Abstract
Fundo
A metástase para o osso é uma características clinicamente importantes de câncer de próstata (PCA). métodos de diagnóstico actuais não podem prever metastático CaP numa fase curável da doença. Identificação das vias metabólicas envolvidas no crescimento de metástases ósseas, portanto, tem o potencial de melhorar CaP prognóstico, bem como terapia.
Metodologia /Principais Achados
Metabolomics foi aplicada para o estudo de metástases ósseas CaP (n = 20) em comparação com o osso normal correspondente (n = 14), e, além disso, de maligna (n = 13) e benigna (n = 17) amostras de tecidos da próstata e correspondente de plasma obtidas a partir de pacientes com (n = 15) e sem (n = 13) e de metástases diagnosticado homens com doença benigna da próstata (n = 30). Isso foi feito utilizando cromatografia gasosa-espectrometria de massas para caracterização da amostra, e bioinformática quimiométricos para análise de dados. Os resultados foram verificados em um conjunto de teste separada, incluindo tecido ósseo metastático e normal de pacientes com outros tipos de câncer (n = 7). Foram encontradas diferenças significativas entre as metástases ósseas, CaP metástases ósseas de outros tipos de câncer, e osso normal. Além disso, foram identificados metabolitos no tecido do tumor primário e no plasma, que foram significativamente associados com doença metastática. Entre os metabolitos nas metástases ósseas CaP especialmente colesterol foi anotada. Em um teste de definir o nivel de colesterol médio no metástases ósseas ACP foi 127,30 mg /g, em comparação com 81,06 e 35,85 mg /g em metástases ósseas de origem diferente e osso normal, respectivamente (P = 0,0002 e 0,001). a coloração imuno-histoquímica de metástases ósseas CaP apresentou coloração intensa do receptor de lipoproteína de baixa densidade e níveis variáveis do receptor eliminador de classe B de tipo 1 e de redutase de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A em células epiteliais de tumor, indicando possibilidades de influxo e
de novo
síntese de colesterol.
metabólitos Conclusões /Significado
Temos identificados associados com PCA metástase e especificamente identificados níveis elevados de colesterol no metástases ósseas APC. Com base em nossos resultados e na literatura anterior, isso faz com que o colesterol um possível alvo terapêutico para CaP avançado
Citation:. Thysell E, Surowiec I, HORNBERG E, Crnalic S, Widmark A, Johansson AI, et al. (2010) metabolômica Caracterização da cancerosas humanas da próstata metástases ósseas Revela Aumento dos níveis de colesterol. PLoS ONE 5 (12): e14175. doi: 10.1371 /journal.pone.0014175
editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 14 de junho de 2010; Aceito: 04 de novembro de 2010; Publicação: 03 de dezembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Thysell et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento: Conceder um apoio : Cancer Society sueco, o Conselho de Pesquisa sueco, a fundação Cancer Research Lions, KEMPE fundação, Knut e Fundação Alice Wallenberg, e a Fundação do Câncer norte da Suécia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de próstata agressivo (PCA), acabou se espalhando para o osso, é uma doença comum e fatal que requer diagnóstico precoce e tratamento eficaz. atuais métodos de diagnóstico; medição dos níveis de antigénio específico da próstata (PSA) em amostras de sangue e análise de biópsias de agulha a partir da próstata sob microscopia de luz, no entanto, não são particularmente eficazes na separação de casos de CaP agressivo das formas ainda mais prevalente e indolentes de CaP que muitas vezes pode ser deixado sem tratamento, ou na separação de cancro da próstata a partir de outros distúrbios não malignos [1], [2]. Usando uma variedade de técnicas de vários investigadores têm, portanto, tentou encontrar novos métodos de diagnóstico e marcadores prognósticos que pode separar agressiva de formas mais indolentes do PCA (revisto em [3]).
