Abstract

Aim

microRNAs (miRNAs) estão envolvidos em várias doenças neoplásicas, incluindo cancro da próstata (PCs). O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de miRNA no tecido PC, para avaliar a sua associação com os dados clínico-patológicas, e avaliar o potencial dos miRNAs como marcadores de diagnóstico e prognóstico.

Materiais e Métodos

a partir de uma coorte de 535 pacientes submetidos à prostatectomia radical (RP), uma amostra de 30 pacientes (14 pacientes com insuficiência rápida bioquímica (BF) e 16 pacientes sem BF) com escore de Gleason 7 foram analisados. Um total de 1435 miARNs foram quantificados por hibridação de micromatriz, e miARNs com o maior desvio padrão (n = 50) foram validados por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) seleccionado.

In situ

hibridação (ISH) foi utilizado para avaliar a expressão de miR-21.

Resultados

miR-21 foi o único miR que foi significativamente regulada para cima no o grupo BF (p = 0,045) miR-21 foi regulada em doentes com BF em comparação com o grupo não-BF (p = 0,05). Nas análises univariadas, expressão alta de estroma de miR-21 teve impacto preditivo na sobrevida livre de bioquímica fracasso (BFFS) e sobrevivência clínica livre de falhas (CFFS) (p = 0,006 e p = 0,04, respectivamente). Na análise multivariada, a expressão alta de estroma de miR-21 expressão foi encontrado para ser um fator independente de prognóstico para BFFS em pacientes com Gleason score 6 (HR 2,41; IC 95% 1,06-5,49, p = 0,037).

Conclusão

expressão alta de estroma de miR-21 foi associado com pior sobrevida livre de recidiva bioquímica após RP. Para pacientes com Gleason score 6, miR-21 pode ajudar a prever o risco de progressão da doença futuro e, assim, ajudar pacientes selecionados para o tratamento adjuvante potencial ou um mais rigoroso acompanhamento

Citation:. Melbo-Jørgensen C, Ness N, Andersen S, Valkov A, Dønnem T, al-S Saad, et al. (2014) Estromal expressão de miR-21 Prevê falha bioquímica em pacientes com cancro da próstata com Gleason Pontuação 6. PLoS ONE 9 (11): e113039. doi: 10.1371 /journal.pone.0113039

editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão

Recebido: 14 Agosto, 2014; Aceito: 17 de outubro de 2014; Publicação: 17 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Melbo-Jørgensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Helse Nord, A Administração do Norte Saúde (www.helse-nord.no) e da Universidade de Tromsø University Arctic da Noruega (www.uit.no). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é a segunda principal causa de morte relacionada com câncer entre os homens [1]. A evolução da doença é variável e difícil de prever. Durante os últimos 30 anos, o número de prostatectomias radicais (RP) aumentou 25 vezes, devido principalmente a doentes com cancro overdiagnosed não-letal [2]. O teste para antígeno prostático específico (PSA) é a ferramenta mais comum para detectar câncer de próstata. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que as concentrações de PSA não são capazes de diferenciar entre cancros indolentes e com risco de vida no momento do diagnóstico [3]. Uma identificação de melhores marcadores prognósticos para a estratificação de risco, portanto, têm grande impacto sobre o manejo clínico de PC.

