Abstract

privação do andrógeno (AD) é um método eficaz para inicialmente suprimir o câncer de próstata progressão (PC). No entanto, as células PC androgênio refratário inevitavelmente surgir a partir do tumor andrógeno-sensível, levando a doença incurável. Estudos recentes têm mostrado AD induz a senescência celular, um fenómeno que é célula-autonomamente tumor-supressor, mas que confere adaptações promotores de tumor que podem facilitar o advento das populações de células malignas senescência-resistente. Como as células PC androgênio refratário emergem clonal do tumor inicialmente responsivos aos andrógenos, procurou-se investigar se a senescência induzida por AD (ADIS) afeta aquisição de comportamento andrógeno-refratário em células LNCaP e câncer de próstata LAPC4 responsivos aos andrógenos. Nós achamos que a exposição repetida destas células andrógeno-sensível a senescência de indução estímulos via AD cíclica leva à rápida emergência de células resistentes à ADIS, androgênio refratário da população de células senescentes granel. Os nossos resultados mostram que o fenótipo ADIS está associada com características promotoras de tumores, nomeadamente quimiorresistência e mecanismos pró-sobrevivência melhoradas, tais como a inibição da morte celular mediada por p53, o que estimula a persistência das células senescentes. Encontramos, ainda, que a aplicação farmacológica do p53 /activação Bax via nutlin-3 antes do estabelecimento de ADIS é necessário para superar a resposta pró-sobrevivência associada e preferencialmente desencadear morte celular difundida em vez de senescência durante a AD. Assim, nosso estudo demonstra que ADIS promove crescimento de células PC andrógeno-refratária e é, portanto, uma resposta supressor de tumor abaixo do ideal para AD

Citation:. Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz A, Halvorsen K, Patel A, Jorda H, et ai. (2013) privação de andrógeno-induzida Senescence Promove crescimento de células andrógeno-refratário cancro da próstata. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10.1371 /journal.pone.0068003

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de novembro de 2012; Aceito: 28 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Burton et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma concessão New Investigator Florida Biomed Bankhead Coley, da Universidade de Miami /Sylvester Comprehensive Cancer Center Pap Corps Developmental Cancer Research Grant e uma Universidade de Miami /Stanley prêmio Glaser Foundation (para PR). MGG foi parcialmente financiado por uma concessão da pesquisa de Graduação Cancer Center Verão Sylvester Comprehensive. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é uma das neoplasias mais comuns em homens e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer. Para a doença avançada, terapia de privação de androgénio é o regime de tratamento principal devido à dependência crítica de tecido prostático em andrógenos para a proliferação e sobrevivência [1]. No entanto, o eventual aparecimento de tumores andrógeno-refractária, que já não respondem favoravelmente à retirada de androgénio, reduz a expectativa de vida do paciente para menos de dois anos, porque estes tumores são pouco responsiva aos tratamentos adicionais [2], [3]. Os mecanismos moleculares que dão origem a estes tumores andrógeno-refractário não são bem compreendidos. substancial de investigação tem incidido sobre o receptor de androgénio (AR) e sinalização implica aberrações relacionadas com AR, incluindo amplificação do gene, ou independente do ligando de activação à base de ligando promíscuo e expressão alterada de co-regulador [2], [4] – [7]. vias não AR que se pensa estarem envolvidos na proliferação de androgénio-refractário incluem derivação de controlo de proliferação baseados em AR através da activação de oncogenes ou tumor supressor de regulação negativa, a regulação da cromatina alterada da transcrição de genes, a interrupção do mecanismo de controlo do ciclo celular e uma expressão elevada de enzimas esteroidogénicas [8 ] – [14]

