Abstract

A quimioterapia e terapias anti-hormonais são os tratamentos mais comuns para o câncer de próstata não-confinado ao órgão (PCA) . No entanto, a eficácia destes tratamentos é limitada, necessitando, assim, o desenvolvimento de abordagens alternativas. O presente estudo incidiu sobre a análise do papel da pterostilbene (PTER) -isothiocyanate (ITC) conjugado – uma nova classe de compostos híbridos sintetizados anexando uma porção ITC no backbone PTER – na regulação das funções do receptor de andrógeno (AR), causando assim a apoptose de células APC. A molécula de conjugado causou inibição do crescimento de 50% (IC

50) a 40 ± 1,12 e 1,50 ± 45 uM em células AR positivo (LNCaP) e negativo (PC-3), respectivamente. A proliferação reduzida de células LNCaP PC-3, bem como por um conjugado correlacionada com a acumulação de células na fase G2 /M e a indução de apoptose caspase dependentes. Ambos PI3K /Akt e MAPK vias /ERK desempenhou um papel importante e diferencial na apoptose induzida pelo conjugado destas células APC. apoptose, pelo contrário, a apoptose foi acelerada pela inibição de ERK (por PD98059 ou ERK siARN) em caso Enquanto o inibidor da Akt (A6730) ou ARN de pequena interferência específica-Akt (siARN) sensibilizados grandemente células PC-3 para induzida conjugar- de células LNCaP, tanto em última análise, culminando na expressão da proteína clivada da caspase-3. Além disso, a actividade anti-androgênica do conjugado foi mediada por diminuição da expressão de AR e seus co-activadores (SRC-1, GRIP-1), interferindo assim nas suas interacções com RA. Todos estes dados sugerem que a inibição induzida pelo conjugado de proliferação das células e indução de apoptose são, em parte, mediada pela regulação para baixo de AR, Akt, ERK e sinalização. Estas observações fornecem uma base racional para a concepção de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de CaP usando conjugado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos

citação:. Nikhil K, S Sharan, Chakraborty A, Roy P (2014) Pterostilbene-isotiocianato Conjugado suprime o crescimento de células cancerosas da próstata Independentemente do receptor andrógeno status. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10.1371 /journal.pone.0093335

editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan

Recebido: 30 de setembro de 2013; Aceito: 03 de março de 2014; Publicação: 03 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nikhil et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho de investigação Científica e industrial e do Ministério de Recursos Humanos e Desenvolvimento (MHRD), Governo da Índia como bolsas de investigação para kN e estágio do projeto para PR, respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Além disso PR também gostaria de tanque de outras agências de financiamento, Departamento de Biotecnologia (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) e do Departamento de Ciência e Tecnologia (SR /SO /HS-39/2009) pelo seu apoio financeiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar dos esforços significativos feitos para a ablação de cânceres, o câncer de próstata (PCA) é o cancro mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de morte por câncer entre os homens nos Estados Unidos, com uma estimativa de 217,730 novos casos e 32.050 mortes em 2010 [1]. Embora a etiologia de CaP permanece níveis desconhecidos, elevados de hormonas esteróides, tais como androgénios e estrogénios, bem como factores de crescimento, tais como factor de crescimento 1 semelhante à insulina, são considerados como factores de risco importantes [2] – [4]. terapia de ablação de androgénios tem uma resposta inicial, mas a maioria dos pacientes com CaP avançado, eventualmente, desenvolver a resistência a esta terapia e progride para o cancro da próstata refractário a hormonas (HRPC), para o qual não há nenhuma terapia curativa [5]. A falta de opções de tratamento eficazes para a gestão das HRPC reforçar a necessidade de desenvolver novos compostos que actuam isoladamente ou em combinação.