miRNAs constituem uma classe de pequenas moléculas RNA não codificante (~ 20 nucleotídeos) que estão envolvidos na regulação da expressão de proteínas . miARN pode ser produzido como um subproduto da produção de ARNm de passageiros inter-intrão, ou pode ser transcrito como um produto único ou policistrónico por ARN polimerase II [4]. Eles funcionam por ligação à extremidade 3 ‘UTR do ARNm alvo, e induz o silenciamento do ARNm por Argonaut (AGO) proteína no complexo proteína silenciamento induzido por ARN (RISC) [4], [5]. Muitos miARNs são desregulado no cancro e influência na formação e progressão do tumor porque eles estão localizados em regiões do genoma que são geralmente sobre-expressas ou eliminados [6]. Vários miARNs e os seus alvos são expressos de forma anormal no PC, que leva à progressão do tumor, invasão e metástase. As expressões alteradas de alguns miRNAs selecionados são potencialmente úteis como biomarcadores para o diagnóstico, prognóstico e fins de classificação de PC [7] – [9]. miR-21 foi o primeiro a ser miARN oncogénicos descoberto [10]. No PC, miR-21 é considerada a agir como um oncogene, mas o seu papel não é clara, e os relatórios são conflitantes. Hülf et ai. [11] verificaram miR-21 para actuar como um gene supressor de tumor, enquanto Ribas et al. [12] relataram que a sobre-expressão de miR-21 promoveu o crescimento do tumor dependente de hormonas e independente de hormonas em linhas celulares PC. Além disso, concluiu-se que níveis elevados de miR-21 aumenta o desenvolvimento do tumor, crescimento de tumor e o fenótipo resistente à castração induzida [13]. Em contraste, Folini et ai. [14] não encontraram diferenças na expressão de miR-21 entre o tecido da próstata normal e PC. Shi et al. [15] verificaram miR-21 a ser envolvido na quimiorresistência e que o miR-21 foi regulada em células PC3 resistente docetaxel (PCR3) em comparação com células PC3 de tipo selvagem.

Neste estudo, investigou-se a miARN perfil em pacientes de PC. Entre 1435 miRNAs, miR-21 foi o único miRNA candidato que foi significativamente regulada para cima e foi submetido a uma avaliação posterior como marcador de prognóstico para toda a coorte. O Comité Regional para Médicos e de Saúde de Ética em Pesquisa (2009/1393), o Oficial de Proteção de Dados de Pesquisa (NSD) e do Conselho Nacional de Inspeção de Dados já aprovou este estudo. O comitê de ética dispensou a necessidade de consentimento. Os registros dos pacientes foi anónimos e de-identificados antes da análise.

Pacientes e Métodos

Pacientes e amostras de tecido

tecido do tumor primário de 535 prostatectomia radical (RP) pacientes diagnosticados no Hospital Universitário do Norte da Noruega, Hospital St. Olav e Hospital Nordland a partir 1995-2005 foram utilizados neste estudo. embebidos em parafina blocos de tecido adequados e dados demográficos e clínico-patológicos completos foram obtidos para todos os pacientes (Tabela 1). Os tumores foram classificados de acordo com o sistema de graduação de Gleason modificado [16] e encenado de acordo com as orientações da OMS [17]. Todos os tecidos primários foram histologicamente revisto por dois patologistas (ER e LTB).

miRNA triagem

Para miRNA profiling, 30 pacientes dentro da pontuação de Gleason (GS) 7 subgrupo foram consecutivamente escolhido , 14 deles com uma rápida BF falha bioquímica (PSA≥0.4 ng /mL no prazo de 24 meses após a cirurgia) e 16 pacientes sem BF. GS 7 foi escolhido como estes pacientes mostram uma evolução clínica heterogênea. Os miARNs foram identificados por hibridação de micromatriz e quantificado com RT-qPCR (Tabela 2). Um total de 1435 miARNs foram quantificados por hibridação de micromatriz e miARNs com o maior desvio padrão (n = 50) foram seleccionados validado por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR). Sete miARNs foram identificados como o mais para cima ou para baixo-regulado. Destes, miR-21 foi o único candidato miR que foi significativamente up-regulada por fold-change. MiR-21 expressão foi então investigada em toda a coorte por cromógeno

em

situ

hibridação (CISH) e avaliada como um marcador de prognóstico para PC. Ambas as células epiteliais e tumorais associados a tumores estromais áreas foram investigados separadamente. O tempo médio de acompanhamento foi de 89 meses (intervalo de 6-188). A última atualização do paciente era de Novembro de 2012.

