Abstract

caixa de forkhead M1 (FOXM1) é um fator de transcrição associado proliferação essencial para a progressão do ciclo celular. Numerosos estudos têm documentado que FOXM1 tem múltiplas funções na tumorigênese e seus níveis elevados são frequentemente associados com a progressão do câncer. Aqui, nós caracterizamos o papel da ERK sinalização /FOXM1 na mediação do potencial metastático de células de cancro do ovário. A análise imuno-histoquímica (IHQ), immunoblotting e semi-quantitativa RT-PCR constatou que tanto fosfo-ERK e FOXM1 eram frequentemente regulada no cancro do ovário. Curiosamente, o overexpressed fosfo-ERK (

p Art 0,001) e FOXM1 (

p Art 0,001) foram significativamente correlacionada com tumores ovarianos de alta qualidade com comportamento agressivo, como linfonodo metástase (5 de 6). Além disso, as expressões de fosfo-ERK e FOXM1 teve correlação significativamente positiva (

p Art 0,001). Funcionalmente, expressão ectópica de FOXM1B notavelmente melhorada a migração de células /invasão, enquanto FOXM1C não só aumentou a proliferação celular, mas também promoveu a migração de células /invasão. Por outro lado, a inibição da expressão FOXM1 por qualquer tiostreptona ou U0126 poderia comprometem significativamente FOXM1 mediada capacidades oncogênicos. No entanto, a regulação negativa de FOXM1 por qualquer tiostreptona ou U0126 necessária a presença de p53 em células de cancro do ovário. Coletivamente, nossos dados sugerem que a sobre-expressão de FOXM1 pode resultar da ERK constitutivamente activo que confere as capacidades metastáticos para células de cancro do ovário. O comprometimento do potencial metastático de células de câncer por inibidores FoxM1 ressalta seu valor terapêutico em tumores ovarianos avançados

Citation:. Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Yao KM, et al. (2011) aberrante A ativação de ERK /FOXM1 cascata de sinalização Aciona a migração celular /Invasion em células de câncer de ovário. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10.1371 /journal.pone.0023790

editor: Maria G. Castro, da Universidade de Michigan, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de dezembro de 2010; Aceito: 26 de julho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lok et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Fundação Wong Cheuk Ela Charitable. Este apoio é de doações privadas, e website de nenhum financiador está disponível. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é uma das doenças malignas ginecológicas mais letais em todo o mundo. Devido aos sintomas não específicos, a maioria dos casos de cancro do ovário são apresentados com doença em estágio avançado e associada com alta taxa de mortalidade [1]. No cancro avançado do ovário, células de tumor são altamente invasivo e metástases do cancro subsequente conduz à morte [2]. Tanto a migração celular e invasão contribuir a capacidade metastática de células tumorais e o mecanismo genético que regula metástase permanece em grande parte desconhecida. Portanto, é de suma importância identificar mediadores moleculares que conferem o potencial metastático de células de cancro do ovário que podem ser utilizados como marcadores tumorais na previsão de risco de progressão do cancro do ovário.

forkhead Box M1 (FOXM1) é uma transcrição típica fator que pertence à família forkhead Caixa de [3]. FOXM1 é bem conhecida pelo seu papel fundamental na progressão do ciclo celular através do controlo G1 /S e G2 /M fases de transição do ciclo celular e garantir uma execução correcta de divisão mitótica da célula [3], [4], [5]. No entanto, evidências crescentes suporta uma ligação entre a expressão aberrante de FOXM1 e carcinomas humanos, como câncer de pâncreas, carcinomas basocelulares, glioblastomas e câncer cervical [6], [7], [8], [9]. Mais importante ainda, o aumento da expressão de FOXM1 tem notável correlação com os estágios progressivos de numerosos cancros humanos [6], [9], [10], [11], [12]. Assim, FOXM1 não só promove tumorigênese dotando capacidade proliferativa e levando a divisão celular descontrolada no período inicial do desenvolvimento do câncer, mas também melhora outros comportamentos tumorigênicos em outros estágios de desenvolvimento de câncer [12], [13], [14]. Até à data, várias linhas de evidência mostraram que FOXM1 pode melhorar a angiogénese em células de glioma [15], a capacidade de crescimento independente de ancoragem em células de cancro do colo do útero [6], a capacidade de crescimento do tumor de células de glioma de [7] e a metástase de células de carcinomas hepatocelulares nas ratinhos nus [16], o que implica os diversos papéis de FOXM1 na tumorigênese. Recentemente, o Cancer Genome Atlas Research Network tem usado um modelo gráfico probabilística (PARADIGMA) para provar que a sinalização FOXM1 é criticamente associada a fisiopatologia do câncer de ovário seroso [17]. No entanto, o status de expressão e papéis funcionais de FOXM1 em câncer de ovário, especialmente na migração de células /invasão são em grande parte especulativo. Isso destaca a necessidade urgente de delinear o mecanismo molecular subjacente à progressão do cancro de modo a aumentar a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário.