AR funções de androgénio e desempenham um papel crucial na carcinogénese e na progressão da APC, bem como em situações normais desenvolvimento da próstata [6], [7]. As acções dos andrógenos, tais como testosterona e di-hidrotestosterona (DHT) são mediadas pelo AR, o qual é um membro do receptor de super-família de factores de transcrição nuclear dependente de ligandos [8]. Além de androgénio, a actividade de AR podem também ser modificados por moléculas em outras vias de sinalização celular. A regulação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e os aumentos subsequentes em quinase regulada extracelular (ERK) e sinalização de Akt, estão implicadas na progressão CaP [9]. Akt regula a via de sinalização AR por fosforilação e /ou regulação da transcrição da AR. Akt fosforila AR a serinas 210/213 e 790/791 e, finalmente, transactiva a sua actividade. Um estudo anterior demonstrou que a inibição de Akt ab-roga a actividade HER-2 /neu de sinalização induzida por ar [10]. Estes resultados sugerem que a AKT é um activador da AR necessária para a sobrevivência e crescimento de células CaP independente de androgénios. A pesquisa mostrou que a inibição de uma ou ambas estas vias tem um efeito mais profundo sobre o desenvolvimento de células de tumor e morte, tornando-os alvos atractivos combinações de terapia de CaP. Portanto, AR, Akt, ERK e poderiam ser potenciais alvos para o tratamento de CaP.

componentes bioactivos alimentares, em particular, estão cada vez mais a ser avaliados como potenciais agentes quimiopreventivos CaP devido à sua segurança presume [11]. Um tal composto é pterostilbene (PTER), um análogo que ocorre naturalmente éter dimetílico de resveratrol (RESV), que tem uma maior biodisponibilidade oral e maior potência, em comparação com RESV [12]. Vários estudos têm mostrado que PTER pode inibir o crescimento de vários cancros hormona-responsivas, tais como cancro da mama [13] – [15] e PCA [14], [16] – [18], tanto

In vitro e

in vivo

. Embora as propriedades anti-metastática, anti-tumorais e anti-leucémicas de PTER têm sido bem estabelecida no cancro da mama, há relatórios limitados sobre a acção de PTER na proliferação de células CaP induzidas por hormonas esteróides [16]. Da mesma forma, isotiocianatos (ITC) são de ocorrência natural, compostos orgânicos de baixo peso molecular com a fórmula geral R-NCS [19]. Estes agentes quimioprotectores são encontrados em uma ampla variedade de vegetais crucíferos, como brócolis, couve-flor, repolho, couve de Bruxelas, couve e [20]. Estudos epidemiológicos sugerem que o aumento do consumo de vegetais crucíferos pode ser protetora contra CaP risco [21] – [24]. No entanto, apesar da correlação epidemiológica convincente, a atividade das ITC contra células PCA é ainda a ser sistematicamente avaliado. Uma vez que os papéis individuais de PTER e ITC já têm sido implicados na APC, pretendeu-se desenvolver um conjugado de PTER-ITC em busca de moléculas anti-câncer potentes. O conjugado foi preparado adicionando ITC contendo tio-semicarbazida farmacóforo com espinha dorsal PTER como descrito anteriormente [25]. Surpreendentemente, a molécula de conjugado, quando testado in vitro, mostrou citotoxicidade eficaz na vasta gama de linhas celulares de cancro comparativamente a uma dose mais baixa, em comparação com o seu composto de origem ou seja, PTER [25]. Além disso, o nosso estudo indicou que a actividade anti-proliferativa de conjugado contra linhas celulares de cancro da mama humano foi devido à sua capacidade de reter as células na fase G2 /M e a activação de caspase, e também se correlacionou com o bloqueio de Akt e ERK vias de sinalização [ ,,,0],25].

no presente estudo nós examinamos eficácia detalhada e mecanismos moleculares de ação dos PTER-ITC conjugado usando (LNCaP) andrógeno-dependentes e células (PC-3) PCA-andrógeno independente. Além disso, também compararam a eficácia de PTER-ITC conjugado com o composto progenitor de PTER isto é, RESV. O nosso estudo identificou assim o conjugado recentemente desenvolvido para ser um inibidor potente-AR que atenua fortemente o crescimento de células in vitro CaP por modulação da expressão de AR, bem como regular a progressão do ciclo celular e apoptose.