construção Microarray

Tissue Microarray (TMA) construção foi escolhido para high-throughput análise de patologia molecular [18]. Para cada caso, um patologista (ER) histologicamente identificado e marcado dois núcleos com áreas de células de tumor (células de tumor epitelial), dois cones com um tecido do estroma do tumor, um núcleo a partir de áreas com as células epiteliais normais, e um núcleo com os tecidos normais do estroma. O TMA foram montados usando um instrumento de arraying tecido (Beecher Instruments, Silver Springs, MD, EUA). Resumidamente, foi utilizada uma agulha de diâmetro 0,6 mm a colheita das áreas de tecidos marcados a partir do correspondente (FFPE) blocos de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina. As amostras foram inseridos num bloco de parafina receptor vazio de acordo com um padrão de coordenadas. Para incluir todas as amostras de núcleo, doze blocos de matriz de tecido foram construídos. Múltiplas 4 mm seções foram cortadas com um micrótomo Micron (HM355S) aposta lâminas de vidro e seladas com parafina. A metodologia detalhada foi reportado anteriormente [19].

ARN extracção

O ARN foi isolado a partir de amostras embebidas em parafina e fixado em formalina com RECOVERALL totais Ácido Nucleico kit de isolamento de tecido FFPE (Life Technologies) , e foi enviado para Exiqon (Vedbaek, Dinamarca), que realizou o experimento de triagem miRNA. Tecido usado para extração de RNA foi três 4 mm de profundidade, 0,6 mm de diâmetro núcleos cilíndricos colhidas a partir de compartimentos tumorais marcadas a partir de blocos FFPE. O microarray utilizado foi LNA matriz 6

th geração humana, de rato e microarray viral projetado com uma biblioteca de miRNA com 1.435 humano, rato e miRNA viral. O ARN total (500 ng) a partir de tanto a amostra como referência foi rotulado com marcador fluorescente e Hy3 hY5, respectivamente, utilizando o kit de etiquetagem miRCURY LNA microARN Hi-Power, Hy3 /hY5 (Exiqon, Dinamarca) seguindo o processo descrito pelo fabricante. As amostras Hy3-rotulados e uma amostra de RNA de referência hY5 marcado foram misturados por pares e hibridizadas para a matriz sexta miRCURY LNA microRNA Gen (Exiqon, Dinamarca), que contém sondas de captura dirigidos a todos os microRNAs para o homem, rato ou rato registrado no miRBase 16,0. A hibridação foi efectuada de acordo com o manual de instruções matriz miRCURY LNA microARN usando uma estação de hibridação Tecan HS4800 (Tecan, Áustria). Após a hibridação, as lâminas de microarray foram digitalizados e armazenados em um ambiente livre de ozono (nível de ozono inferior a 2,0 ppb), a fim de impedir que o potencial de branqueamento dos corantes fluorescentes. As lâminas de matriz miRCURY LNA microRNA foram escaneados usando o G2565BA Microarray Sistema Agilent Scanner (Agilent Technologies, Inc., EUA) e da análise de imagens foi realizada utilizando o Imagene 9 (miRCURY LNA microRNA matriz Software Análise, Exiqon, Dinamarca). Os sinais quantificados foram fundo corrigida e normalizada usando o Lowess global (Scatterplot localmente ponderadas Smoothing) algoritmo de regressão.

Quantificação de miRNAs maduros por em tempo real qPCR

Os critérios de selecção miRNAs para validação de PCR estava; P-valor significativo, a mudança alta vezes e plausibilidade antes. Os miARNs escolhidos para testes adicionais foram miR-21, o miR-141, miR-23a, o miR-222, o miR-205, o miR-143 e miR-145 (Tabela 2). Todas as experiências em tempo real foram realizados por qPCR Exiqon (Vedbaek, Dinamarca).

ARN (2 mL) foi transcrito de modo reverso em 10 ul reacções usando o miRCURY LNA Universal PCR RT microARN, poliadenilação e o kit de síntese de cDNA (Exiqon ). O ADNc foi diluída 100 X e ensaiaram-se em reacções de PCR de 10 uL de acordo com o protocolo para miRCURY LNA Universal PCR RT microARN; cada microRNA foi ensaiada em triplicado por qPCR no microRNA personalizado feito painel pick-n-mix. Os controlos negativos excluindo modelo a partir da reacção de transcrição reversa foi realizada e perfilado como as amostras. A amplificação foi realizada num LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche) em placas de 384 poços. As curvas de amplificação foram analisados ​​utilizando o software LC Roche, tanto para a determinação do ponto de cruzamento (Cp) pelo método segundo derivado, e para a fusão de análise da curva.