Muito esforço foi colocado em reconhecimento de perfis genéticos e proteómica à PCA (revisto em [4]), e espectroscopia de ressonância magnética têm sido usados para explorar as alterações metabólicas associadas com CaP [5], [6], [7]. Zakian e colleauges fornecer uma boa revisão sobre o assunto [8]. Em um artigo recente, no entanto, Sreekumar e seus colegas usaram líquido e cromatografia gasosa – espectrometria de massa de tempo de vôo (GC /TOFMS) para traçar o perfil do metaboloma no tecido, urina e plasma de pacientes APC e das alterações identificadas associados à progressão da doença [9] . Especificamente, eles identificaram a sarcosina, o
N
derivado metil de glicina, como um marcador potencialmente importante para a invasão CaP celular, migração, e agressividade. O estudo Sreekumar em conjunto com outros estudos recentes [10], [11], [12], [13] verdadeiramente indicam que os métodos à base de espectrometria de massa pode ser utilizado para caracterizar as alterações metabolômicos durante a progressão do cancro e mais para identificar possíveis biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico ou de padrões de biomarcadores, bem como aumentar o nosso conhecimento sobre a progressão da doença.
Este estudo foi feito com a hipótese de que os potenciais novos marcadores para CaP agressiva poderia ser descoberto por encontrar fatores marcadamente up-regulamentada em metástases ósseas e, em seguida, examinar se o mesmos factores são também aumentou em amostras de sangue e em tumores primários a partir de pacientes com doença metastática. Por isso, realizaram um estudo metabolômico de metástases ósseas de CaP em comparação com o osso normal, tumor primário e CaP tecido da próstata normal correspondente, usando tecido metastático recolhido no momento da cirurgia de complicações de metástases ósseas [14]. Além disso, foram analisadas amostras de sangue de pacientes com e sem metástases ósseas diagnóstico, com o objectivo de identificar metabolitos que podem ser utilizados para melhorar o prognóstico e terapia de CaP avançado. Os resultados foram verificados em um teste separado set também incluindo tecido ósseo metastático de outros tipos de câncer. Isso foi feito utilizando cromatografia gasosa-espectrometria de massa para a caracterização da amostra e bioinformática quimiométricos para análise e avaliação [15] de dados.
Resultados
metástases ósseas de câncer de próstata mostram diferenças metabólicas claras para óssea normal e para metástases ósseas de outros cancros, incluindo o aumento dos níveis de colesterol
cromatografia gasosa-espectrometria de massa de tempo de voo (GC /TOFMS) foi usada para caracterizar metástases ósseas CaP a partir de 14 pacientes com CaP (7 hormona-naive e 7 pacientes com CRPC) e pedaços de osso que aparecem normalmente adjacentes que estavam disponíveis a partir de 10 dos pacientes (Tabela 1). No total, 123 picos cromatograf icos correspondentes a metabolitos putativos foram encontrados por desconvolução [16] após a exclusão de picos provenientes dos padrões internos, contaminação e artefactos. Dos 123 metabolitos putativos, 49 podia ser atribuída uma identidade pelo seu espectro de massa e índice de retenção correspondente (Figura 1). Ortogonais mínimos quadrados parciais análise discriminante (OPLS-DA) revelou uma separação evidente e estatisticamente significativo (
P
0,001) entre as amostras de osso e metástase óssea normal, independentemente do tratamento, determinados por ANOVA da Cruz modelo validado (Figura 2b). diferenças significativas entre os grupos de amostras (VIP 0,9, importância variável no modelo OPLS-DA ou