Materiais e Métodos

reagentes

Todos os reagentes de cultura celular foram obtidos de GIBCO (Invitrogen, CA, EUA), a menos que indicado de outra forma. A penicilina, estreptomicina, MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) 2,5diphenyl-2H-tetrazoliumbromide), grau de cultura de células de dimetil sulfóxido (DMSO), agarose e todos os reagentes de grau analítico eram da HiMedia (Bombaim, índia ). transcription- de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) kits reversa eram de Genei (Bangalore, Índia). RESV, PTER, DHT, Akt1 /2 de inibidor de cinase, PD98059 (inibidor de ERK), Z-VAD-FMK (inibidor da caspase PAN), Z-LEHD-FMK (caspase-9 inibidor específico), Z-IETD-FMK (caspase 8 inibidor específico) e kits de estimativa de proteína BCA foram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Polyfect reagente de transfecção foi adquirido de Qiagen (Valencia, CA, EUA). Pifithrin-α (inibidor de p53), anticorpos para a caspase-3, Bax, Akt, P-Akt, ERK, p-ERK, SRC-1, GRIP-1, N-CoR, β-actina e pequenos ARN interferentes (siRNAs) contra Akt (SC-43609), ERK (SC-35335) e de controlo (SC-37007; controlo negativo em experiências usando alvo transfecção siRNA; cada um constituído por uma sequência mexidos que não irá conduzir à degradação específica de qualquer ARNm celular conhecido) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). PTER-ITC conjugado foi sintetizada no laboratório de síntese assimétrica do Departamento de Química, Indian Institute of Technology Roorkee, índia, de acordo com o procedimento descrito anteriormente [25], e daqui em diante designada como o conjugado do manuscrito (Fig. 1A).

(A) Estrutura do Resveratrol, Pterostilbene eo conjugado Pterostilbene-isotiocianato. (B) O efeito do conjugado na apoptose de células PC-3 e LNCaP, como demonstrado por uma análise de FACS representativa, utilizando Anexina V como marcador. (C) O histograma que mostra os dados para a análise de FACS, onde os resultados são a média ± SEM de três experiências independentes. # E * representa diferença estatisticamente significativa em relação aos seus controles específicos (tratados com veículo) para células em apoptose precoce e tardia, respectivamente,

p

. 0,05

linhas celulares e Cultura

as linhas de células de carcinoma da próstata (AR-positivas LNCaP e PC-3 AR-negativas) linhas celulares e noncancer (CHO e COS-1) foram obtidos a partir do Centro Nacional de Cell Science (NCCS), Pune, Índia. PC-3, as células CHO e COS-1 foram mantidas em modificados meio de Eagle da Dulbecco (DMEM), enquanto as células LNCaP foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (inactivado pelo calor), sob 5% de CO

2 a 37 ° C. Todas as experiências foram realizadas usando células LNCaP, PC-3, CHO e células COS-1 a partir de passagem inferior 29, 34, 20 e 30, respectivamente. As células foram lavadas adequadamente antes de mudar os meios de comunicação para meio completo sem esteróides antes de cada tratamento com os compostos, a menos que indicado de outra forma.

Citotoxicidade

ensaio de MTT foi realizado como descrito anteriormente [ ,,,0],25]. Em resumo, 5 x 103 células em 200 ul de meio foram semeadas em placas de 96 poços (Griener, Alemanha

).

Após 24 h, as células foram tratadas com várias concentrações (0,1, 1, 10, 100 e 1,000 uM) de RESV, PTER e conjugado. As células de controlo foram tratadas com DMSO (controlo de veículo) de 0,1%. As células em cultura foram ensaiadas depois de 24 h por adição de 20 uL de 5 mg /mL de MTT, seguido por incubação a 37 ° C durante 4 h. Os meios de comunicação de MTT contendo foi então aspirado e 200 ul de DMSO (Himedia, Mumbai, índia) foi adicionado para dissolver os cristais formazone. A densidade óptica (OD) foi medida a 570 nm usando o leitor de placas de ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech, Alemanha). A percentagem de inibição foi calculada como:

A curva de resposta à dose e IC

50 valores foram obtidos por análise de regressão não-linear [regressão não-linear (resposta à dose sigmoidal com declive variável)] utilizando Graph Pad Prism, versão 5,02 software (Graph Pad software Inc, CA, EUA).