A eficiência de amplificação foi calculada usando algoritmos similares para o software LinReg . Todos os ensaios foram inspeccionados para as curvas de fusão distinto e a temperatura de fusão (T

M) foi verificado para estar dentro das especificações conhecidos para o ensaio. Além disso, os ensaios foi detectada por 5 de Cp menos do que o controlo negativo, e com PC 37 para ser incluído na análise dos dados. Dados que não passou esses critérios foram omitidos quaisquer análises posteriores.

Usando NormFinder o melhor normalizador foi encontrado para ser o miR-23b. Todos os dados foram normalizados para esse miRNA em todas as amostras (miR-23b – ensaio Cp).

In situ

hibridação

Chromogen

em

situ

hibridação (CISH) foi realizada de acordo com “Um dia de microRNA ISH protocolo”, desenvolvido pela Exiqon, Vedbek, Dinamarca. ácido nucleico bloqueado Rotulados (LNA) modificado sondas de Exiqon para miR-21 (HSA-miR-21miRCURY LNA Prod No. 38102-15.), controle positivo (U6 tem /MMU /rno) controlos negativos e (disputa-miRNA) foi usava. Alguns optimizações do método foram feitas para obter uma detecção específica e sensível de miARN nas nossas secções de FFPE TMA.

4? M TMA lâminas foram incubadas durante três dias a 37 ° C para anexar núcleos para a super geada Além disso lâminas . As secções foram deparaffinised em xileno (3 × 5 minutos) e, em seguida hidratado para soluções de etanol a PBS, pH 7,4. Proteinase K-20 um /ml, o tratamento foi feito em PK-tampão (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl a 1 mM, autoclavado) a 37 ° C durante 20 min num hybridizer ThermoBrite. Após lavagem com PBS, as secções foram re-hidratadas por meio de etanol e seco ao ar. Os LNA-sondas foram desnaturadas por aquecimento a 90 ° C durante 4 min. A hibridação das sondas LNA-miR-21 (50 nM), mexidos miARN (50 nM) e U6 (1 nM) foram realizadas num hybridizer ThermoBrite a 50 ° C durante 60 min. lavagens de restringência foram realizadas em temperatura ambiente 5x tampão SSC, tampões pré-aquecidos SSC (50 ° C), 5 min em 5x SSC, 2 x 5 min em SSC 1x, 2 × 5 min em 0,2 SSC, e 5 min em TA 0,2 x SSC. As secções foram bloqueadas contra a ligação não especifica no bloqueio solução da DIG lavar e buffer do bloco set (11 585 762 001, Roche, Mannheim, Alemanha) durante 15 minutos à temperatura ambiente numa câmara de humidade. A fosfatase alcalina (AP) anti -conjugated DIG (11 093 274 910, Roche, Mannheim, Alemanha) 1:800 foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente numa câmara de humidade para a detecção imunológica. Depois de PBS-T lavar as reacções enzimáticas substrato foi levada a cabo com NBT /BCIP (11 697 471 001, Roche, Mannheim, Alemanha) a 30 ° C no ThermoBrite durante 120 min. A reacção foi parada com uma lavagem de 2 minutos em tampão 5 × KTBT (50 nM Tris-HCl, 150 nM NaCl, KCl 10NM) seguido de lavagem em água destilada duas vezes. As secções foram contra-coradas com vermelho rápido nuclear (WALDECK, ZE-012-250) à temperatura ambiente durante 1 min e, em seguida, lavado em água da torneira. A desidratação foi realizada através do aumento gradientes de soluções de etanol e, finalmente, montagem com Histokitt meio de montagem (Assistente-Histokitt, 1025/250 Sondheim /Rhoen Alemanha).