A activação constitutiva da sinalização ERK está normalmente associado com a transformação neoplásica como crescimento celular descontrolado por estimulando percurso de sobrevivência celular e aumento da motilidade celular [18], [19], [20], [21]. Estudos anteriores relataram que actua a montante de ERK FOXM1 e a fosforilação de ERK pela FOXM1 são necessários para a translocação núcleo e subsequente transactivação [22]. Além disso, FOXM1 tem sido mostrado para ser um dos efectores ERK no carcinoma hepatocelular humano e cancro da mama [23], [24]. No entanto, a função de ERK /FOXM1 cascata na regulação da migração celular de sinalização /invasões ainda não foi claramente elucidada.

Neste estudo, em primeiro lugar, analisou o status de expressão e correlação clínico-patológico de FOXM1 no câncer de ovário. Vários ensaios tumorigênicos foram realizados em modelos de células de cancro do ovário usando gain- e perda de função do FOXM1 através da expressão forçada de FOXM1 ou inibição de FOXM1 endógeno, através de tiostreptona ou U0126. Nós também deu os dados que mostram a importância de o estado de p53 na utilização de inibidores de FOXM1. Além disso, desde o primeiro

in vitro

evidência de ERK /FOXM1 cascata de sinalização na promoção da migração celular /invasão em células de cancro do ovário. Isto confere um alvo encorajadores na luta contra o câncer de ovário avançado.

Resultados

FOXM1 é sobre-expresso e correlaciona-se com a expressão pERK e subtipo de alto grau de câncer de ovário

Para estudar foi realizado o significado da expressão FOXM1 no desenvolvimento do cancro do ovário, a análise IHC em uma matriz de tecido comercial de 97 amostras de tecido ovariano, incluindo 2 normal, 2 benigna, 1 cystademoma borderline e 96 amostras de tumores malignos. expressão alta FOXM1 foi significativamente correlacionada com tumores de alto grau (grau 3) (

P Art 0,001), no qual 73,33% de grau 3 tumores casos exibiu sobre-expressão de FOXM1 que 68% dos graus 1 e 2 casos de tumores apresentou baixa expressão de FOXM1 (Tabela 1). Em relação ao subtipo do tumor, a expressão de FOXM1 foi altamente correlacionada com adenocarcinoma endometriod (

P

0,05), em que 74,07% dos casos demonstrou a sobre-expressão de FOXM1 (Tabela 1). Além disso, em 5 de 6 casos com metástase ganglionar mostrou sobre-expressão de FOXM1 (dados não mostrados). Apesar do tamanho limitado da amostra, que poderia ser uma referência para uma associação entre FOXM1 e metástases à distância. Além disso, foi detectada uma correlação notável entre a sobre-regulação de ambos FOXM1 e pERK (

P

0,001) (Tabela 1). Semelhante a FOXM1, foi detectada uma correlação significativa entre a expressão de pERK e tumores de alto grau (

P Art 0,001), no qual 66,67% de grau 3 tumores mostrou alta expressão de pERK (Tabela 2). Também foram observados fracos a muito forte coloração concordante de pERK e FOXM1 de cystademoma limítrofe ao grau 3 de tumor, implicando a importância das duas proteínas na progressão tumoral de cancro do ovário (Fig. 1A).