P Art 0,05, Mann Whitney U-test) foi encontrado com 58,5% (71 de 123) dos metabolitos putativos (Figura 2a, Tabela S1). Dos 71 metabólitos significativamente discriminantes, 34 poderia ser atribuída uma identidade pelo seu espectro de massa e índice de retenção correspondente, ao passo que 37 só foram atribuídos a uma possível classe composto ou ainda não foram identificados. Para validar a assinatura metabolômica detectado no tecido metastático ósseo e investigar se um padrão metabolito único para CaP existe, um conjunto de amostras adicionais foram perfilado em uma execução separada. Este “conjunto de teste ‘incluiu amostras de metástases ósseas de próstata (6), mama (3), rim (2) e de células escamosas (2) adenocarcinomas, assim como amostras de ossos normais de pacientes correspondente preparado, perfilado e previu como uma coorte de validação separada (Tabela 1). Previsão das metástases ósseas APC e das amostras correspondentes normais do osso (cegos com o modelo) para o modelo de OPLS-DA revelaram uma clara discriminação entre as classes de amostra no conjunto de teste (Figura 2c). Além disso, um modelo OPLS-DA separada deu uma diferença significativa (
P Art 0,001) entre as metástases ósseas APC e das correspondentes amostras normais do osso no conjunto de teste e os metabolitos que separam significativamente esses grupos de amostras (Tabela S2 ) sobrepostas em grande medida com os metabolitos significativos detectados no conjunto modelo (Tabela S1). Além disso, OPLS-DA exposto um (lt P 0,005) evidente e significativa separação entre as metástases ósseas APC e as metástases de outros cancros (Figura S1)
metabolitos identificados são classificados de acordo com a classe química e o número. de metabolitos por classe significativamente associado com a metástase é indicado (
P
0,05, Mann-Whitney U-test, ou VIP 0,9). Classificação dos metabolitos de acordo com a classe química (metaboloma humano DB; www.hmdb.ca). n = número de metabolitos identificados dentro de cada classe metabólito
A) carregamentos de correlação (p [1]) a partir da análise OPLS-DA dos metabólitos significativamente diferenciadores (
P 0,05, Mann Whitney U-teste, ou VIP 0,9) entre metástases ósseas de câncer de próstata e osso normal mostrando valores positivos para metabólitos com níveis aumentados em metástases ósseas e valores negativos para os metabolitos com a diminuição dos níveis de metástases ósseas. Classificação de compostos não identificados de acordo com a classe química (metaboloma humano DB; www.hmdb.ca) B) enredo pontuação OPLS-DA mostrando separação estatisticamente significativa (
P Art 0,001) entre o osso normal e câncer de próstata metástases ósseas. previsões C) conjunto de teste de metástases ósseas de câncer de próstata e amostras de ossos normais correspondentes (cegos com o modelo) para o modelo de OPLS-DA mostrando uma clara discriminação entre as classes de amostra com base na assinatura metabolômica detectado.
Entre os metabólitos detectados em metástases ósseas CaP (Figura 2A e Tabela S1) encontramos aumento dos níveis de vários aminoácidos, em comparação com o osso normal, indicando o metabolismo do ácido amino alta. Consequentemente, os 12 melhores vias canônicas em metástases ósseas CaP sugeridos por análise de sistemas via (Ingenuity Systems, Inc.) foram todos relacionados com aminoácidos síntese de ácidos e metabolismo (Tabela S3). metabolismo de aminoácidos foi também a função de topo listados por análise de caminho Ingenuity para metástases ósseas CaP (Tabela S4). Além disso, foram detectados níveis elevados de colesterol, mio-inositol-1-fosfato, ácido cítrico, fumarato, glicerol-3-fosfato, e ácidos gordos (Tabela S1), que estão relacionados com as funções celulares e moleculares dentro metástases ósseas CaP como indicado na Tabela S4.
indicado especificamente os níveis elevados de colesterol no metástases ósseas CaP como colesterol apresentaram o maior valor de VIP ao diferenciar CaP metástases ósseas de tecido normal do osso (Tabela S1, Figura 2a), bem como de outros metástases ósseas (Tabela S5). Além disso, o colesterol tem sido sugerido para promover o desenvolvimento e progressão do cancro (revisto em [17]), e, portanto, foi escolhido para posterior análise. O alto nível de colesterol no metástases ósseas CaP em comparação com o osso normal (
P
= 3.12E-5, Figura 3a) foi claramente verificada no conjunto de dados de teste (
P
= 0,001, Figura 3b). Interessantemente, os níveis de colesterol em metástases ósseas PCA foi elevada também em comparação com os níveis de metástases ósseas de outros cancros (p = 0,0002, Figura 3b).