Scoring de CISH

A análise das imagens foi realizada utilizando o sistema de imagem Ariol (Genetix, San Jose, EUA) compondo de um microscópio (Olympus BX 61) equipada com uma fase automática e carregador deslizante, em conjunto com uma câmara. Os núcleos foram fotografados usando 20x ampliações. A intensidade da coloração dominante em células tumorais epiteliais e do estroma tumoral circundante células foram pontuadas como; 0 = negativo, 1 = fraco, 2 = moderada e 3 = forte. Todas as amostras foram anônimas e marcou de forma independente por dois patologistas (ER e AV). Ao avaliar uma variável para um determinado núcleo, os observadores foram cegos para dezenas de outras variáveis ​​e para o resultado. A média de pontuação para cada caso foi calculado a partir de todos os quatro núcleos e ambos os examinadores. Em caso de desacordo (pontuação discrepância 1), as lâminas foram reexaminados e consenso foi alcançado pelos observadores

Métodos estatísticos

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico IBM. SPSS, versão 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) (S1). valores de pontuação de cada patologista foram comparados para a confiabilidade inter-observador pelo uso de um modelo de efeito aleatório de duas vias com a definição concordância absoluta. Um teste de classificação assinado Wilcoxon foi utilizado para avaliar se foi uma diferença estatisticamente significativa na expressão de miR-21 entre o tecido normal e tecido canceroso. Ao comparar os dois grupos de amostras (BF contra o grupo de não-BF) a partir dos resultados qPCR, foi utilizado o teste t de estudante em frente e verso. Para todo o grupo, testes qui-quadrado de Pearson e teste de Correlação de Spearman foram realizados para examinar a associação entre a expressão de miR-21 e marcadores clínico-patológicos. O método de Kaplan-Meyer foi usado para fazer lotes de BFFS e CFFS. test-log rank foi utilizado para testar a significância estatística. variáveis ​​significativas das análises univariadas foram ainda avaliadas na análise de sobrevida multivariada, utilizando um modelo de regressão backward stepwise Cox com uma probabilidade para a remoção de entrada gradual em 0,05 e 0,10, respectivamente. O nível de significância utilizado foi p 0,05 para todas as análises. Todos sobrevivência análises foram realizadas utilizando três finais diferentes pontos: (i) a sobrevida livre de falha bioquímica (BFFS), (ii) a sobrevida livre de falha clínica (CFFS), e (iii) a morte PC sobrevida livre (PCDF). BF foi caracterizado como um ng PSA≥0.4 /mL e subindo em um mínimo de duas amostras de sangue diferentes no pós-operatório. CF foi definida como progressão verificada locais sintomático e /ou metástase verificada ao osso, órgãos viscerais ou gânglios linfáticos no CT, MR, cintilografia óssea ou ultra-sonografia. PCDFC foi definida como morte causada por PC progressiva.

Resultados

Características dos pacientes e variáveis ​​clinicopatológicas

coorte total.

Uma visão geral do grupo de pacientes do características demográficas, clínicas e histopatológicas são apresentadas na Tabela 1. a média de idade no momento da cirurgia foi de 62 (intervalo 45-75). Os prostatectomies foram retropubic em 435 casos e perineal em 100 casos. No último acompanhamento, 170 pacientes tinham experimentado BF, 36 CF, e 15 pacientes estavam mortos de PC.

miRNA triagem subgrupo.

Nos 30 pacientes com Gleason score 7 submetidos miRNA rastreio, idade média era de 65 anos (intervalo de 57-71), a PSA mediana de 18,8 ng /mL (intervalo de 5-79), o tamanho médio do tumor 22 mm (intervalo de 3-45), 21% experimentaram FC e 14% estavam mortos da próstata Câncer. No grupo total de pacientes com Gleason 7 (n = 270), a idade média era de 62 (gama de 47-74), a mediana PSA 18,0 ng /mL (intervalo de 0,7-71), o tamanho médio do tumor 23 mm, 22% CF experiente e 9% estavam mortos de câncer de próstata. Nenhuma dessas diferenças foram estatisticamente significativas.

