nível de um total de HSP-27 foi detectada por análise de transferência de Western. Os rácios /actina relativos Hsp27 de bandas individuais são apresentados como a média ± SD de valores normalizados para a beta-actina.

Para validar ainda mais a associação entre a HSP-27 de proteína e miR-145 em expressão CRC , analisamos o perfil de expressão em amostras de tecidos humanos primários (incluindo 41 CRC com LNM, 43 CRC sem LNM, 47 tecido não tumoral adjacente) utilizando western blot ou qRT-PCR, respectivamente. Entre as amostras de tecidos humanos 131, a expressão de HSP-27 foi significativamente regulada para cima no CRC com linfonodo metástases em relação ao que, sem metástase ganglionar. Esta tendência é consistente com miR-145 Perfil de expressão. Houve uma forte correlação positiva (Spearman) entre HSP-27 proteína e miR-145 expressão (

r

= 0,402;

P Art 0,0001). (Fig.4B, Fig S2 e S3 no arquivo S1). Estes resultados indicaram que o miR-145 está envolvida, pelo menos parcialmente, na-se-regulação de HSP-27 de expressão de proteína.

6. Aperfeiçoamento de HSP-27 por estabilidade miR-145 em células de CRC

Não houve alteração detectável de HSP-27 de nível da transcrição, após o miR-145 sobre-regulação (dados não mostrados). mRNA única proteína, mas não da HSP-27 foi modulado por miR-145, sugerindo que esta regulamentação é pós-transcricional. Para explorar ainda mais a proteína-regulação de HSP-27 afectada por miR-145, foram detectados se miR-145 melhorou a estabilidade da HSP-27 proteína. HCT-8-miR-145 e células HCT-8-nc foram tratadas com o inibidor de síntese de proteínas, ciclo-heximida (CHX), ou inibidor de proteassoma, MG-132, respectivamente. Como ilustrado na Fig.4C e 4D, a maior expressão da HSP-27 em miR-145 células overexpressed foi abolida quando incubadas com MG132. Tal fenômeno não foi encontrado quando incubadas com CHX. Estes resultados indicaram que miR-145 não poderia influenciar a síntese de proteínas de HSP-27, mas poderia reduzir a taxa de HSP-27 degradação, o que aumentou a sua estabilidade.

7. Down-regulação da HSP-27 atenuou o efeito oncogênico de miR-145

Para verificar se o aumento da regulação do HSP-27 contribui para a mobilidade induzida por miR-145 em células CRC, uma série de ensaios foram efectuados

in vitro

. HSP-27, ou ARNsi de controlo foi inicialmente transfectada em células HCT-8-miR-145. A redução da expressão da proteína de HSP-27 foi confirmada através de transferência de Western (Fig. 5A). A migração celular foi, então, observada utilizando a cicatrização de feridas de ensaio (Fig. 5B). Estes resultados mostraram que a mobilidade das células HCT-8-miR-145 transfectadas com HSP-27 siARN foi notavelmente mais lenta do que a de células transfectadas com ARNsi de controlo. Um resultado semelhante também foi obtido num ensaio de invasão celular. Transwell-Matrigel experiências de ensaio de penetração foram realizados com células transf ectadas com HSP-27, ou ARNsi de controlo-miR-145 HCT-8. Em comparação com o controle, derrubar de HSP-27 inibiu a capacidade invasão do HCT-8-miR-145 células (Fig. 5C). Os outros três oligos siRNA diferentes de HSP-27 foram capazes de recapitular fenótipos semelhantes (Fig. S4 no arquivo S1). Estes resultados manifestou que a HSP-27 foi um importante mediador a jusante durante o prometastasis relacionadas com miR-145.

(A) HCT-8-mir-145 (miR-145) ou HCT-8-NC (NC células) foram transfectadas com HSP-27 siRNA (mir-145 + si-Hsp27) ou um controlo negativo siRNA (mir-145 + simulada). A expressão de HSP-27 foi detectado por ensaio Western Blot. (B) a cicatrização de feridas-ensaio para avaliar o efeito de HSP-27 nas células de siRNA-miR-145 HCT-8. (C) Knockdown de HSP-27 por siRNA em células HCT-8-miR-145 invasão celular significativamente inibido. As imagens foram representantes de pelo menos três experiências independentes. Número médio do número de células por campo de invasão a partir de pelo menos três experiências independentes ± SD é mostrado pela figura coluna. **