no entanto, muitos estudos que investigam esses mecanismos examiná-las no contexto de modelos avançados de câncer de próstata e não abordam as primeiras alterações necessárias para a evasão de supressão do tumor induzida pela AD.. Esta é uma questão importante porque, apesar do seu elevado efeito de tumor-inibitório inicial [15], AD não mata todas as células de câncer de próstata andrógeno-sensível, mas sim induz uma parada proliferativa em uma subpopulação significativa [16]. Considerando-se que as populações de células de androgénio-refractário são caracterizados por a aquisição ou a melhoria de vias pró-tumorigénicas de stress-protectora [8], [10], [17], as propriedades destas células preso-proliferação é provável que sejam importantes na compreensão de como subpopulações de androgênio refratário surgir. Na verdade, é plausível que um subconjunto dessas células presas sair estase proliferativa e tornar-se não-responsiva a AD. Em apoio a esta ideia, foi relatado que os tumores da próstata consistem de misturas de células heterogéneas em termos de resposta de androgénio [18], e que as células de androgénio-refractário surgem como uma população variante seleccionada a partir das células responsivos aos andrógenos parental [18], [19]. Além disso, de acordo com o fenótipo clínico, prolongada ( 6 meses)

In vitro

cultura androgénio-ablação de linhas celulares de cancro da próstata responsivos aos andrógenos conduz à eventual crescimento de clones de privação de androgénio-resistente do crescimento inicialmente população -arrested [8], [20]. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base da paragem do crescimento induzida por AD é crítico para a definição da etiologia de PC-androgénio refractário.

As características moleculares da paragem do crescimento induzida por AD incluem um bloco G1 /S, reduzida actividade de quinase dependente de ciclina, hipofosforilado Rb, e revogação do fenótipo preso por meio de introdução da oncoproteína, T grande de SV40 Antigen [21]. Essas características são consistentes com a prisão induzida por AD sendo uma forma de senescência celular [22], e dois estudos recentes têm relatado que as células privados de androgênio desenvolvimento de marcadores moleculares consistentes com a senescência [23], [24]. Modelos de tumorigénese impulsionado por oncogenes têm demonstrado que a senescência induzida pelo oncogene conduz a pressões selectivas que promovem o crescimento de subpopulações de células tumor agressivo senescência-resistente [25] – [27]. No entanto, este aspecto de promoção de tumor da senescência não tem, a nosso conhecimento, foi explorada anteriormente para a hormona de senescência associada à retirada. Por isso, o nosso estudo concebida para determinar se um paradigma semelhante, ou seja, a evasão de senescência induzida por DC (ADIS), funciona na geração de células de cancro da próstata refractário a partir de androgénios a população responsiva de androgénio-parental. Por conseguinte, no presente estudo, utilizou-se as linhas de células LNCaP e LAPC4 PC, conhecidos como possuindo as principais características salientes de células tumorais prostáticas responsivos aos andrógenos incluindo o receptor robusto androgénio e próstata a expressão do antigénio específico, a proliferação melhorada em resposta a androgénios e cessação proliferativa sobre retirada de andrógeno, e incapacidade de formar tumores em camundongos castrados. Nós cultivadas estas células em despojado carvão soro (CSS) molecular contendo mídia para recapitular AD em cultura. O nosso objetivo foi caracterizar as vias moleculares associados com ADIS e para determinar se pudéssemos isolar variantes senescência resistentes capazes de proliferar sob AD.

Nossos resultados demonstram que ADIS leva a aquisição de características de promoção de tumor, tais como reforçada mecanismos pró-sobrevivência e chemoresistance. Significativamente, a presença sustentada de estímulos de indução de senescência via ad cíclico facilita a expansão de LNCaP andrógeno-refractário resistente à ADIS LAPC4 e variantes dentro de um período de semanas. Estas variantes são parcialmente impressas com características pró-sobrevivência associada com a senescência, apesar de ser resistente a ADIS. Assim, nossos resultados suportam coletivamente um papel para o fenótipo senescente em engendrar alterações que promovem a emergência de células tumorais andrógeno-refratário.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todas as pesquisas envolvendo seres humanos foi aprovado pela Universidade de Miami Institutional Review Board. O IRB aprovados dispensa do consentimento para este protocolo.