(A) representativas IHC mostraram os imunoreatividades de FOXM1 e pERK na fronteira, de Grau 1, Grau 2 e Grau 3 tumor em uma matriz de tecido de câncer de ovário (OVC1021) (x20). coloração crescente de ambos FOXM1 e vantagem foi observada, juntamente com a progressão do cancro que implica o seu papel potencial na tumorigénese. (B) Western blot mostrou as expressões de Perk, ERK e FOXM1 nas mangueiras e linhas celulares de cancro do ovário. (C) em tempo real de análise de QPCR revelou as expressões de isoformas FoxM1;

FOXM1B

e

FOXM1C

nas mangueiras e linhas celulares de cancro do ovário.

FOXM1A

foi negligenciado neste experimento, pois foi relatado como sendo transcricionalmente inativa.

Para o estudo linhas celulares, as expressões de pERK e FOXM1 também demonstraram uma boa correlação em um painel de câncer de ovário e de linhas celulares mangueiras. Ambas as proteínas foram altamente expressa em linhas de células cancerosas, especialmente em OVCAR3, SKOV3, OVCA429 e A2780cp, enquanto que eles mostraram expressões mais baixas em linhas celulares de mangueira (Fig. 1B). Da mesma forma, a análise em tempo real utilizando iniciadores de QPCR específicos de acordo com o relatório anterior [12] revelou que ambos

FOXM1B

(27 a 250 vezes) e

FOXM1C

(25-172 vezes) foram-se -regulated em linhas celulares de cancro do ovário, em comparação com as linhas celulares de mangueira (Figura 1C). Este resultado foi consistente com os resultados de análise de Western blot e também mostrou que não houve diferença dos padrões de expressão entre duas isoformas em células de cancro do ovário. Colectivamente, estes dados sugerem que tanto a actividade ERK e expressão FOXM1 são up-regulada e positivamente em cancros do ovário, especialmente em tumores agressivos de alta qualidade, o que implica a partilha de um caminho comum na progressão do cancro do ovário.

FOXM1 promove a proliferação celular e migração celular /invasão

uma vez que tumores de alto grau foram altamente proliferativa e metastático, que argumentou que FOXM1 desempenha um certo papel na regulação da motilidade celular e invasão. Para sondar os papéis oncogênicos de FOXM1 em câncer de ovário, foram avaliados os efeitos funcionais de duas isoformas activas FoxM1, FOXM1B e FOXM1C, em A2780cp e OVCA433 células (Fig. 2A). Consistente com relatórios anteriores [14], [25], FOXM1C poderia aumentar a capacidade de proliferação de células em A2780cp (

P

0,005) e OVCA433 (

P

= 0,006), as células de cancro do ovário, enquanto FOXM1B apenas mostrou aumento ligeiro efeito (Fig. 2A). Por outro lado, a expressão ectópica de FOXM1B e FOXM1C poderia promover o fecho da ferida mais rápido e em A2780cp OVCA433 células de cancro do ovário pela cicatrização de feridas de ensaio (Fig. 2B). Por transpo� ensaios de migração /invasão, a introdução de FOXM1B e FOXM1C também mostrou um aumento da migração significativa de células (

P Art 0,05 em A2780cp e

P Art 0,005 em OVCA433). (Fig 2C ) e invasão celular (

P Art 0,05 em A2780cp e

P

. 0,01 em OVCA433) (Fig 2D) habilidades em A2780cp e OVCA433 células em comparação com os controles de vetor. Curiosamente, FOXM1B teve influência relativamente fortes na promoção da migração celular e invasão em comparação com FOXM1C. Tomados em conjunto, estes dados que conferem isoformas FOXM1 pode diferencialmente promover a proliferação celular, migração /invasão de células de cancro do ovário.

ensaio de proliferação celular (A) demonstraram que o XTT FOXM1C poderia aumentar notavelmente a proliferação de células de em A2780cp (*

P Art 0,005) e OVCA433 (**

P

= 0,006) células de cancro do ovário, enquanto FOXM1B tinha acabado um pouco efeito. Western blot mostrou as expressões de FOXM1B (1B) e FOXM1C (1C) em A2780cp e OVCA433 células usando anti-FOXM1 (K19). O vector vazio foi utilizado como controlo negativo (V). (B) ensaio de cicatrização de feridas apresentaram taxa mais rápida da ferida encerramento da FOXM1B ou FOXM1C ectópica expressar A2780cp (*