distribuição do ciclo celular e Ensaio de apoptose por

a distribuição do ciclo celular e iodeto de anexina V /propídio (PI) as células positivas de citometria de fluxo foram

analisadas utilizando citometria de fluxo. Resumidamente, primeiro as células foram semeadas e tratadas com 0, 10, 20 e 40 de conjugado uM em meio completo durante 24 h. Isto foi seguido por trypsinizing e fixação em 70% de etanol, e, finalmente, lavando com PBS. Subsequentemente, as células foram tratadas com RNase A (50 ug /ml), corados com PI (50 ug /ml) e incubou-se no escuro durante 30 min à temperatura ambiente e analisadas por citometria de fluxo para a distribuição do ciclo celular. Para a apoptose, as células foram coradas conjugadas tratada com Alexa-Fluor Anexina-V-488 conjugado com a Vybrant-Apoptosis Assay Kit da Invitrogen (EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células marcadas foram então analisadas por células activadas por fluorescência (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e os dados foram padronizados usando celular Busca 3.3 software.

Caspase Assay

actividade de caspase foi determinada utilizando ApoTarget caspase kit de ensaio colorimétrico de protease amostrador (KHZ1001; Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, tanto as células CaP foram tratados com doses crescentes de conjugado e RESV durante 24 h. As células foram então recolhidas, lavadas em PBS, e lisadas em tampão de lise de 50 ul em gelo durante 10 min. Após centrifugação, o sobrenadante contendo 150 ug de proteínas foram incubadas com 200 | iM de caspase-3 (Ac-DEVD-pNA), a caspase-8 (Ac-IETD-pNA) e caspase-9 (Ac-LEHD-pNA) substratos, respectivamente, em de tampão de reacção a 37 ° C durante 1 h em 96 placa de fundo plano. Níveis de pNA libertada foi então medida a 405 nm de comprimento de onda com o leitor de placas de ELISA (Fluostar Optima, BMG Labtech, Alemanha). O vezes de aumento em caspase-3, -8, -9 e actividades foram determinadas por comparação directa com o nível de controlo induzido por un. Para o ensaio de inibidor de caspase, as células foram pré-tratadas com um inibidor da pan-caspase sintético (Z-VAD-FMK), caspase-8 inibidor (Z-IETD-FMK) e caspase-9 inibidor (Z-LEHD-FMK) durante 1 h antes da adição do conjugado e a morte das células foram analisadas por ensaio MTT, como discutido anteriormente.

Análise de RT-PCR

o ARN total foi extraído das células tratadas utilizando o kit de isolamento de ARN obtido a partir de Genei ( Bangalore, Índia). As amostras de RNA foram extraídos e quantificados, em seguida, uma quantidade igual dos tratamentos individuais foi transcrito com a ajuda de um RT – PCR kit de Genei (Bangalore, Índia) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR foi realizada por desnaturação a 94 ° C durante 60 s, hibridação a várias temperaturas (de acordo com os pares de iniciadores utilizados para 45 s) e extensão a 72 ° C durante 2 min, seguido pelo número de ciclos para amplificação. Os iniciadores para a Bcl-2, Bcl-xL, Bax, AR e β-actina foram concebidos com a ajuda do software Primer 3 e normalizado em laboratório. Os produtos de PCR foram então separadas em 2% de gel de agarose e visualizados num sistema de documentação de gel (Bio Rad, EUA). A intensidade das bandas no gel de agarose foram analisados ​​utilizando o software ImageJ 1.43 (NIH, EUA) e normalizada em relação a p-actina produtos de PCR. Cada um de RT-PCR foi realizada três vezes. Tabela S1 apresenta a sequência do iniciador, o tamanho do produto, a temperatura de recozimento, e o número de ciclos usados ​​para todos os iniciadores.

A coloração de imunofluorescência

Para a coloração de imunof luorescência, as células LNCaP foram lavadas com PBS, fixadas em três % de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 e finalmente bloqueado com 1% de BSA durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram então incubadas com anticorpo policlonal de coelho diluído AR 1:200 em tampão de bloqueio durante 1 h à TA. Finalmente, as células foram lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo secundário marcado com FITC anti-coelho diluída 1:1000 em tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. foram então observadas as células sob um microscópio de fluorescência (Zeiss, Axiovert 25, Alemanha).