Cultura celular

LNCaP e LAPC4 células (ATCC) foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS; Gibco, Invitrogen) ou 5% de soro bovino fetal despojado com carvão (CSS; Gibco, Invitrogen) e 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (Gibco, Invitrogen) a 37 ° C em 21% de oxigénio /5% de CO

2. Para culturas quiescentes, as células foram cultivadas como anteriormente, mas na ausência de qualquer soro.

em zigue-zague (SB) para gerar andrógeno-refractário resistente ADIS LNCaP Variantes

Células LNCaP foram semeadas em ambos placas de 10 cm (3 × 10

5 células) ou 15 cm pratos (1 × 10

6 células) em RPMI 5% FBS para 36-48 horas antes de ser transferido para RPMI 5% CSS. O meio foi substituído a cada 3-4 dias durante 14 dias, para induzir ADIS, após o que as culturas foram restaurados para RPMI 5% de meio FBS. Após a conseqüência de colônias de células visíveis, as células foram tratadas com tripsina e ampliado para uma ou duas passagens antes do procedimento foi repetido.

Criação e transdução estável de shRNA e fluorescentes Constrói-expressam a proteína

O retroviral pWZL GFP -blast foi um presente do laboratório do Dr. Robert Weinberg. Os vectores de shRNA foram gerados como descrito anteriormente [28], [29]. sequências candidatas validado ou altamente marcados a partir da biblioteca de TRC amplo consórcio shRNA (https://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) foram seleccionadas e subclonado no vector lentiviral pLKO.1 com uma cassete de resistência à puromicina. Os oligonucleótidos foram adquiridos a Integrated DNA Technologies, Inc. As construções foram sequenciadas para assegurar a presença do inserto. O controle shRNA foi dirigido contra GFP: 5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 ‘. Foram utilizados os seguintes sequências alvo:

shp53: 5’GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 ‘,

shp16: 5’GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3′

O Shar construir [30] foi um presente de Dr. Kerry Burnstein na Universidade de Miami e foi dirigido contra a sequência seguinte: 5. ‘GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3’

lentiviral ou retroviral produção foi realizada em células HEK 293T e infecção de células alvo foram realizadas como descrito anteriormente [29]. As células transduzidas foram seleccionadas em 2 ug /ml contendo puromicina ou 10 ug /ml blastocidin contendo meios de comunicação (por SB5 células GFP) por um período mínimo de 5-7 dias (o que corresponde ao tempo necessário para que as células não transduzidas para morrem completamente na selecção meios de comunicação). Para shRNAs, knockdown proteína foi verificado através de Western blot. expressão da GFP nas células SB5 foi verificada por meio de imagiologia de epifluorescência e análise citométrica de fluxo.

Western Blotting e anticorpos utilizados

As células foram colhidas por raspagem mecânica em gelo e foram lisadas num fluoreto de sódio (NaF ) tampão contendo vanadato de sódio, PMSF, DTT e inibidor de proteinase. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o reagente de Bradford (Biorad). 30-50 ug de proteína total foi corrida num gel de Bis-Tris NuPage pré-fundido de 4-12% (Invitrogen) no sistema de gel Novex pré-moldados e, posteriormente, transferida para uma secção de membrana PVDF (Immobilon, Merck) a 30 V a 4 ° C. As membranas foram coradas em reagente de Ponceau para determinar ainda o carregamento e a transferência, lavou-se em 0,1% TBST e depois sondadas com anticorpos contra as proteínas seguintes: Ar (sc-816, Santa Cruz Biotech), p53 (sc-126, Santa Cruz Biotech), p21 (SC-817, Santa Cruz Biotech) p16

INK4 (554.079, BD Biosciences), ciclina A (SC-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) Bcl-2 (SC-492, Santa Cruz Biotech), Bax (SC-493, Santa Cruz Biotech) Mcl-1 (sc-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), fosfo-Akt (4060, Cell Signaling) Akt total (9272, Cell Signaling) clivada-PARP (9541, Cell Signaling), survivina (71G4B7, Cell Signaling), TAp63 (618.902, BioLegend), p27 (SC-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619.002, BioLegend). A seguir à incubação com os anticorpos apropriados conjugados com peroxidase de rábano secundário (Amersham), as manchas foram desenvolvidas utilizando o ECL Plus (GE Healthcare) solução de revelação. Seguindo immunoblotting, as membranas foram coradas com Coomassie corante azul (Sigma) para normalizar para o carregamento total de proteína.