P Art 0,05) e OVCA433 (**

P Art 0,01) células, em comparação com controle de vetores (*

P Art 0,05). (C) ensaio de migração Transwell e o gráfico de barras apresentaram maior taxa migratória em FOXM1B e FOXM1C células que expressam ectópicas de A2780cp (*

P Art 0,05) e OVCA433 (*

P Art 0,005 ) em comparação com os controles de vetor (V). (D) ensaio de invasão de células Transwell e o gráfico de barras apresentaram maior taxa de invasão através da membrana Matrigel-revestidas em FOXM1B e FOXM1C ectópica células que expressam de A2780cp (*

P Art 0,05) e OVCA433 (*

P Art 0,01) em comparação com os controles de vetor (V). As experiências anteriores foram realizadas três vezes de forma independente e o resultado foi plotado.

A inibição eficaz de expressão FOXM1 por tiostreptona requer p53

O tiostreptona antibiótico tiazol pode inibir especificamente a expressão de FOXM1 no gene nível promotor em linhas celulares de cancro da mama [26], e, por conseguinte, foi utilizada para esgotar a expressão de FOXM1 em células de cancro do ovário. Sob tratamento tiostreptona, observamos diferentes respostas dos FOXM1 em linhas celulares de cancro do ovário que transportam diferentes status p53 genotípicas: OVCA433 (p53 tipo selvagem), A2780cp (mutante p53) e SKOV3 (p53 excluído). células A2780cp OVCA433 e mostrou uma queda acentuada de expressão FOXM1 em um tempo e modo dependente da dose, bem como um aumento da expressão de p53 na dose mais elevada (20 pM) de tiostreptona (Fig. 3A). Por outro lado, SKOV3 era resistente à tiostreptona e FOXM1 expressão sustentada no 10, 30 e 50 uM. Estes achados sugerem que p53 pode estar envolvido no mecanismo de tiostreptona atuação. Considerando-se os papéis muito opostas de p53 e FOXM1 na regulação do ciclo celular e o impacto negativo do p53 na expressão FOXM1 mostrado no resultado micro-array anterior [5], [27], [28], [29], [30], nós avaliada a expressão de FOXM1 mediante alteração da expressão de p53 em células de cancro do ovário. transfecção transiente de p53 notavelmente reduzida FOXM1 não só no nível de proteína (Fig. 3B), mas também no nível de ARNm (Fig. 3C) em OVCA433, A2780cp e SKOV3. Estes resultados indicam que a p53 regula negativamente a ambos os níveis de proteína de FOXM1 ARNm e p53 e é essencial para a tiostreptona para exercer a inibição de expressão FOXM1 em células de cancro do ovário.

(A) transferência de Western revelou a sub-regulação de FOXM1 e a sobre-regulação de p53 em linhas celulares de cancro do ovário; OVCA433 e A2780cp, mas não em células SKOV3 mediante tratamento de tiostreptona sob várias dosagens e intervalos de tempo. (B) Western blot mostraram que a transfecção transiente com p53 poderia suprimir a expressão FOXM1 em células de cancro do ovário (OVCA433, A2780cp e SKOV3). (C) PCR em tempo real indicada down-regulação da

FoxM1

transcrições sobre a transfecção transiente de p53.

Down-regulação da FOXM1 prejudica a migração de células /invasão

a hipótese que tiostreptona pode reprimir a célula de cancro do ovário a migração /invasão por inibição da expressão de FOXM1. Desde tiostreptona poderia induzir efeito apoptótico em células cancerosas [26], os ensaios de XTT foram realizadas três vezes para excluir o factor de viabilidade celular reduzida, a qual pode afectar a precisão do uso de tempo de encerramento de feridas para a avaliação da migração celular. De facto, a viabilidade celular das linhas celulares acima não mostrou alterações significativas após tratamento da gama de dosagem de 0 a 10 uM de tiostreptona (Fig. S1). Após o tratamento com tiostreptona, OVCA433 células mostrou uma repressão óbvio de migração celular, com ~ 50% de diminuição da taxa de fecho da ferida, em comparação com o controlo não tratado no ensaio de cicatrização da ferida (