Co-imunoprecipitação e análise por Western blot

As células LNCaP foram plaqueadas em placas de cultura de 100 mm e tratadas com conjugado ou DHT durante 24 h. Os lisados ​​celulares totais foram preparados como descrito anteriormente [26], em imunoprecipitação (IP) de tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, e 1% de Triton X-100. alíquotas de 500 ug de proteína foram então incubadas durante a noite a 4 ° C usando 2 ^ g de anticorpo dirigido contra a AR. As esferas de agarose-proteína CL A foram depois adicionados e ainda incubadas durante 6 h a 4 ° C. Os imunoprecipitados foram lavados quatro vezes com o tampão de IP e os imunocomplexos foram recuperados por ebulição em tampão de amostra de SDS. Finalmente, o Western blot foi efectuada utilizando anticorpos anti-AR, anti-SRC-1 e anti-GRIP 1-anticorpos (Santa Cruz, CA, EUA). Para a análise de Western Blot, os lisados ​​celulares foram preparados após apanha-los em tampão de lise. Cerca de 40 ug de proteína total foram submetidos a electroforese em 12% SDS-PAGE e a transferência de Western foi levada a cabo usando o protocolo padrão. Em resumo, as proteínas analisadas foram transferidos para membranas de nylon. As manchas foram então bloqueados com tampão de TBST (20 mM Tris-Cl, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 0,05% de Tween-20) contendo 5% de leite desnatado em pó. Eles foram, em seguida, lavou-se com tampão de TBST e incubadas durante a noite a 4 ° C com o mesmo tampão contendo quantidades apropriadas de anticorpos primários: caspase-3, Bax, Bcl-2, Akt, P-Akt, ERK, p-ERK, AR, SRC -1, GRIP-1 (1:500) e β-actina (1:1000). As manchas foram então lavadas e incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho (1:20,000) conjugado com peroxidase de rábano (HRP). O desenvolvimento da cor foi realizada no escuro, utilizando um kit ECL (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Os borrões desenvolvidos foram submetidos a análise densitométrica por ImageJ 1,43 software (NIH, EUA), utilizando β-actina como controlo interno.

A transfecção

As células LNCaP foram cultivadas e transfectadas transitoriamente com pMMTV-neomicina plasmídeo -luciferase (300 ng /105 células) em meio RPMI suplementado com FBS a 10% utilizando o reagente de transfecção Polyfect (Qiagen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 24 h após a transfecção, os meios de cultura celular foram alteradas com meio contendo 5% de FBS despojado com carvão para reduzir os esteróides contaminantes a partir do soro e incubou-se durante mais um dia antes de se iniciar os tratamentos. No caso de células PC-3, que foram transfectadas de forma semelhante, mas em adição a construção pMMTV-neomicina-luciferase, que também foram transfectadas com o plasmídeo pSG5-Har-Puro (comprimento completo CHar na pSG5 vector de expressão) na proporção de 5: 1, tal como indicado acima. Para experiências envolvendo co-reguladores, 50 ng dos plasmídeos co-activador (25 ng cada uma GRIP-1 e SRC-1), juntamente com pMMTV-neo-luc (250 ng) foram transfectadas para células LNCaP. Para avaliar a eficiência da transfecção, a 500 ng /105 células do promotor de SV40-luciferase de Renilla (pRL-SV40) vector (Promega Madison, EUA) foram co-transfectadas como controlo interno. As células foram, em seguida, tratados quer com veículo ou concentrações diferentes (1-40 uM) de conjugado e /ou 10 nM de DHT durante 24 h, e a actividade de luciferase foi medida de acordo com as instruções fornecidas com o kit (Promega, Madison, EUA ). Cada ponto experimental foi realizada em triplicado e variaram em menos de 10%. Os valores da luciferase para cada lisados ​​foram normalizados para a actividade da luciferase de Renilla.