celular Cycle Analysis

Cerca de 1 × 10

6 células foram colhidas através de tripsinização. As células foram lavadas uma vez em meio contendo soro a frio, duas vezes em PBS frio e, em seguida, ressuspensas em 200 ul de PBS 2 mM de EDTA. Cerca de 600 ul de etanol frio a 70% foi adicionada gota a gota às células, enquanto vórtex-los a uma velocidade média. As células foram mantidas a 4 ° C durante a noite para a fixação. Antes da análise, as células foram centrifugadas a 4 ° C a 1000 rpm durante 5 minutos e o etanol foi cuidadosamente aspirado. Os sedimentos celulares resultantes foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS EDTA 2 mM e 10 ul inactivado pelo calor a RNase A (10 mg /ml, Sigma). Em seguida, 25 ul de iodeto de propídio (PI) (1 mg /ml, Sigma) foi adicionado à suspensão celular. As células foram incubadas a 37 ° C num banho de água durante 30 minutos e imediatamente analisadas num citómetro de fluxo Accuri C6 (BD) utilizando o laser de excitação PI (FL2). A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada com cflow Além disso citómetro de software, Análise cflow 202,1, medindo a área sob o segmento correspondente do perfil (como se mostra). Perfis foram remarcado em MS Excel para maior clareza.

Medidas Proliferação Celular

Para determinar taxas de proliferação celular de células LNCaP em ambos os FBS e mídia contendo CSS, 1 × 10

5 foram semeadas em 6 cm placas e contagem de células, usando um hemocitômetro, foram realizadas a cada 24 horas, em triplicado ao longo de um período de seis dias usando um hemocitômetro. o meio fresco foi adicionado a cada 2-3 dias. Para as experiências de salvamento na Fig. 1D, as células foram semeadas em meio FBS durante 24 horas antes de mudar para a mídia CSS. As células foram comutados de volta aos meios de FBS, para os pontos de tempo indicados.

(A) senescência associada beta-galactosidase (SA-beta-gal) coloração sob as condições indicadas e pontos de tempo. FBS, soro fetal bovino indicando cultura andrógeno-repleta; CSS, soro despojado carvão indicando androgénio cultura privados. 9D FBS pós-SEN denotam células LNCaP que foram submetidos a 14 dias de cultura CSS e depois passou a media FBS durante 9 dias. A quantificação de células coradas positivamente é apresentado para a direita das imagens representativas. (B) Ki67 coloração pan-proliferação marcador a condições indicadas e pontos de tempo. DAPI coloração é utilizado para marcar os núcleos das células para fins de contagem das células de Ki67-positivas. Percentagem de células coradas é representada graficamente no lado direito. (C) O iodeto de propídio análise do ciclo celular, em pontos de tempo indicados e as condições de cultura. Note-se a fração de fase S cai de 15,6% em FBS a 0,4% a 10d CSS e para 0,8% após a restauração para a mídia FBS durante 9 dias (9D FBS pós-SEN). (D) curva de proliferação de células LNCaP cultivados em CSS para 3, 8 ou 14 dias antes de ser comutado para meio FBS. (E) Determinação dos níveis totais de ROS por citometria de fluxo em células LNCaP no dia 1, dia 4 e no dia 7 de cultura condições indicadas. Observe o pico da direita deslocado em vermelho correspondente ao aumento dos níveis de ROS nas células LNCaP CSS-cultivadas em relação a células FBS-cultivadas. (F) DNA ruptura de fita dupla (DSB) focos detectados via H2AX /co-coloração 53BP1 (verde = H2AX, vermelho = 53BP1) para células LNCaP cultivados nas condições indicadas. Imagens representativas de células com os diferentes números de focos contados são mostrados. Note-se que a percentagem de células com 5+ focos aumenta com a duração da cultura CSS.