P

0,05). (Figura 4A ). Foi observado um efeito inibitório semelhante na migração celular em células A2780cp (dados não mostrados). No entanto, o tratamento em SKOV3 mostrou nenhuma influência significativa sobre a inibição da migração de células (Fig. S2). Além disso, o tratamento de 10 uM de tiostreptona sobre OVCA433 também reduziu dramaticamente a migração de células de aproximadamente 37% (

P

0,05), e a invasão de células de 75% (

P

0,05) em comparação capacidades com controlos em Matrigel de ensaio (Fig. 4B). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que FOXM1 regula de forma significativa a proliferação celular e migração de células /invasão de células de cancro do ovário.

(A) Wound healing ensaio apresentaram menor taxa de encerramento de feridas de células tratadas com OVCA433 tiostreptona, em comparação com o controlo não tratado (*

P Art 0,05). (B) Transwell ensaio de migração e o gráfico de barras mostrou significativamente menor número de células migratórias através da membrana Matrigel-revestidas em células OVCA433 depleção de FoxM1 do que o controle (*

P Art 0,05) (

parte superior

). Transwell ensaio de invasão celular e o gráfico de barras apresentaram menor taxa de invasão em células OVCA433 depleção de FoxM1 após o tratamento tiostreptona quando comparado com o controle (*

P Art 0,05) (

menor

). (C) transferência de Western revelou a sub-regulação de FOXM1 em linhas celulares de cancro do ovário (OVCA433 e OV2008) após o tratamento com U0126 para vários intervalos de tempo. (D) Ensaio de cura da ferida demonstraram menor taxa de encerramento de feridas de U0126-tratada OVCA433 células, em comparação com o controlo não tratado (*

P

0,05). Três experimentos independentes foram realizados eo resultado foi plotado.

actividade ERK regula a migração celular mediada pela FOXM1 em células de cancro do ovário

Como o estudo acima implícitas a associação plausível de actividade ERK e FOXM1 expressão (Fig. 1A e 1B), é interessante investigar o mecanismo molecular subjacente. OVCA433 células OV2008 e foram tratadas com o inibidor de MEK U0126 e os níveis de pERK e FOXM1 foram avaliadas em diferentes pontos de tempo por análise de Western blot. Uma diminuição notável do nível vantagem foi observada em ambas as linhas celulares tão cedo quanto 30 minutos, e houve uma redução concomitante de expressão FOXM1 (Fig. 4C). Além disso, a inibição da expressão de FOXM1 sustentada, enquanto a actividade de ERK permaneceram suprimidos (Fig. 4C). Desde ERK encontra-se a montante da FOXM1 [23], [24], que argumentou que a inibição da actividade ERK deve revogar a migração de células de células de cancro do ovário através FOXM1-regulação para baixo. Na verdade, utilizando um ensaio de cicatrização de feridas, as células tratadas com OVCA433 U0126 mostrou um aumento significativo do tempo de encerramento de feridas (duas vezes mais), em comparação com o controlo (

P

0,05) (Fig. 4D). Por outro lado, não houve redução de expressão FOXM1 e a motilidade celular em células SKOV3 (p53 deletada) mediante tratamento de U0126 (Fig. S3), indicando que a presença de p53 é necessário para U0126 ou tiostreptona inibição mediada FOXM1. Tomados em conjunto, estes resultados suportam um papel essencial de FOXM1 na mediação do efeito da ERK sobre a migração celular em células de câncer de ovário.

MMP-9 e uPAR são FoxM1 alvos a jusante que regulam a migração de células /invasão

proteases extracelulares como metaloprotease-9 (MMP-9) e do receptor de uroquinase (uPAR) são marcadores para a aquisição da capacidade metastática [2]. Assim, analisámos os níveis de

MMP-9

e

uPAR

para confirmar o efeito de FOXM1 sobre a motilidade celular e invasão. Ao suprimir a expressão FOXM1 com 5 e 10 uM de tioestreptona em OVCA433, os níveis de ambos

MMP-9

e

uPAR foram reduzidas em cerca de 20 a 30% (Fig. 5). Por outro lado, transitória sobre-expressão de FOXM1 aumentou

MMP-9

e

uPAR

níveis de ~1.7 vezes e ~2.4 vezes, respectivamente (Fig. 5). Estes dados sugerem que FOXM1 regula a migração de células /invasão através da transcrição up-regulação das expressões de

MMP-9

e

uPAR

.