P

. 0,01

Discussão

A metástase é a marca fundamental de malignidade. Embora existam muitos relatórios da expressão de miR-145 em cancros, o relatório da função de miR-145 no desenvolvimento de metástases de CRC é raramente alguns. No presente estudo, foi investigada a expressão de miR-145 no tecido de cancro primário de pacientes de CRC, com ou sem metástases nódulo linfático. O miR-145 foi identificado a ser underexpressed em amostras de CRC com ou sem metástase linfática em comparação com os tecidos normais adjacentes, respectivamente, o que é consistente com relatórios anteriores por outros [14] – [16]. No entanto, a expressão de miR-145 exibiu um dramático aumento da regulação no CRC com metástases em linfonodos, que estava fora de nossa expectativa. Devido ao nosso conhecimento, a tendência de genes associados a tumores expressão geralmente se mover para uma direção ao longo do desenvolvimento do tumor. Para confirmar o resultado da nossa observação preliminar, a expressão precisa de miR-145 no tecido CRC primária de 103 pacientes com metástase ganglionar e 99 pacientes sem metástase ganglionar foi determinada utilizando qRT-PCR. Cada amostra foi analisada em triplicado e normalizadas contra uma U6 controle endógeno. padrões de calibração rigorosos e grande quantidade de espécimes de tumor utilizadas neste estudo assegurada a credibilidade dos nossos resultados. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa na comparação do nível de expressão de miR-145 em tecidos normais adjacentes entre CRC com ou sem metástase ganglionar. No entanto, foi observada uma clara associação entre a expressão de miR-145 e metástase linfática. Nestas amostras CRC paciente, miR-145 mostraram expressão significativamente maior no cancro com metástases em linfonodos do que aqueles sem metástase ganglionar, que confirmou ainda mais a nossa matriz resultado. Além disso, como os dados foram analisados ​​de várias outras miARNs, observaram-se também o perfil de expressão semelhante de redução, restauração, mas não na parte inferior-regulação, juntamente com o desenvolvimento de CRC (dados não publicados). Estas observações de outros miARNs relacionados CRC confirmou a precisão dos resultados, o que sugere que um miARN talvez exibir diferente perfil de expressão em diferentes fases do cancro. Além diferença estágio, a expressão do miR-145 parece ser dependente do tipo de tecido. Por exemplo, Sachdeva et ai descobriram que a sub-regulação de miR-145 foi mais proeminente no CRC do que no cancro da mama [17]. Todas estas observações indicaram que alguns miARN pode ser multitarefa, interagindo com diferentes genes alvo em várias células e tecidos [18].

Para investigar a relação entre a sobre-regulação de miR-145 com a metástase do cancro colo-rectal, miR-145 estudos ganho de função foram realizados em células humanas utilizando o sistema de CRC lentivírus. Nossos resultados mostraram que a regulação positiva de miR-145 poderia promover a migração CRC e invasão

in vitro

e

in vivo,

enquanto foi observado nenhum efeito sobre o crescimento celular. Estes dados foram consistentes com alguns outros relatórios que mostraram papel anti-oncogénica de miR-145 na metástase. No entanto, os dados derivados a partir destas observações eram ou de outros de cólon [17] tecidos, [19] – [20]. Arndt et al relatam um papel oncogénica de miR-145 em CRC, que está em boa concordância com os nossos resultados [21]. Estas descobertas confirmaram ainda que a função de miR-145 relacionadas com o desenvolvimento do câncer é um tecido do tipo específico.

Este estudo fornece a primeira evidência de que o miR-145 funciona principalmente como um miRNA prometastatic no CRC avançado. É em geral que miRNA específicos individuais podem regular vários genes-alvo, o que sugere que a única miRNA poderiam realizar uma variedade de funções, visando diferentes genes em vários contextos celulares [22]. Na fase inicial de CRC, de miR-145 é regulada para baixo, indicando o seu alvo relacionadas com a proliferação celular. No estágio avançado, de alta expressão de miR-145 pode se relacionar com metas contra a metástase. MiR-17-5p, um miARN bem investigados, poderia ter como alvo genes pró- e anti-proliferativas e agir como um oncogene e um supressor tumoral em cancros diferentes [13], [23] – [24]. MiR-143, outro miRNA câncer associado, a sua expressão é sempre consistente com miR-145 (não o fizemos exame de sua co-expressão com miR-145 em nosso estudo), mostrou multifunções na metástase do câncer [25]. Tomados em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que o miR-145 podem desempenhar uma função complexa no desenvolvimento de CRC.