Experimentos celular Co-cultura e Análise

Para os experimentos de co-cultura, 1 × 10

5 células LNCaP-SB5-GFP (gerado a partir de células SB0 LNCaP estavelmente transduzidas com pWZL-explosão GFP) foram colocadas em placas em quadruplicado em placa de 10 cm, quer sozinho ou co-misturado com 1 × 10

5 LNCaP não marcado SB0, SB5 ou células LNAI. As células foram inicialmente semeadas em 5% de FBS meio completo (dia 0) e no Dia 1, as co-culturas foram mudados para meios CSS 5% e mantidas por 7 dias, com uma mudança de meio cada três dias CSS. culturas representativas foram analisadas em duplicado, por citometria de fluxo em um Accuri C6 citômetro no Dia 1 para garantir um número relativamente equivalentes de células verdes e não verdes estavam sobrevivendo na cultura. Usando as células plaqueadas SB5-GFP sozinho, gating foi realizada no canal FITC para separar as células GFP a partir de células não-GFP. As células foram ainda mais fechado para excluir /partículas SSC baixos do FSC para garantir que apenas as populações de células vivas foram sendo analisados. No dia 7, citometria de fluxo foi usada para determinar as percentagens relativas de GFP-positiva contra populações de células não marcadas, bem como o número total de células positivas para GFP (SB5). Histogramas e gráficos de pontos foram plotados usando o software BD Accuri Análise C6 para Mac OSX. Todas as medições foram realizadas em duplicado num mínimo de duas experiências independentes.

SA-beta-gal Actividade (SA-beta-gal)

coloração SA-beta-gal foi realizada tal como descrito noutro local [31]. Resumidamente, as células foram lavadas em PBS, fixadas em 0,2% de glutaraldeído, durante 5 min à temperatura ambiente, lavadas uma vez em PBS e incubadas durante a noite em solução de coloração recém-fabricados (1 mg /ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-galactósido (Sigma), 150 mM de NaCl, 2 mM MgCl

2, 5 mM de K

3Fe (CN)

6, 5 mM de K

4Fe (CN)

6, 40 NaPi mM, pH 6,0). No dia seguinte, as células foram incubadas durante mais uma hora a 37 ° C, para intensificar a coloração e, em seguida, lavadas e armazenadas em PBS a 4 ° C. Para quantificar coloração positiva, 100 células foram contados para cada uma das amostras em diversos campos de visão a fim de se obter um desvio padrão. Os experimentos foram realizados pelo menos em duplicado, em dois experimentos independentes.

Ki67 Coloração

Para a detecção de coloração Ki67, as células foram colocadas em placas a 2 × 10

4 células por câmara e à esquerda por 36-48 horas antes de qualquer mudança para CSS, o tratamento bicalutamida ou fixação de FBS apenas amostras. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% (da 16%, Electron Microscopy Sciences) durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de permeabilização em 0,1% de PBST (10 min à temperatura ambiente), e bloqueadas durante 1 hora em 0,1% de Triton X, 15% de FBS , em PBS, à TA. O anticorpo Ki67 (Santa Cruz) foi diluído a 1:50 em tampão de bloqueio e incubadas a 4 ° C durante a noite. As células foram lavadas 5X, 10 minutos de cada vez à TA em solução de bloqueio, num agitador. O anticorpo secundário fluororo conjugado apropriado (anticorpos de cabra anti-ratinho-FITC, Santa Cruz) foi adicionado numa diluição 1:100 em tampão de bloqueio e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas 5X em 0,1 TritonX, 10 minutos de cada vez num agitador à TA no escuro. meios de montagem DAPI (Vectashield) foi adicionado antes lamela de montagem. imagens de imunofluorescência foram adquiridos em uma câmera Nikon ligado a um microscópio Zeiss vertical.

H2AX /53BP1 Coloração

H2AX /53BP1 coloração foi realizada como descrito em outro lugar [28]. Resumidamente, foram semeadas 20.000 células por câmara (BD Falcon, cultura lâminas 4-Secção) em meio RPMI FBS a 5% e transferido para meio RPMI 5% CSS 24 horas mais tarde. H2AX coloração /53BP1 foi realizada a pontos de tempo indicados. As células foram fotografadas em condições de aquisição idênticos em 6000 B microscópio digital invertida Leica DMI com uma câmera DFC350 FX anexado e software de fluorescência FW4000 I. Apenas co-localizada H2AX /focos 53BP1 foram contados como positivo e um mínimo de 100 células foram marcados em vários campos.