Para estudos de localização, o plasmídeo pEGFP-AR foi transfectado para células LNCaP e PC-3 de células (300 ng /105 células). As células foram então incubadas com 10 nM de DHT com /sem conjugado de 10 e 20 uM e monitorizados regularmente até 12 h, sob microscópio de fluorescência (Zeiss, Axiovert 25, Alemanha).

Transfection siRNA

A ARNsi contra Akt humana e siRNA ERK e de controlo foram adquiridos comercialmente a partir de Santa Cruz Biotechnology (EUA). As células LNCaP e PC-3 foram transfectadas com CaP siRNAs (a uma concentração final de 100 nM), utilizando o reagente de transfecção Polyfect (Qiagen, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 h de transfeco, as culas foram lavadas apropriadamente e substituído com meio fresco. As células foram então tratadas com 20 pM conjugada durante 24 h, e, finalmente, os lisados ​​de proteína foram preparadas após a conclusão do tratamento. Os níveis de P-Akt, ERK e p-caspase-3 clivada expressões foram detectadas por análise Western Blot.

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± EPM e avaliados estatisticamente utilizando um- way ANOVA seguido de Bonferroni

post hoc

teste usando Graph Pad Prism 5,04 software (Graph Pad software, San Diego, CA, EUA). A

p

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

inibição da proliferação celular por Conjugado

LNCaP (AR positiva ) e PC-3 (AR células negativas) foram cultivadas com diferentes concentrações de RESV, PTER e conjugado durante 24 h em meio RPMI e DMEM completo, respectivamente. Os nossos dados mostraram que o tratamento de células de LNCaP e PC-3 CaP com RESV, PTER e conjugado resultou numa inibição dependente da dose da proliferação de células. Como mostrado na Tabela 1, no caso de células LNCaP, o conjugado resultou numa redução de quase 50% no número de células vivas em 40 ± 1,12 pM, enquanto que era de cerca de 66,4 ± 1,39 e 82,2 ± 2,19 uM em caso de PTER e RESV tratados células, respectivamente, após 24 h de tratamento. Da mesma forma, no caso de células PC-3 do IC

50 valor de conjugado, PTER e RESV verificou-se ser de 45 ± 1,50, 2,55 ± 75 e 95,0 ± 1,13 uM, respectivamente, após 24 h de tratamento (Tabela 1). Além disso, quando testada em linhas de células noncancer como CHO e COS-1, todos os compostos foram encontrados a ter IC

50 valores superiores a 100 uM de concentração. Assim, tanto as linhas celulares de cancro foram encontrados para ser mais sensíveis ao tratamento com o conjugado, em comparação com PTER e RESV como representado pela menor IC

50 valores em todos eles. Além disso, o nosso resultado mostrou que PTER-ITC conjugado é um agente citotóxico potente, tanto AR positivo e AR linhas celulares negativas embora para um nível ligeiramente maior no primeiro, em comparação com este último.

sensibilidade diferencial de PC-3 e LNCaP células para conjugado induzida apoptose

No meio dos resultados do ensaio MTT, estendemos nosso estudo para examinar se as células CaP sofrem apoptose após o tratamento conjugado usando anexina-V PI ensaio de coloração /casal e fluxo análise de citometria. Depois de CaP células foram incubadas com diferentes concentrações do conjugado, as células foram coradas com Alexa Fluor 488 conjugado com Anexina-V e PI, que pode avaliar as populações de células apoptóticas precoces e tardias. Como mostrado na Fig. 1B, o conjugado produziu um aumento dependente da dose na população celular por apoptose em ambas as células CaP estudados. O tratamento de células PC-3 com doses crescentes de conjugado durante 24 h resultou em um aumento de células apoptóticas precoces de cerca de 44% a 68% e células apoptóticas tardias de 12% para 16% aos 20 e 40 uM de concentrações, em comparação com veículo grupos tratados respectivamente (Fig. 1B painel superior). Dado que as células PC-3 falta uma proteína p53 funcional, era de interesse determinar se a presença de p53 do tipo selvagem afecta a sensibilidade celular para a morte celular causada por conjugado porque p53 é conhecida para regular a apoptose em diferentes estímulos. Nós abordou esta questão através da determinação da sensibilidade de células LNCaP (p53 do tipo selvagem) no sentido de apoptose induzida por conjugado por análise de FACS. O tratamento de células LNCaP durante 24 horas com doses crescentes de conjugado resultaram em um aumento gradual de células apoptóticas precoces (anexina V positiva única) de 52% a 72%, a 20 e 40 uM, respectivamente (Fig. 1B, painel inferior). As células apoptóticas tardias (anexina V e PI positivos) também aumentou significativamente a partir de 8% a 18,5% (Fig. 1B, painel inferior), em comparação com apenas 0,23% de células apoptóticas precoces e número quase insignificante de células apoptóticas tardias no controlo negativo grupo tratado com 0,1% de DMSO. O histograma no painel à direita (Fig. 1C) indica a análise estatística de três experiências independentes similares para ambas as linhas celulares. Curiosamente, o número total de células apoptóticas foi estatisticamente não significativa (