Semi-quantitativa RT-PCR mostrou que a inibição da expressão FOXM1 por tiostreptona (5 e 10 mM) em OVCA433 causou uma diminuição de

MMP-9 Comprar e

uPAR

expressões (

esquerdo

), enquanto que transitoriamente transfecção com o plasmídeo FOXM1 expressão (1 e 2 mg) em OVCA433 mostrou um aumento de

MMP-9

e

uPAR

expressão (

direita). O valor numérico em cada painel referiu-se ao nível de expressão de mRNA em relação ao controle.

Discussão

Neste estudo, nós mostramos que FOXM1 foi aberrante-regulada no cancro do ovário , particularmente no sub-tipo de alto grau. Da mesma forma, o aumento da fosfo-ERK em concomitante com FOXM1 foi significativamente associada com o câncer de ovário de alta qualidade. Nós portanto, proposto que a sobre-expressão FOXM1 pode resultar de sinalização de ERK activada constitutivamente que contribui para a capacidade metastática de células de cancro. Nosso estudo indica que a ERK /cascata de sinalização FOXM1 pode ser um alvo promissor para intervenção terapêutica no cancro do ovário.

Nós e outros grupos têm relatado anteriormente que FOXM1 é frequentemente desregulado em uma variedade de cancros humanos [31]. Importantemente, o aumento da expressão FOXM1 foi associada com a progressão tumoral de cancros humanos [6], [9], [10], [11], [12]. No entanto, os papéis funcionais de FOXM1 em câncer de ovário permanece largamente inexplorado. Aqui, mostramos que tanto de ARNm e de proteína dos níveis de FOXM1 foram regulados positivamente em tecidos de cancro do ovário e linhas celulares. FOXM1 sobre-expressão foi significativamente correlacionado com tumores do ovário de alto grau, o que indica que FOXM1 pode desempenhar um papel oncogénica em cancro do ovário, especialmente no subtipo de alto grau. Por conseguinte, explorou o efeito de FOXM1 na migração de células /invasão que é um cenário comum tumorigénica observada em tumores agressivos de alto grau

Ambas as variantes de splicing transcricionalmente activos de FOXM1.;

FOXM1B

e

FOXM1C

são mostrados para ser elevado em numerosos cancros humanos. Particularmente, FOXM1B foi demonstrado para promover a angiogénese, o crescimento do tumor de células de glioma e a metástase de carcinoma hepatocelular na ausência de Arf enquanto FOXM1C foi encontrada para melhorar o crescimento celular e a capacidade independente de ancoragem de células de cancro cervical [6], [7], [15 ], [16]. Aqui, aplicada a expressão de qualquer FOXM1B ou FOXM1C poderia promover a proliferação celular, migração e invasão em células de cancro do ovário. Embora nossos resultados mostraram que FOXM1C aumentou preferencialmente a proliferação celular, enquanto FOXM1B promoveu a migração de células /invasão, a redução simultânea de ambas as isoformas FoxM1 usando tiostreptona levou a efeitos, tanto a proliferação de células, bem como a migração de células /invasão correspondente. O efeito da FOXM1 foi ainda confirmada pelo exame das expressões de marcadores conhecidos na migração de células /invasão,

MMP-9

e

uPAR

, que estão em linha com o papel metastático FOXM1 relatado em outros cancros humanos [9], [16], [32], [33]. Se FOXM1 regulam diretamente esses marcadores ou outros efectores a jusante requer mais investigação. No entanto, todas estas observações sugerem que a sobre-regulação aberrante de FOXM1 atributos das propriedades tumorigénicas no cancro do ovário de alto grau.