Droga tratamento de células LNCaP

As células LNCaP foram cultivadas em meio apropriado (5 % de FBS ou CSS) que contêm docetaxel (1 nM), o flavopiridol (0,5 uM), ou o bortezomib (1 uM) durante 72 horas, e flutuantes e células ligadas tripsinizadas foram reunidas e analisadas por coloração com azul de Tripano. células LNCaP-SB0 e LNCaP-SB5 foram cultivadas em meio (RPMI + FBS a 5%) contendo docetaxel (1 nM) durante 72 horas e analisadas por coloração com azul de Tripano. Pelo menos 3 experimentos independentes foram realizadas em duplicado e as diferenças estatísticas entre células tratadas com a droga foram determinadas pelo

t

-teste com p . 0,05 considerado significativo

transcriptase reversa PCR

o ARN total foi isolado a partir de células LNCaP cultivadas em FBS e meios de CSS durante 14 dias, utilizando o Kit de RNAqueous-4PCR (Ambion). Um total de 1 ug de RNA purificado foi sujeitos a transcrição reversa usando um iniciador aleatório, incluída no kit, para se obter ADNc através da alta capacidade de ADNc Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems). O cDNA foi usado como molde para amplificação por PCR utilizando AmpliTaq Gold® 360 Mistura de PCR (Applied Biosystems) e os iniciadores foram como se segue

GAPDH iniciador directo:.

5 ‘GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3’

GAPDH iniciador inverso:

5 ‘CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3’

IL8 iniciador directo:

5 ‘TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3’

IL8 iniciador reverso :

5 ‘AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3’

Os produtos de reacção foram corridos em gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio. GAPDH foi usada como um controlo de normalização interna.

Medição da morte celular

tratadas e as células de controlo foram recolhidas, ressuspensas em PBS, e diluiu-se 1:01 em 0,4% de azul de Tripano (Invitrogen). células não-coradas mortos (azul) e vivem imediatamente contadas utilizando um hemacitómetro. A percentagem de células mortas foi determinada a partir de pelo menos três experiências independentes realizadas em duplicado.

Medição dos níveis celulares de ROS

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [28]. Resumidamente, as células indicadas em confluência equivalente foram recolhidos através trypsination, lavadas em solução salina tamponada de Hank 1X arrefecido em gelo (HBSS) e incubadas com recém-preparado 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato ( CM-DCF-DA; Molecular Probes /Invitrogen, C6827) durante 20 min a 37 ° C. As células foram então lavadas e ressuspensas em HBSS 1X antes da detecção do sinal de FITC por meio de células activadas por fluorescência (FACS). análise de citometria de fluxo foi realizada em um citômetro Accuri C6 (BD Biosciences). O eixo x representa o canal FITC (FL1) na intensidade de fluorescência de log-escala e o eixo y representa o número de células. Os experimentos foram realizados pelo menos em duplicado, com que está sendo mostrado perfis representativos.

Crystal Violet Coloração

Aproximadamente 3 × 10

5 células foram semeadas em placas de 10 cm contendo RPMI mais 5% FBS por 36-48 horas antes de mudar para RPMI mais 5% CSS. Media foi atualizado a cada 3-4 dias. Para a coloração de violeta de cristal, o meio foi aspirado e as células lavadas uma vez em PBS 1X, solução de violeta de cristal a 1% foi adicionado a cada placa e deixados para corar durante 2 minutos à temperatura ambiente. O corante foi removido e cada prato lavadas duas vezes em água desionizada. Pratos foram então submerso em água por 20-30 minutos para lixiviar excesso de corante e reduzir o fundo, e à esquerda para a noite de ar seco antes de contar colônias ou tirar fotos. Os experimentos foram realizados em duplicado

Análise Estatística

A significância estatística dos resultados foi determinada pelo cálculo de desvio padrão da média e por um teste t de Student bicaudal, com p . 0,05 considerada significativo.