P

0,05) entre as células LNCaP e PC-3 quando testado com diferentes concentrações do conjugado, o que sugere que a proteína p53 não estava envolvido na regulação de apoptose induzida por conjugado de células APC.

conjugado Induced Stage detenção específico de células do cancro da próstata

com base no crescimento e síntese de DNA respostas inibitórias de conjugado em células APC, nós próxima examinados seu efeito na progressão do ciclo celular. Como mostrado na Fig. 2A e 2B, o tratamento de células LNCaP com doses crescentes de conjugado durante 24 h PC-3 e resultou num aumento dependente da dose na acumulação de células na fase G2 /M e um concomitante decréscimo em células em fase G1. No caso de células PC-3, o efeito observado a 40 | iM conjugado era a maior, com aproximadamente 50% das células a ser preso na fase G2 /M, em comparação com apenas 22% no grupo de controlo (Fig. 2A). Uma tendência semelhante em paragem fase G2 /M foi também demonstrada em células LNCaP (35% em células tratadas em comparação com 11% em células de controlo), embora a população total de células não pode atingir um elevado nível de 50% tal como observado no PC-3 células. Como mostrado na Fig. 2B, o tratamento conjugado resultou numa acumulação de 16-35% das células em fase G2 /M com doses crescentes de conjugado. Assim, a inibição do crescimento mediada por conjugado de ambas as células PC-3 e LNCaP correlacionada com G2 /M do ciclo celular fase parada.

a distribuição do ciclo celular de células (B) PC-3 LNCaP e (a) mediante tratamento com várias doses de conjugado. Os resultados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes. * Representa diferença estatisticamente significativa no que diz respeito às células PC-3 e LNCaP tratados com veículo, respectivamente, correspondentes a cada fase do ciclo celular em

P

0,05. (C) Os efeitos de diferentes doses de conjugado (painel da esquerda) e resveratrol (painel da direita) sobre a caspase-8, -9 e -3 actividades em células LNCaP (D) PC-3 e. Os resultados são a média ± SEM de três experiências independentes. * Representa a diferença estatisticamente significativa no que diz respeito a células de controlo para os respectivos caspases testados a

P

0,05. (E) O efeito de inibidores de caspases na morte celular induzida pelo conjugado em células LNCaP (F) PC-3 e. As células foram pré-tratadas com 20? M de respectivos inibidores de caspases: Z-LEHDFMK (inibidor da caspase-9); Z-IETDFMK (inibidor da caspase-8); e Z-VAD-FMK (inibidor geral de caspases) durante 1 h antes da adição de 20 | iM conjugado. A morte celular foi medida 24 h após o tratamento conjugado utilizando um ensaio MTT. Os dados são a média ± SEM de três experiências independentes. * E # representa diferença estatisticamente significativa em relação ao controle (veículo) e as células conjugadas tratados, respectivamente, para cada linhas celulares em

p Art 0,05. ns, não significativa.