rastreio de microarray e qPCR validação

600 de 1435 miRNAs investigados por microarrays, teve expressão acima força fundo (sinal de fundo definida como 1,2 vezes a intensidade do 1 -quartile cada slide) (Tabela 2). Destes, 50 miARNs com o maior desvio padrão (DP) foram adicionalmente analisados. A partir de análises de microarray, um hierárquica 2D agrupamento mostrou um nel de express relativo de miARNs que estavam regulados positivamente em ambos os grupos (Figura 1a). Os níveis de expressão de 7 miARNs foram validados por RT-qPCR (Tabela 3, Figura 1a). Cinco dos sete miRNAs analisados ​​apresentaram tendência semelhante nos dois grupos. O diagrama de mapa de calor mostra o resultado da bidireccional agrupamento hierárquico do nível dos cinco miARNs expressão. O z-score foi recortada de -2 a +2 (Figura 1b). miR-21 foi o único miRNA que foi significativamente up-regulamentada do grupo BF. Isso foi em concordância com os resultados da matriz. Houve uma forte correlação entre a hibridação array e qRT-PCR.

a) os níveis de expressão relativa de 50 miRNAs que foram expressos em todas as 30 amostras de tecido combinado com escore de Gleason 7. O eixo X mostra os indivíduos ea eixo Y mostra miARNs. quadrados vermelhos codificar para up-regulada miRNAs e praças verdes codificam miRNAs regulados para baixo. b) os resultados mapa de calor do bidirecional agrupamento hierárquico baseado no qPCR resultados. Os miRNAs mostrou a mesma tendência na validação qPCR e na análise microarray. Os valores normalizados (DCP) foram utilizados para a análise. A cor vermelha representa um nível de expressão acima média, cor azul representa a expressão mais baixa do que a média.

A expressão de miR-21 e correlações na coorte

total de

Em geral, miR-21 foi expressa a um nível mais elevado em áreas do estroma do tumor do que em células epiteliais de tumor (Figura 2). A intensidade de miR-21 de expressão foi mais forte no citoplasma de tecido de tumor em comparação com os tecidos normais dos pacientes (p 0,001). Não houve diferença na expressão de miR-21 entre as células epiteliais tumorais e células epiteliais normais. Uma maior expressão significativa de miR-21 foi encontrada na área do estroma tumoral do que na área do estroma não neoplásicas (p 0,001). Ao comparar as células epiteliais tumorais com células do estroma do tumor, o miR-21 foi expressa em níveis mais elevados em células do estroma do tumor (p 0,001).

Foram encontradas correlações significativas entre a expressão do estroma tumoral elevada de miR-21 e pT-estágio (

r

= 0,134, p = 0,003), infiltração perineural (PNI) (

r

= 0,175, p 0,001) e infiltração vascular (

r

= 0,222 p 0,001). Encontramos uma correlação fraca entre a expressão do estroma de miR-21 e escore de Gleason (

r

= 0,218, p 0,001). Houve também correlações significativas entre a expressão do estroma de miR-21 e Gleason Score (GS); GS 7, GS 7 e GS 7 (r = 0,238, p 0,001).

Não houve diferenças na expressão do estroma de miR-21 entre os subgrupos de pontuação de Gleason, 3 + 4 (n = 220, 41%) e 4 + 3 (n = 80, 15%) (r = – 0,001, p = 0,991)

A análise univariada

As variáveis ​​clínico-patológicas pT-stage (. p 0,001), o valor de PSA pré-operatório dicotomizados a 10 ng /dL (n = 221, p 0,001), classificação de Gleason (p 0,001), o tamanho do tumor dicotomizados no 20 mm (n = 285, p 0,001), infiltração perineural (PNI) (no = 134, p 0,001), margens positivas cirúrgicos (PSM) (n = 286, p = 0,041), margem circunferencial positiva cirúrgico (n = 154, p 0,001), margem apical positiva cirúrgico (n = 210, p = 0,04), e infiltração vascular (n = 43, p 0,001) foram todos significativamente correlacionados com BFFS na sobrevivência univariada (Tabela 1)

a 4

th foi usada quartil. como ponto de corte. A alta expressão de miR-21 em áreas do estroma tumorais foi significativamente correlacionada com BF (n = 170, p = 0,006, Figura 3a) e CF (n = 36, p = 0,041, não figura mostrada.) Não houve correlação entre expressão alta de estroma de miR-21 e PCD (n = 14, p = 0,505).

b) pacientes com escore de Gleason 6.