. gráfico de caixa para a concentração de colesterol (mg de colesterol /g de tecido) que mostram níveis significativamente mais elevados no câncer de próstata metástases (PCA) do osso em comparação com o osso normal. B. Caixa de trama para a concentração de colesterol (mg /g de tecido) no conjunto de teste que mostra níveis significativamente mais elevados em metástases ósseas de CaP em comparação com o osso normal, bem como em relação a metástases ósseas de outros cancros; mama, rim e câncer epidermóide (BCA, KCa ea SCA). C-E. a coloração imuno-histoquímica do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R), o receptor de limpeza tipo de classe B 1 (SR-B1), e o 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA vermelho.) em CaP osso metástases que mostram a coloração intensa e indicando possibilidades de afluxo, bem como
de novo síntese de colesterol em células epiteliais de tumor, tal como sugerido no FF influxo de colesterol e síntese é estimulada por receptor de androgénio (AR) ação em parte, através da activação do esterol reguladora proteína (SREBP) e subsequente transcrição de LDL-R e HMG-CoA vermelho [24], de ligação ao elemento [25] e androgénios poderia ser fornecida a partir do colesterol por sua conversão em várias fases [27], [28].
metástases ósseas de câncer de próstata têm os mecanismos de absorção e
de novo
síntese do colesterol
o colesterol constitui um potencial alvo terapêutico e, portanto, queria examinar possíveis razões para os níveis elevados de colesterol em metástases ósseas APC. As células podem obter colesterol pelo influxo exógena através do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R), o receptor de tipo eliminador de classe B 1 (SR-B1) ou por
de novo
síntese a partir de acetil-CoA em que a redução de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima a (HMG-CoA) em mevalonato é considerado para ser o passo limitante da taxa de [18], [19]. pedaços e embebidas em parafina a partir das metástases CaP incluídos na análise por GC /TOFMS foram imunocoradas, por conseguinte, para o LDL-R, SR-B1 redutase e inibidores da HMG-CoA redutase. Todos os casos CaP apresentou forte coloração homogénea de LDL-R de células epiteliais metastáticas e ocasionalmente coloração menos intensa de células do estroma adjacentes, células endoteliais, adipócitos e células de osso (Figura 3C, Tabela 2). A coloração epitelial da redutase de SR-B1 e HMG-CoA-redutase foi mais heterogéneo, variando de fraca a intensa (Tabela 2). Curiosamente, HMG-CoA redutase mostraram coloração particularmente intensa em células endoteliais, as paredes dos vasos, células imunes e células de osso (Figura 3E), enquanto SR-B1 mostrou coloração estroma negativa (Figura 3D). Os nossos resultados mostram que as células epiteliais tumorais em CaP metástases ósseas possivelmente sintetizar colesterol
de novo através de HMG-CoA redutase, mas também que outros tipos de células em metástases ósseas do micro-ambiente de expressar essa enzima, possivelmente permitindo-lhes fornecer colesterol que pode ser absorvido pelas células tumorais epiteliais através do LDL e receptores SRB-1 (Figura 3F). Não houve relação evidente entre a heterogeneidade em imunocoloração SR-B1 e de HMG-CoA e os níveis de colesterol correspondentes nas metástases ósseas CaP (dados não mostrados). É interessante notar, no entanto, as metástases ósseas CaP apresentou geralmente mais forte imunocoloração de LDL-R e SR-B1 do que as metástases ósseas de origem diferente (Tabela 2), possivelmente contribuindo para os níveis de colesterol relativamente mais elevados visto nas metástases de CaP (Fig. 3) .