resultados e conclusões

Características de ADIS em LNCaP e células LAPC4

a fim de confirmar se a prisão proliferativa observada após AD é devido à indução de senescência celular , utilizou-se a linha celular sensível ao androgénio bem caracterizado LNCaP, uma vez que possui as versões funcionais dos dois principais mediadores da senescência vias, p53 e p16

INK4a, [33] [32]. Além disso, congruente com modelos clínicos de cancro da próstata, células LNCaP mostram excrescências espontâneas de variantes de androgénio-refractário seguintes cultura a longo prazo em meio destituído de andrógeno [20], [34]. Dessa forma, cultivaram células LNCaP em meios contendo CSS (doravante referidas como cultura CSS) para imitar AD e emergência avaliada de marcadores de senescência celular.

Nós descobrimos que além da prisão proliferativa esperado (Fig. S1A ) e a aquisição de uma morfologia neuroendócrino [35] (Fig. 1A), as células LNCaP CSS-cultivadas também desenvolvidos outros marcadores distintos de senescência celular (Fig. 1) [36]. Estes actividade incluída aumentada associada a senescência da beta-galactosidase (SA-beta-gal) (Fig. 1A), diminuição da coloração para o marcador pan-proliferação, Ki67 (Fig. 1B) e uma prisão /ciclo celular G1 S (Fig. 1C ). Após 7 dias em cultura CSS, 50% das células exibiram estas características e em 10 dias em CSS, a fracção subiu para 80% da população a granel (Figura 1A-B.). O tratamento com o anti-androgénio, bicalutamida, cessação proliferativa induzida e também o aparecimento de um fenótipo senescente, conforme determinado por coloração com SA-beta-gal e um G1 /S de detenção (Fig. S1). Em contraste, foi observada a morte celular mínimo sobre CSS ou bicalutamida tratamento como avaliado por uma falta visual de células redondas, não acopladas e expressão de PARP clivada (dados não mostrados). Significativamente, quando as células foram restaurados para soro fetal bovino androgénio-repleto (SFB) após 14 dias de cultura CSS, a população de grandes quantidades retidas marcadores senescentes (mostradas no caso de restauração para repletar cultura FBS durante 9 dias, denominado 9D FBS pós -sen), indicando que a proliferação de detenção é permanente e não, de natureza transitória (Fig. 1A-C).

Para distinguir ainda mais o CSS induzida por cultura de detenção proliferação do fenómeno temporário de quiescência celular, foi realizada cultura células de LNCaP em meio isento de soro, para induzir a quiescência conhecidos [37], durante 7 dias em paralelo com as células cultivadas em meios CSS. Depois disso nós mudamos os dois conjuntos de células de volta à mídia FBS durante 4 dias. Considerando que as células LNCaP submetidas a cultura livre de soro retomado proliferação na restauração de meios completo, correspondente a um aumento na proliferação marcador, ciclina A, as células CSS-cultivadas não o fez (Fig. S2). À medida que as células LNCaP sofrer mais nenhuma duplicações da população, uma vez colocada sob cultura privada de androgénios (Fig. S1A) mas demorar até 4 dias para mostrar aquisição significativo de marcadores de senescência (Fig. 1A, B), queríamos determinar se essa prisão proliferação foi reversível antes de 4 dias de depleção androgénica. Para isso, as células LNCaP foram transferidos de volta para a mídia andrógeno-repleta aos 3, 8 ou 14 dias pós-CSS cultura (Fig. 1D). Descobrimos que as células voltou à mídia FBS no dia 3 foram prontamente capaz de retomar a proliferação. Em comparação, as células mudaram para repletar meios no dia 8 não retomar a proliferação completo, mas um subconjunto destas células foram capazes de continuar a dividir, o que sugere uma população de células de forma irreversível preso parcial. Consistente com os resultados da Fig. 1A-B, não foi observada nenhuma proliferação de células quando foram transferido de volta aos meios de comunicação completa após 14 dias em cultura com CSS (Fig. 1D). Assim, em conjunto, os nossos resultados verificar se AD induz as principais características de senescência celular em células LNCaP.