Em análises de subgrupos, encontramos alta expressão do estroma de miR-21 a ser significativamente associados com o risco aumentado de BF em pacientes com GS 6 (n = 167, p = 0,023, Figura S3B), mas isso não foram encontrados para pacientes com GS 7 (n = 262, p = 0,228) , grau de Gleason 3 + 4 (n = 189, p = 0,0290, grau Gleason 4 + 3 (n = 73, p = 0,818) e GS . 7 (n = 36, p = 0,895) também encontramos alta estromal expressão correlacionada com a BF para os pacientes com margens positivas circunferenciais (n = 139, p = 0,026), mas não para aqueles com margens livres circunferenciais (n = 339, p = 0,107).

a análise multivariada

marcadores clínico-patológicos e moleculares significativas em comparação com análise univariada foram introduzidas no modelo multivariado. A Tabela 4 apresenta os fatores prognósticos independentes para BF; pT-fase (p = 0,001), Gleason de grau (p = 0,021), não-apical PSM (n = 286, p = 0,001), apical PSM (n = 210, p = 0,003). Para CF; Gleason grau (p = 0,013), PNI (n = 134, p = 0,028), não-apical PSM (p = 0,028).

expressão alta de estroma de miR-21 foi um fator prognóstico independente para BF em pacientes com Gleason score 6 (n = 167, HR 2,40, 95% CI 1,06-5,49, p = 0,037). A associação significativa entre a expressão alta de estroma de miR-21 e BF também foi encontrada no subgrupo de pacientes com PSM (HR 1,95, 95% CI 1,95-3,21, p = 0,008). No entanto, para toda a coorte (n = 471), houve apenas uma tendência para uma associação independente entre a expressão do estroma de miR-21 e BF (n = 170, p = 0,089). expressão alta de estroma de miR-21 não foi uma variável de prognóstico independente para CF (n = 36, p = 0,395).

Discussão

Neste estudo, verificou-se uma maior expressão de miR- 21 em tecidos de cancro comparativamente com o tecido prostático normal. A expressão foi maior em áreas do estroma tumorais. Alta tumor estromal expressão de miR-21 foi um fator prognóstico independente para falha bioquímica em pacientes com Gleason grau 6, mas não falha clínica, provavelmente devido a alguns eventos no último grupo. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo relatando a expressão do estroma tumoral de miR-21 como um marcador de prognóstico para BF após a prostatectomia radical. Além disso, também encontramos uma expressão elevada do estroma para ser um marcador independente de PSM em amostras de RP.

Estudos recentes têm mostrado que os miRNAs são significativamente alterada no cancro da próstata, sugerindo que miRNAs atuam como reguladores-chave da carcinogênese de próstata. Vários estudos foram realizados para identificar a assinatura miARN específico para PC, mas n consenso foi alcançado no que diz respeito ao papel miARNs no desenvolvimento e progressão de PC [20], [21]. Em um estudo realizado por Violinia et al. [22], o ARN total foi extraído a partir de 363 cancros sólidos, incluindo o cancro da próstata, e 177 os tecidos normais. Eles encontraram um aumento da regulação geral de 39 miRNAs, incluindo miR-21, enquanto que 6 miRNAs foram regulados negativamente. Estes resultados estão de acordo parcial com um estudo realizado por Ambs et al. em que ARN total extraído de 60 micro-dissecadas PC e 16 circundantes tecidos não tumorais foram analisadas [23]. MiR-21 é geralmente considerado um oncogene, mas até agora o seu papel no PC não é clara e os relatórios têm sido conflitantes [11], [12], [14], [20]. miR-21 foi encontrado para ser elevados em linhas celulares PC3 independente de androgénios e DU145 [24]. Além disso, o miR-21 foi identificado como um receptor de androgénio miARN-regulado, cujo nível foi elevada em comparação com a de PC tecido normal adjacente [12]. Inibições de miR-21 diminui a proliferação das células PC induzida por andrógeno, enquanto que a expressão elevada de miR-21 promove um crescimento do tumor e resistência à castração

em

vivo

[12]. Outros também têm encontrado miR-21-regulada em pacientes com PC hormonas e resistente à quimioterapia [13], [15].