diferenças metabólicas entre tecidos tumorais da próstata primário de pacientes de alto risco com e sem metástases ósseas estabelecidos
tecido primário CaP obtido de pacientes com tumores de alto risco (definidos como localmente avançados ou pobremente diferenciadas do cancro; fase T3-4 e /ou GS 8-10) com (M1, n = 7) ou sem (M0, n = 6) metástases ósseas foram diagnosticados perfilado em comparação com amostras benignas da próstata (n = 17, tabela 3). Isto resultou em 157 picos de metabolitos putativos dos quais 59 podem ser atribuídas a um de identidade (Figura 1). discriminação clara e estatisticamente significativa (P 0,001), determinado por análise de variância do modelo de cross-validada, entre todas as classes de tecido de três próstata (benigno, M0 e M1) foi revelado pela modelagem OPLS-DA (figura S2). Alterações significativas associadas com a doença metastática, definidos como alterações em metabolitos M1 vs vs benigna e M1 M0 (P 0,05 ou VIP 0,9) foram detectadas para 13 de metabolitos que foram identificados oito (Tabelas S6 e S7). Interessantemente, quatro das quais também foram significativamente aumentados em amostras de metástases ósseas, em comparação com o osso normal; asparagina, treonina, ácido fumárico e ácido linoleico (Tabela S1).
perfis de metabólitos distintivas no plasma sanguíneo de pacientes com tumores de alto risco com e sem metástases ósseas estabelecidos
Investigação de o metaboloma de plasma de pacientes com CaP com (M1, n = 15) e sem (M0, n = 13) metástases ósseas diagnosticada e homens com doença benigna foi baseado em 179 metabolitos putativos resolvidos, e dos 50 poderia ser atribuída uma identidade (Figura 1). Apesar da clara sobreposição nos níveis de PSA no soro (Tabela 3), uma separação significativa (P 0,003) usando a modelagem OPLS-DA foi obtido pela diferença entre M1 e plasma benigna, bem como entre M1 e plasma M0, determinado por ANOVA da atravessar modelos validados. Vinte e sete metabolitos, sete identificados, foram encontrados como alterada significativamente (P 0,05 ou VIP 0,9) no plasma sanguíneo de doentes M1 em comparação com pacientes com benigna (Tabela S8) e doença M0 (Tabela S9). Curiosamente, destes 27, quatro metabolitos; ácido glutâmico, taurina, e fenilalanina (elevados no sangue) e ácido esteárico (diminuição no sangue) foram também encontradas como marcadores de metástases no osso (Tabela S1). Um resumo de todos os metabolitos identificados em diferentes tipos de amostras são apresentados na Tabela S10 e os dados podem ser encontrados em um arquivo de dados de suporte (Data S1).
níveis de sarcosina em amostras de tecido e plasma
níveis sarcosina foram medidos separadamente nas amostras utilizando AccQ • derivatização Tag seguido por análise LC /MS. A análise mostrou um aumento de sarcosina em metástases ósseas de CaP em comparação com o osso normal, enquanto que poderia ser observada qualquer diferença em relação a metástases ósseas de outros tipos de cancro (Figura S3). Além disso, nenhuma progressão da doença claro foi observado quando comparando os níveis de sarcosina entre benigna da próstata e do tecido de tumor da próstata primário, embora o número de baixo (n = 5) de extractos de tumores primários disponíveis para esta análise afectar a fiabilidade dos resultados, e também fez uma comparação entre o tumor primário e tecidos metástase óssea não confiáveis. Comparações dos níveis de sarcosina no plasma sanguíneo não revelou diferenças significativas relacionadas com CaP ou a presença de metástases ósseas (dados não mostrados).
Discussão
Nós aqui, pela primeira vez, o relatório de um análise abrangente de padrões metabólicos em metástases ósseas CaP em comparação com CaP primário, tecido benigno da próstata e tecido ósseo normal. Encontraram-se os metabolitos que diferenciam metástases ósseas CaP de amostras óssea normal e, para além disso, a partir de metástases ósseas de origem diferente. Nós também descobrimos que metabolitos, em contraste com o PSA, mostraram níveis de plasma e tumor primário alterados em indivíduos com CaP metastático em comparação com pacientes com tumores de alto risco, mas sem metástases detectáveis. Uma das nossas descobertas mais notáveis é elevados níveis de colesterol no metástases ósseas APC, o que provavelmente é atingido por
de novo síntese de colesterol em células epiteliais de tumor, bem como afluxo deste metabolito a partir do ambiente por meio de LDL R e SR-B1.