O fenótipo ADIS observamos em células LNCaP foi precedida por aumentando progressivamente totais níveis de ROS celulares, observado já em um dia depois de ligar células a meios CSS (Fig. 1E), bem como pelo aparecimento de progressivamente maiores quantidades de co-localizada gama-H2AX e focos 53BP1 (Fig. 1F). Estes focos são indicativos de uma resposta de dano de DNA de montagem (DDR), presumivelmente em resposta a danos no ADN não reparados persistente [28], [38]. A elevação ADIS-associado em níveis de ROS e focos de lesão do ADN são consistentes com a etiologia conhecida de senescência celular [36], reforçando ainda mais que o AD gera tensões a montante conhecidos para desencadear a senescência celular.

ADIS é mediada pelo p16

Pathway INK4a e associada à supressão da p53 Pathway

Dois principais vias supressores de tumores, o p53 /p21

Cip1 /WAF1 e p16

INK4a, normalmente mediar a senescência [39], [ ,,,0],40]. Dependendo do tipo de célula ou estressor, o fenótipo senescente está associada com a activação de uma ou ambas estas vias [39], [41]. No entanto, mesmo que ambas as vias são ativadas, pode predominar para impor o fenótipo senescente [28], [40]. Consequentemente, nós ensaiada células LNCaP a aumentar a duração da cultura CSS por sondagem lisados ​​de proteína total destas amostras para os níveis das proteínas mediadoras senescência, p16

INK4a e p53 /p21

Cip1 /WAF1. Como esperado, a expressão AR diminuiu com o aumento da duração da cultura CSS (Fig. 2A). Embora,

a priori, a existência de um DDR persistente (Fig. 1F) levou-nos a esperar que a via de p53 /p21 poderia ser envolvido, descobrimos que, em vez ADIS foi associado com o aumento de expressão de p16

INK4a (Fig. 2A). Surpreendentemente níveis de p53 e sua proteína ciclo-regulação das células efetoras, p21

Cip1 /WAF1, diminuiu com o aumento da duração da cultura CSS (Fig. 2A). Além disso, a adição de 10 nM dihidrotestosterona (DHT) para a mídia CSS foi capaz de impedir tanto a diminuição observada nos níveis de AR e ciclina A e as mudanças ADIS-associados para p16

INK4a e expressão p53 (Fig. S3A). Esta descoberta confirma estas alterações moleculares ocorre especificamente devido à ausência de androgénio no meio de cultura.

(A) imunotransferência foi realizada em cerca de 35 ^ g de amostras de proteína indicada com anticorpos contra as proteínas designadas. coloração com azul de Coomassie foi utilizado para normalizar para a carga de proteína total. Note-se que a expressão de AR diminui à medida que o esperado na cultura CSS. A tendência de p53, p21 e proteína p16 expressão é mantida após uma restauração de andrógeno-repleta cultura pós-senescência (pós-SEN), indicando a permanência das alterações. (B) Immunoblotting para mostrar efeitos da knockdown shRNA mediada por p16 em ADIS. Nota níveis elevados de AR e ciclina A em células shp16 sob CSS cultura relativamente ao controlo ou células shp53 knockdown. (C) Efeito de supressão de p16 na coloração de SA-beta-gal. As células indicadas foram cultivadas em CSS por 14 dias e depois passou a FBS- contendo media por mais 9 dias. Observe o decréscimo observado na coloração SA-beta-gal em shp16 células. * P . 0,05

De forma significativa, p16

níveis de expressão INK4a manteve-se elevada e p53 /p21 permaneceu baixa na população em massa, mesmo depois de a cultura andrógeno-repleta foi restaurado (Fig 2A.). Esta observação suporta a permanência dos circuitos moleculares associados a senescência activados por cultura com privação de androgénio, apesar da recuperação parcial dos níveis de expressão de AR (Fig. 2A). p16 elevada

níveis INK4a juntamente com coloração SA-beta-gal elevada, a proliferação reduzida e diminuição da AR e ciclina A expressão também foram observados após a cultura CSS do andrógeno-sensível, mas linhagem de células LAPC4 p53 mutante [32] (Fig. S4A-D). 5A.