ERK é um de um mediador crucial na sinalização eixo Raf /ERK /MAPK manutenção celular diversa funcionamento, incluindo a proliferação celular, apoptose, bem como migração [34]. Anteriormente, ERK foi mostrado para ser constitutivamente activa no cancro do ovário e a identificação de elevado nível de pERK expressão em linhas de células de cancro do ovário e de alto grau histológico indica o seu papel crucial na tumorigénese causando agressivo [35]. Curiosamente, descobrimos que os níveis pERK e FoxM1 estavam fortemente correlacionados durante a progressão do câncer, especialmente no cancro do ovário de alta qualidade. Especulamos que a expressão elevada FOXM1 é disparado pela activação constitutiva de ERK, o que leva a motilidade celular aumentada no cancro do ovário. Como esperado, a sua relação foi confirmada através da manipulação da actividade de ERK, o que resultou em alterações paralelas de expressão FOXM1. Em outro estudo, motivos semelhantes aos da sequência alvo ERK foram encontrados em FOXM1 e activação da actividade de ERK foi demonstrada para induzir a capacidade de transactivação de FOXM1C [22]. Assim, a supressão da actividade de ERK pela U0126 reduziria FOXM1 fosforilação que, finalmente, conduz à inibição da expressão FOXM1, interrompendo o seu próprio circuito de retroalimentação positiva [36]. Embora nos deu um indício de que a transactivação de FOXM1 depende de fosforilação por ERK ao nível pós-transcricional, há falta de relatórios sobre os atributos funcionais do eixo activada ERK /FOXM1 sinalização em câncer de ovário. No estudo a cicatrização de feridas, na verdade, a diminuição da taxa de encerramento de feridas devido a actividade de ERK inibida e a redução da expressão FOXM1 mediante tratamento U0126 sugere fortemente que FOXM é um dos principais efectores a jusante de sinalização de ERK. Além disso, tiostreptona e U0126 suprimida a migração celular a um nível semelhante (40% em comparação com 50%). Tomados em conjunto, acreditamos que up-regulada a actividade ERK e subsequente aumento da expressão FOXM1 contribuir ainda mais a indução de comportamentos oncogênicos, que apoiar o ERK /eixo sinalização FOXM1 facilita a migração celular no cancro do ovário.

Estudos anteriores demonstraram a efeito promissor de tiostreptona em prejudicar os comportamentos tumorigênicos mediadas por FOXM1 [26], [37], [38]. Dada a sensibilidade diferencial da FOXM1 a infra-regulação por tratamento tiostreptona em linhas de células com diferentes estados de p53, é tentador especular a importância de p53 para a ação de tiostreptona. Baseado no fato de que a perda da função p53 é um evento comum em tumores e FOXM1 é regulada negativamente pela p53, nós especulamos que a perda de expressão da p53 pode causar a desregulamentação dos FOXM1 e, assim, causar uma catástrofe celular e até mesmo câncer. Aqui, o p53 deletada linha celular SKOV3 mostraram nenhuma resposta de FOXM1 para várias doses de tiostreptona, bem como inibidor de MEK, U0126, enquanto FOXM1 pode ser facilmente suprimido em doses múltiplas em A2780cp OVCA433 e que transportam tipo selvagem e mutados genes p53, respectivamente. Estudos anteriores mostraram que pode eliciar tiostreptona efeito apoptótico em células cancerosas através da estabilização de expressão de p53 [39], e a sobre-regulação de p53 em dosagens mais altas pode ajudar ainda mais a supressão de FOXM1. Curiosamente, tiostreptona ou U0126 não teve qualquer influência na realização gene p53 excluído SKOV3, enquanto que a expressão ectópica de p53 aboliu a expressão de FOXM1, tanto a nível RNA e proteínas, consistentes com outros estudos [28], [30]. Isto revela a função de p53 necessária na mediação do efeito supressor de tiostreptona sobre a expressão FOXM1. Além de prejudicar a capacidade de migração de células /invasão, outro grupo também mostrou que a utilização de tiostreptona também pode aumentar a apoptose e paragem proliferativo em células de cancro humano que sublinha ainda mais o valor terapêutico de tiostreptona [26], [37], [38], [39], [40]. Colectivamente, o nosso estudo apoia que as funções tiostreptona suprimindo a expressão FOXM1 via p53 para aliviar posteriormente, a tumorigenicidade e up-regulação p53 para induzir a morte celular.