O aumento da biodisponibilidade do colesterol em células de tumor podem ter alta relevância biológica de metástases ósseas de crescimento, como a suplementação de colesterol tem sido demonstrado que o aumento da proliferação de células tumorais CaP, migração e invasão
in vitro
[20], enquanto segmentação colesterol induz a apoptose [21], provavelmente, diminuindo o teor de colesterol jangada lipídica e interferindo assim com fator de crescimento sinalização [21], [22]. A próstata contém normalmente níveis elevados de colesterol em comparação com outros órgãos e aumento dos níveis de colesterol foram previamente associados com CaP [23]. Além disso a elevação dos níveis de colesterol em metástases ósseas poderia obviamente reflectir elevada procura de biossíntese de membrana em células em proliferação, mas também o facto de o metabolismo do colesterol é directamente regulada por androgénios (revisto em [24]). Os androgénios regular positivamente LDL-R transcrição do gene e também promover a síntese de colesterol, aumentando a transcrição da HMG-CoA-redutase [25] e, portanto, a conversão limitante da velocidade da HMG-CoA em mevalonato [26]. Como os receptores de andrógenos são expressos e presumindo activo numa maioria de metástases ósseas em CRPC [14], as acções de androgénio que provavelmente contribui para os níveis mais elevados de colesterol em metástases de CaP em comparação com metástases ósseas de origem diferente. Colesterol, por sua vez, possivelmente contribui para a sinalização do receptor de androgénio e, assim, o crescimento do tumor resistentes a castração, em pacientes tratados com a terapia de privação de androgénio, pela sua conversão em androgénios pelas enzimas metabólicas [27], [28]. Por conseguinte, um western níveis de dieta e séricos elevados de colesterol têm sido associados ao aumento do risco de CaP em vários estudos [29], [30], [31], embora os resultados não têm sido completamente conclusiva (revisto em [17]) . Curiosamente, um estudo recente mostra um menor risco de desenvolvimento de alto grau de PCA para homens com baixos níveis de colesterol sérico [32] e, em consonância com isto, o uso a longo prazo da HMG-CoA redutase ( “estatinas”) para a prevenção de doenças cardiovasculares têm sido mostrados para reduzir o risco de progressão para doença agressiva CaP, fatal [33], [34], [35], [36]. agentes redutores de colesterol também foram mostrados para inibir o crescimento de células CaP
in vitro Comprar e no modelo de sistemas experimentais
in vivo
[37], [38]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam a possibilidade de utilização de inibidores de colesterol como tratamento ou quimiopreventivos agentes para CaP metástase, mas novos medicamentos são, então, necessário como as estatinas utilizadas hoje concentrar-se principalmente para o fígado e mal atingir órgãos periféricos [17].
Nós encontramos níveis elevados de muitos aminoácidos dentro das metástases ósseas APC, e metabolismo de aminoácidos era a via funcional mais alterado associado a metástases ósseas APC, segundo o análise de caminho Ingenuity. Os nossos resultados apoiam assim a metabolômico estudo com base em pelo Sreekumar e colaboradores [9] e também estudos anteriores à base de gene de expressão que mostram a síntese de proteínas aumentaram durante a progressão CaP [39]. Curiosamente, um artigo recente de alto relevo que também os níveis de aminoacil tRNA sintetases (aaRSs) são aumentados durante a progressão da APC e, além disso, que a transcrição de alguns aaRSs é estimulada por androgénios [40]. Esta constatação notável poderia possivelmente ser ligada ao facto de que foi encontrado um aumento dos níveis de alguns aminoácidos, tais como treonina, glutamato, fenilalanina dentro de metástases ósseas de CaP em comparação com metástases ósseas de origem diferente. Para além dos aminoácidos, outros metabolitos notáveis nos nossos dados (ácido cítrico, fumarato, glicerol-3-fosfato, e ácidos gordos) indicam um elevado metabolismo de energia que pode reflectir a elevada fracção de proliferação de células dentro de metástases ósseas [14]. Além disso, os altos níveis de mio-inositol-1-fosfato pode ser um sinal de sinalização celular activa envolvendo moléculas baseadas em inositol como segundos mensageiros, tais como fosfatos de inositol e fosfatos de fosfatidilinositol. Estas moléculas estão envolvidas