De modo a revelar possíveis genes efectores que participam nesta função, identificou-se as proteínas celulares que foram directamente ou indirectamente regulado por miR-145 usando rotulagem e iTRAQ 2DLC-ESI-MS /MS. Nossas análises mostraram que a HSP-27 foi regulada no miR-145 overexpressed células CRC. proteína de choque térmico 27 ​​(HSP-27), um importante membro da pequena família Hsp, é expressa ubiquamente em vários tipos de células e envolvida em respostas celulares por uma variedade de tensões, tais como o choque térmico, tensão hipertónica, o stress oxidativo [26] – [27]. Altos níveis de HSP-27 foram encontrados para ser associado com a metástase de vários tipos de tumores, incluindo CRC, cancro da próstata, cancro gástrico, cancro hepatocelular, da cabeça e pescoço cancro das células escamosas [28] – [30]. Em particular, provou-se que o aumento do nível de HSP-27 de expressão em CRC foi relacionado com a metástase de nódulo linfático [31] – [32]. Os nossos resultados mostraram que havia uma correlação forte e positiva entre HSP-27 de proteína e expressão de miR-145 em amostras de tecidos humanos primários, o que indicou que o miR-145 foi envolvida, pelo menos parcialmente, na-se-regulação de HSP-27 de expressão de proteínas .

Knockdown de HSP-27 expressão gênica por siRNA foi encontrado para reverter a indução miR-145-mediada da migração de células CRC em nosso estudo. O papel do miR-145 na manutenção do alto nível de HSP-27 não foi através de gene de objectivos directos mas a estabilização da HSP-27. Embora o papel ea evolução clínica de HSP-27 em tumores primários tem sido bem estudado e documentado [33], a sua função na invasão metástase ainda é incerto. Novas investigações para identificar o mecanismo de HSP-27 envolvidos no CRC metástase vai enriquecer ainda mais a nossa compreensão sobre o aumento da regulação do miR-145 em CRC.

Em resumo, o presente estudo demonstrou que a regulação positiva de miR -145 contribuiu para metástases em linfonodos da CRC. O mecanismo desta contribuição associados com a estabilização de HSP-27, uma proteína que desempenha um papel importante na promoção da metástase. direção futura da avaliação de miR-145 deve concentrar-se no estudo mecanismo que pode levar à sua aplicação no diagnóstico de metástase e tratamento de CRC.

Materiais e Métodos

Amostras clínicas

As amostras de tecido analisadas neste estudo foram obtidas de 202 pacientes (117 homens e 85 mulheres) submetidos a ressecção cirúrgica para CRC no Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências Médicas, Beijing, China. As amostras foram utilizados com os consentimentos informados por escrito dos pacientes e com a aprovação da Academia Chinesa de Ciências Médicas Hospital do Câncer. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da ressecção cirúrgica. As amostras inteiras refletir a distribuição natural das características clínico-patológicas de pacientes com CCR. espécimes ressecados foram histologicamente examinadas por hematoxilina e eosina. tecidos tumorais primárias e correspondentes tecidos não tumorais adjacentes foram imediatamente recolhidos após a remoção cirúrgica e congeladas em nitrogênio líquido para uso posterior. Nós dividimos este grupo de pacientes em dois grupos. Aqueles com LNM confirmada foram denominados como grupo de linfonodos positivos (LNP) e aqueles sem LNM detectável foram denominado o grupo de linfonodos negativo (LNN). Todos os casos foram revistos e confirmados por dois patologistas experientes. As características clínicas desses espécimes são apresentados na Tabela 1.

cultura celular

A linha de células CRC humano HCT-8 foi comprado de Instituto de Ciências Médicas Básicas Academia Chinesa de cultura de células de Ciências Médicas ‘ center (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (Gibco, CA), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C e suplementado com 5% de CO

2 em câmara úmida.