Nós descobrimos que uma expressão do estroma tumoral elevada de miR-21 em tumores com Gleason score 6 previu BF. Isto está de acordo com os relatórios anteriores [25]. Estromal miR-21 análise de expressão pode ser uma ferramenta potencial para prever quais os tumores altamente diferenciados que é mais provável para o progresso. Estudos recentes têm fornecido informações valiosas no esclarecimento da involment de miR-21 no microambiente do tumor: Bullock et al. [26] demonstraram que regulada positivamente miR-21 expressão ocorre em células do estroma associadas a cancro mas não em células de cancro colo-rectal. Além disso, eles descobriram que a expressão ectópica de miR-21 em fibroblastos modulado o impacto citotóxico da Oxaliplatina (chemotherapheutic utilizado no tratamento de cancro do cólon), o que resultou na progressão do cancro. Bronisz et ai. [27] demonstraram que a regulação negativa de miR-320 em fibroblastos do estroma mamárias reprograma o microambiente do tumor por activação de um pró-secretoma oncogénica e, curiosamente, Yao et al. [28] relataram que miofibroblastos transdiferenciação de fibroblastos de progenitoras em resposta a TGF-β poderia ser evitada utilizando inibidores anti-sentido específicos de miR-21. Em conjunto, estes dados sugerem influência pró-metastática de ARNm na diferenciação de fibroblastos e fenótipo, e que o miR-21 pode ser mediada através do microambiente do tumor. No entanto, provas biológicas e funcional para apoiar estas conclusões, especialmente carcinomas da próstata, é limitada.

é bem conhecido que menos do que 3% dos pacientes com Gleason score≤6 nunca se vai progredir ou não tratados, e que uma percentagem substancial destes pacientes continuam a sofrer tratamentos desnecessários após um diagnóstico de PC baixo risco (com base em um PSA 10 ng /mL e ≤ fase T2a) [29], [30]. Estromal miR-21 análise de expressão pode ser uma ferramenta potencial para prever quais os tumores altamente diferenciados que é mais provável para o progresso. Mais estudos para esclarecer o papel exacto de miR-21 nestes tumores altamente diferenciados são necessários. Em contraste com os relatórios anteriores, verificou-se alta expressão de miR-21 em pacientes com margens cirúrgicas positivas, [25]. Os mecanismos moleculares para isso são desconhecidas.

Os resultados divergentes de miR-21 em diferentes estudos pode refletir a heterogeneidade do PC, bem como desenho do estudo e metodologia. A triagem miRNA de toda a coorte teria fortalecido o nosso estudo. Além disso, a qualidade dos tecidos examinados (incluindo o manuseamento) pode afetar drasticamente a interpretação dos dados de microarranjos. Além dos dados interessantes sobre BF, nosso estudo é um pouco limitada pelo baixo número de casos com recidiva clínica ou PCD. Mais estudos deste microRNA e suas vias associadas podem descobrir novos mecanismos de progressão do câncer e intervenção terapêutica.

Conclusão

Este estudo sobre miRNA perfil e validação no cancro da próstata aumenta ainda mais evidência para miR-21 como um marcador de prognóstico para PC. Estes resultados indicam que a expressão do estroma de miR-21 tem um papel importante na progressão da doença, mas o mecanismo subjacente precisa de uma investigação mais aprofundada.

Informações de Suporte

arquivo S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0113039.s001

(ZIP)

Reconhecimentos

Agradecemos aos participantes técnicos de laboratório do Departamento de Patologia da UNN por seu apoio e habilidades técnicas. Especialmente queremos agradecer Magnus Persson, Mona Pedersen e Marit Nina Nilsen, Christopher Fenton, Øystein Størkersen e Anders Angelsen.