na activação da proteína quinase C e Akt e, assim, na regulação dos processos considerados como imagem de marca do cancro, isto é, a proliferação de células, a apoptose, diferenciação, invasão, angiogénese e [41]. No geral, as alterações no metaboloma detectados neste estudo como associado a metástases ósseas ACP revelou funções moleculares e celulares perturbadas de clara relevância para a progressão do câncer. A importância relativa destas funções são no entanto difícil atribuir, visto que, em parte, dependem das classes de metabolitos detectáveis na análise por GC /TOFMS e as identidades obtidos dentro de bibliotecas actualmente disponíveis. Com a /TOFMS método metabolito profiling GC não foram capazes de detectar sarcosina nas amostras. No entanto, usando uma abordagem de análise orientada, encontramos altos níveis de sarcosina em metástases ósseas de acordo com descobertas anteriores de aumento dos níveis de sarcosina com progressão CaP [9]. Importante, porém, nós não ver qualquer diferença nos níveis de sarcosina entre metástases ósseas APC e metástases ósseas de origem diferente, indicando que a sarcosina não é CaP específica, mas em vez associado com câncer avançado e metástase. Uma visão mais abrangente das redes biológicas específicas de importância para CaP metástases crescimento será obtido como métodos de análise de desenvolver e bibliotecas para identificação obter mais completa, mas também poderia ser alcançada pela combinação de dados metabolômica com dados genômicos ou proteômica. Até agora, especificamente, note que treonina, asparagina, ácido fumárico, e ácido linoleico são aumentados não apenas em metástases ósseas, mas também no tecido da próstata primário a partir de pacientes com metástases ósseas confirmado quando comparados com pacientes M0. de ácidos gordos essenciais tais como ácido linoleico foram mostrados para estimular o crescimento CaP tumores em sistemas modelo [42], [43], e a conversão do ácido linoleico em ácido araquidónico e mais em prostaglandinas poderia estimular uma resposta inflamatória que é associado com patogénese do CaP [44].
nem o colesterol nem sarcosina foram, no entanto, de prognóstico para metástases ósseas em plasma. Em vez disso, níveis elevados de ácido glutâmico, fenilalanina, taurina e foram encontrados em tecido CaP metástase óssea e no plasma a partir de homens com metástases ósseas CaP diagnosticados. ácido glutâmico foi recentemente demonstrado no estudo de Sreekumar e colegas de ser aumentado no tecido CaP [9] e, curiosamente, as células cancerosas que causam interrupção óssea em modelos animais secretam glutamato no seu ambiente [45]. Como a comunicação intercelular glutamatérgica é importante para a homeostase normal do osso através de receptores de glutamato em células ósseas específicas (revisto em [46]), é possível que os distúrbios dentro deste sistema pode ser detectado durante o processo de metástase óssea. Nossos resultados também estão de acordo com um estudo recente que encontrou níveis de taurina mais frequente na PCA do que em tecido benigno quando avaliada usando ângulo mágico girando ((1) H HR-MAS) espectroscopia de RMN [47]. O valor destes metabolitos como marcadores de plasma para CaP agressiva no entanto deve ser confirmado em estudos posteriores.
Em conclusão, nós identificamos metabólitos associados com a metástase do câncer de próstata e, especificamente, observou níveis elevados de colesterol em metástases ósseas APC. Com base em nossos resultados e na literatura anterior, isso faz com que o colesterol um possível alvo terapêutico para CaP avançado. Embora este é o maior estudo metabolômica de metástases ósseas CaP realizada certamente tem suas limitações. Estudos anteriores
1H NMR revelaram mudanças evidentes nos níveis de citrato e de colina entre benigna da próstata e tecido tumoral [5], [6], [7] mas um pouco preocupante, não fomos capazes de encontrar essas diferenças nos níveis de citrato. Nem poderíamos com o nosso método de detectar colina. Estes resultados não destacar as limitações do nosso método e apontam para a necessidade de abordagens complementares na busca de biomarcadores metabolômica úteis. Além disso, o bastante baixo número de pacientes incluídos ea heterogeneidade da doença metastática fazer avaliação em estudos necessários antes de o significado dos nossos resultados poderiam ser assegurada.