Conjugado ativa a caspase-3 através de Caspase-9

A ativação de ambas as vias caspase extrínsecos e intrínsecos já foi conhecido por ser os principais mecanismos de celular por apoptose morte na maioria dos sistemas celulares. Para entender melhor os percursos celulares subjacentes para a morte induzida pelo conjugado de células APC, um possível papel da caspase neste processo foi investigada através da medição das actividades de caspase-8, -9 e -3 nestas células de tumor. Enquanto a caspase-8 e caspase-9 são proteases essenciais de vias apoptóticas extrínsecos e intrínsecos respectivamente, caspase-3 actua como efectores a jusante de ambas as vias. O tratamento de células PC-3, que receberam doses crescentes (10, 20 e 40 uM) de conjugado e RESV durante 24 horas provocou um aumento dependente da dose na caspase-3 actividades de enzima de caspase-9 e. Este incremento foi comparativamente maior no caso de células tratadas de conjugado em comparação com as células tratadas com mesma dose de RESV (Fig. 2C). Para a caspase-8, embora tenha havido aumento marginal na sua actividade no tratamento de alta dose de RESV, tal indução foi observada no caso de tratamento conjugado (Fig. 2C). Pelo contrário, os resultados obtidos no caso de células LNCaP mostraram um aumento significativo em todos os três ou seja caspase caspase-8, -9 e -3 em tratamento conjugado indicativa do envolvimento de ambos intrínseca (por meio de caspase-9) e extrínseca (através caspase-8) em vias de processo apoptótico pelo conjugado nesta linha de células (Fig. 2D, painel esquerdo). Além disso, os nossos resultados indicaram que a activação de caspase-9 para que ocorre antes da caspase-8 (a dose mais baixa), o que sugere que a via mitocondrial pode ser essencial para a apoptose induzida pelo conjugado. Por outro lado, o tratamento RESV também apresentaram aumento significativo na caspase -9 e -3 actividades, mas em menor grau, em comparação com o conjugado (Figura 2D, painel da direita). (

P

0,05). Assim, os dados acima sugerem claramente que conjugado induziu apoptose em células PC-3 é mediado através da via intrínseca, enquanto ambas as vias intrínsecas e extrínsecas contribui para a apoptose em células LNCaP. Além disso, o conjugado foi encontrada para ser mais eficaz do que RESV na indução de apoptose em ambas as linhas celulares testadas CaP.

Para além disso, para elucidar a via que foi predominante para a apoptose induzida por conjugado, inibidores farmacológicos de caspases específicas foram empregues para sondar se poderiam proteger as células da apoptose. Como mostrado na Fig. 2E e 2F, Z-VAD-FMK, um inibidor geral de caspases, mostrou uma inibição significativa da morte de células em ambos os PC-3 e LNCaP de células, sugerindo que a apoptose é a forma predominante de morte celular induzida pelo conjugado. No caso de células PC-3, Z-LEHD-FMK, um inibidor específico da caspase-9 conjugado induziu morte celular também inibido por 73%, enquanto Z-IETD-FMK, um inibidor específico da caspase-8, foi completamente ineficaz em bloquear conjugado de morte celular induzida por (

P

0,05) (Fig. 2E). Além disso, no caso de células LNCaP, o inibidor de caspase-9 bloqueou quase completamente a apoptose induzida conjugado enquanto inibidor da caspase-8, apenas parcialmente inibido (Fig. 2F). A morte celular induzida conjugado foi inibida mais proeminentemente quando as células foram pré-tratadas com ambos os inibidores da caspase-8 e caspase-9. Juntos, estes dados fortalece ainda mais a nossa conclusão de que conjugado apoptose induzida envolve caspase -9 /-8 /-3 e /-3 vias em LNCaP e células PC-3, respectivamente.

9 caspase-Bcl-2 e Bax estão envolvidos na apoptose por Conjugado

Bcl-2 forma um complexo heterodimérico com proteína Bax apoptótica, neutralizando assim o seu efeito por apoptose. Portanto, a proporção de Bax /Bcl-2 é muitas vezes considerado como um factor decisivo para determinar a morte celular ou sobrevivência. No presente estudo, o tratamento de células com o conjugado resultou numa diminuição na expressão de

Bcl-2

e

Bcl-xL

com um aumento concomitante na

gene Bax

em ambos LNCaP e células PC-3 (Fig. 3). Isto resultou em um aumento substancial em relação Bax /Bcl-2, que favorece geralmente a apoptose. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. [16].