Em conclusão, nosso estudo revelou uma ligação entre ERK /eixo sinalização FOXM1 e o comportamento metastático de células de cancro do ovário. Além disso, nós descobrimos um papel crítico na mediação de p53 a acção de tiostreptona. Por isso, tanto U0126 e tiostreptona representam pontos de partida promissor para estabelecer a terapia anti-câncer no câncer de ovário através da repressão da FOXM1.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

foram utilizados cinco células epiteliais da superfície do ovário humanas imortalizadas: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 e HOSE21-3 (do Professor George Tsao, The University of Hong Kong). Foram utilizados nove linhas de células de cancro do ovário: A2780s A2780cp, OV2008, C13 (dos Professor Benjamin Tsang, da Universidade de Ottawa), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 e SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Todas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 em qualquer meio essencial mínimo ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) com 10% de soro fetal bovino (Gibco) e 1% de Penicilina-Estreptomicina ( Gibco).

Plasmids e transfecção

Os plasmídeos pCDH-FOXM1B e pCDH-FOXM1C lentivirais foram geradas por subclonagem FOXM1B e FOXM1C cDNAs a partir de plasmídeos pcDNA3-FOXM1C pcDNA3-FOXM1B e em pCDH-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro plasmídeo lentiviral (SBI, mountain View, CA), respectivamente. O plasmídeo pRcCMV-p53 era de Prof. Randy YC Poon (Secção de Bioquímica e Biologia Celular da Universidade de Hong Kong de Ciência e Tecnologia, Hong Kong). LipofectAMINE 2000 ™ reagente de transfecção (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) foi utilizado para a transfecção de células de acordo com as instruções dos fabricantes. Os pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP-puro e pcDNA3.0 vectores vazios foram utilizados como controlos negativos. Para estabelecer FOXM1B e FOXM1C que expressam estavelmente as células, as células infectadas foram seleccionadas por lentivirais 2 ug /ml de puromicina (Sigma), durante 2 semanas e verificado por análise Western Blot.

semi-quantitativa (SQ-PCR) quantitativa e ( QPCR) da transcriptase reversa-reacção em cadeia da polimerase

o ARN total foi isolado por meio de Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. DNA complementar foi sintetizada utilizando kit de reagentes de transcrição reversa (Applied Biosystems, Foster City). Subsequentemente, o ADNc foi utilizado para realizar PCR utilizando iniciadores específicos de genes

FOXM1B

(para a frente, 5′-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 ‘e inverso, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3’),

FOXM1C

( para a frente, 5′-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 ‘e inverso, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3’),

MMP9

(para a frente, 5′-CATCGTCATCCAGTTTGGTG e reverso, 5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3 ‘) e

uPAR

(para a frente, 5′-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 ‘e inverso, 5′-GGCAGATTTTCAAGCTCCAG -3’), sob a condição de 94 ° C (5 min), seguido de 30-35 ciclos de 95 ° C (30 s), 57 ° C (30 s) e 72 ° C (30 segundos), em seguida, finalmente, a 72 ° C (10 min) e 4 ° C. A quantidade relativa do gene foi normalizado contra o ARNm de GAPDH.

Q-PCR foi realizada por meio de ensaios de expressão de gene e TaqMan® Gene Expression Assay SYBR Green. Para validar a expressão de

FoxM1

isoformas, primers específicos direccionados contra

FOXM1B

e

FOXM1C

foram projetados de acordo com Kalin

et al

[11] e adquiridos a Applied Biosystems. Para examinar a expressão de p53, sondas TaqMan específicas (Applied Biosystems) incluídas na mistura de PCR foram sujeitos a PCR sob a condição de 95 ° C durante 2 minutos, 40 ° ciclos C a 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. quantidade relativa de ARN em cada amostra foi determinado pelo método comparativo CT com o software de 7500 Sistema de SDS (versão 1.3.1), a partir do qual a diferença de dobragem foi comparado com o controlo interno

18S

e

TBP

e a diferença relativa dobra foi então normalizados para o calibrador. O nível relativo de expressão de genes alvo foi interpretado como a diferença de dobragem com o controlo endógeno.

transferência de Western e imuno-histoquímica (IHC) analisa

A proteína total foi preparado por adição de uma quantidade adequada de tampão de lise 1x ao sedimento celular.