Materiais e Métodos
declaração Ética
os estudos foram aprovados pelo conselho de revisão ética local do Umeå University e os participantes leram e assinaram ou consentimento verbal.
Amostras
as metástases ósseas e adjacentes normalmente aparecem pedaços de tecido ósseo foram obtidos a partir de um série de biópsias de congelação fresca coletadas de pacientes com diagnóstico de câncer ou suspeita de câncer, operado por compressão da medula espinhal metastático ou fraturas patológicas (Tabela 1). Os pacientes foram minuciosamente descrito em [14].
O plasma sanguíneo estava disponível a partir de uma série de homens que foram submetidos a biópsias por agulha guiada por ultra-som transretal da próstata, devido ao aumento dos níveis séricos de PSA, e PCA primário e benigna da próstata As biópsias foram avaliável em alguns casos (Tabela 3). Os pacientes incluídos no estudo foram todos seleccionados de ter tumores de alto risco como definidos; presença de metástases ósseas ou de um tumor localmente avançado ou um cancro fracamente diferenciado (M1 e /ou T3-4 e /ou GS 8-10), enquanto homens com doença benigna tinha, pelo menos, dois ciclos de biópsias negativas. Os casos APC e os casos benignos foram pareados de acordo com o tempo desde a amostragem. Informações adicionais sobre os pacientes e preparação da amostra é dado no texto de apoio (Texto S1).
perfil metabolômica usando GC /TOFMS
Antes da análise GC /TOFMS os baixos metabólitos peso molecular em amostras de plasma foram e extraiu-se derivatizado como descrito anteriormente [48]. As amostras de tecido foram extraídas com H
2O /metanol /clorofórmio (01:03:01) mistura contendo 11 padrões internos A [48] (1 ml por 15 mg de tecido), distribuídos uniformemente ao longo do período de retenção cromatográfica. A extracção foi feita em moinho de esferas com duas esferas de tungsténio e o resto do procedimento foi o mesmo que para as amostras de plasma. extractos de amostras derivatizadas foram então injectados no modo de splitless por um amostrador automático Pal CTC Combi (CTC Analytics AG, Zwingen, Suíça) em um cromatógrafo de gás Agilent 6890 equipado com um d.i. 10 m × 0,18 milímetros coluna capilar de sílica fundida com um ligado quimicamente 0,18 uM 5 DB-MS de fase estacionária (J W Scientific, Folsom, CA, EUA). O efluente da coluna foi introduzido na fonte de iões de um espectrómetro de massa de tempo-Pegasus III de-voo, GC /TOFMS (Leco Corp, St. Joseph, MI, EUA). Uma serie alcano (C10-C40) foi executado para cada separado prazo GC /TOFMS. Mais detalhes sobre a preparação da amostra, derivação e GC /TOFMS análises podem ser encontradas nas informações complementares. A reprodutibilidade do método foi relatado anteriormente [16], [48].
O processamento de dados
Os dados pré-tratamento, incluindo a correção de linha de base, o alinhamento cromatograma, ajuste-janela de tempo, curva multivariada hierarquizada resolução (H-MCR) [11] e normalização foram realizados em MATLAB [versão 7.3] usando scripts personalizados. Mais detalhes sobre o processamento de dados pode ser encontrada na informação de suporte (Texto S1)
análise
Dados e Estatística
Orthogonal mínimos quadrados parciais -. Análise discriminante (OPLS-DA) [49] foi aplicado para extrair e interpretar a variação sistemática nos tecidos e no plasma /TOFMS perfis GC resolvidos relacionadas com respostas específicas. O objetivo era extrair padrões metabólicos relacionados com a APC e mais especificamente para a doença metastática.