Microarray análise

Oito tecidos de câncer colorretal primário proveniente da etapa II-III doentes com cancro colorectal com (n = 4) ou sem (n = 4) metástases nos linfonodos foram recolhidas e os perfis de miARN de expressão foram determinados usando Agilent miARN microarray. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de amostras de tumores utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion Inc., TX, EUA). A qualidade e quantidade das amostras de ARN foram avaliados por um Bioanalyzer 2100 utilizando o kit RNA 6000 Pico LabChip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O micromatriz contém as sondas para 851 miARNs humanos da base de dados v.12.0 Sanger. Os microarrays experimentos foram realizados em ShanghaiBio Corporação usando Agilent miRNA reagente de rotulagem e hibridação Kits, Agilent matriz miRNA humana (V2) e um scanner microarray da Agilent. Todos os dados de microarray inicial é depositada na base de dados NCBI GEO [GSE48074].

extracção de ARN e em tempo real reversa quantitativa reacção em cadeia da polimerase de transcrição-

O miARN foi purificada a partir de células de cultura ou tecidos que utilizam o Kit Qiagen Mini miRNeasy. Transcrição reversa reacções foram realizadas utilizando MiScript Transcrição Reversa Kit (Qiagen, Alemanha.). Kit MiScript SYBR Green PCR em combinação com iniciadores de miRNA-específica (mir-29b-1 * N ° de Cat MS00009289, mir-95 Cat.No. MS00010906, mir-100 Cat.No. MS00003388, N ° de Cat mir-125b MS00006629, mir-152 Cat.No. MS00003591, mir-376c Cat.No. MS00004046, N ° de Cat mir-199b MS00003731, mir-145 Cat.No. MS00003528, mir-99a Cat.No. MS00003374, mir-1274a N ° de Cat MS00014420, miR-99b N ° de Cat MS00032165, Qiagen, Alemanha.) foram utilizados para detectar miARNs maduros em LightCycler 480 (Roche, Basileia, Suíça). A expressão relativa de miRNA comparação com U6 (cat. Nº. MS00033740, Qiagen, Alemanha.) Foi calculado usando o método -ΔCt. Todas as reacções de qRT-PCR foram realizadas em triplicado.

Geração de lentivírus para atingir o ganho de miR-145 função

Lentivirus pGCsil-GFP do vector foi usado para transportar humana pré-miR-145 (MIR -145) ou controlo não-funcional (NC). construção do vector lentiviral e produção de partículas lentivirais de título elevado foram feitas por Genechem empresa biologia. Os lentivírus gerados foram utilizados para infectar HCT-8 por 24-48 horas a 1-5 MOI, e os níveis de expressão de miR-145 foram determinados por ensaios de qRT-PCR. populações infectadas que apresentam entre as células fluorescentes verdes 70-90% foram utilizados para experimentação posterior.

ensaio de proliferação

As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal. 1 × 10

3 células foram semeadas em placas de fundo plano de 96 placas de poços e incubadas a 37 ° C em 5% de CO2. A viabilidade celular foi medida utilizando células Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) a day1, day3 e day5. Para a análise do ciclo celular, as células foram lavadas e fixadas com gelo frio de 75% (v /v) de etanol a -20 ° C durante 2 h, em seguida, coradas com PI, na concentração de 50 ug /mL na presença de RNase A ( 100 ug /mL). teor de ADN foi analisada por citometria de fluxo (Coulter Beckman, EUA)

ensaios

Migração de Células /invasão

motilidade celular e capacidade invasiva foram determinados por um tamanho de poro de 24 cavidades Transwell placa (8? M.; Costar), como descrito anteriormente.

10 Resumidamente, para Transwell ensaios de migração, 1 × 10

4 células foram colocadas na câmara superior alinhada com a membrana não revestida. Para ensaios de invasão, 3 × 10

4 células foram colocadas na câmara superior de cada pastilha revestida com 200 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences, CA, EUA).

In vivo

ensaios metástases

Para

in vivo

ensaios metástase, 5 × 10

4 HCT-8-miR-145 células ou células HCT-8-nc foram injectados no fígado de ratinhos nus seguida de sutura cirúrgica (três em cada grupo, fêmea nu /nu). Após 2 semanas, os ratinhos foram mortos, os seus fígados foram dissecados, e as metástases de nódulos linfáticos mesentéricos foram contadas. Os ratos nus foram adquiridos de Rio Vital (Pequim, China) e cresceu em um patógeno específico livre de animais de laboratório (SPF). Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pela Academia Chinesa de Ciências Médicas e Peking Union Medical College Comitê de Ética e realizado de acordo com os requisitos legais.

iTRAQ etiquetagem e da análise LC-ESI-MS /MS