camundongo transgênico e ratos são geneticamente modificados cujos genomas são alteradas pelo uso de técnicas de engenharia genética. ratinhos geneticamente modificados são geralmente usados para a investigação ou como modelos animais de doenças humanas. Como é que os cientistas fazem esses animais transgênicos? De um modo geral, em primeiro lugar, os investigadores necessitam de construir um transgene a um promotor e um gene estrutural. Em seguida, o DNA é preparado e microinjeção em ovos de ratinho fertilizados, e mais tarde os ratinhos transgénicos ou ratos nascem. As seguintes passagens oferecer uma breve descrição dos passos necessários para obter camundongos transgênicos ou ratos transgênicos.
1. Planejar e preparar o Experimento
É preciso deixar claro que o que a finalidade é. Em seguida, ele precisa obter ou clonar o promotor desejado e gene estrutural e para estabelecer um ensaio de expressão genética para a pesquisa específica. A expressão de alguns genes irão ser deletéria ou incompatíveis com o crescimento e desenvolvimento do embrião. A expressão de um transgene requer que os elementos de controlo da transcrição apropriados, ser incluídos na estrutura de ADN. Estudos preliminares em culturas de células pode ser contactado para verificar a integridade da construção e da função do promotor.
2. Clone e verificar a integridade da Transgene
Várias coisas devem ser consideradas durante a clonagem. O transgene deve conter marcadores exclusivos, de modo que a sua presença pode ser facilmente detectado em amostras de DNA de tecidos de rato e a sua expressão pode ser ensaiada e distinguida de expressão do gene endógeno. A sequenciação dos fragmentos de junção devem ser realizados para confirmar que o transgene tem um promotor funcional, codão de iniciação, e sinal de poliadenilação. Sob as melhores circunstâncias, o transgene deve ser testado para a expressão em um sistema de cultura celular antes de ratinhos transgénicos são feitos.
3. Estabelecer um método de triagem
ensaio A PCR é altamente recomendado para identificar transgênicos animais. Antes de apresentar a ADN para micro-injecção em ovos fertilizados de ratinho ou de rato, deve-se preparar um ensaio de transferência de Southern ou PCR utilizado para detectar o transgene quando é cravada no ADN da cauda a uma concentração de uma cópia. Um segundo ensaio para detectar um gene endógeno de rato ou um rato do gene endógeno é necessária para demonstrar que as preparações de DNA são livres de inibidores de PCR. Os animais devem ser testados com ambos os ensaios para que nenhum fundador transgênica é erroneamente descartado porque o DNA da cauda está contaminado com inibidores da PCR.
4. Estabelecer um Expression Assay
Uma abordagem pode utilizar RT-PCR , a expressão do RNA por hibridação in situ ou análise de protecção de ARNase com sondas de ARN para conseguir a expressão do transgene. A proteína a ser produzido tem de ser diferente de proteínas normalmente expressas no ratinho. Existem várias maneiras de conseguir isso e pode-se usar um gene repórter, como uma proteína fluorescente para visualizar o processo diretamente.
5. Purificação de DNA e microinjeção.
kit extrato de DNA é recomendado para a purificação de DNA microinjeção. Mas, se se quiser utilizar grandes fragmentos de ADN, há um protocolo específico para a preparação do DNA de BAC para microinjecção. Numerosas publicações mostram que BACs contendo sequências do vector procarióticas são expressos em níveis fisiológicos em ratinhos transgénicos. Ao contrário de transgenes com base plasmídeo, remoção de sequências de vector em não necessárias para transgenes BAC. construções transgénicas são então quantificados e microinjeção em óvulos de camundongos e cirurgicamente transferidos para destinatários.
6. Southern Análise
A análise de transferência de Southern 6 semanas de idade deve ser feito para determinar quantas cópias do transgene locais integrados, e quantas cromossômicas o transgene inseridos, e também para verificar o estado de transgênicos e determinar se o transgene está intacta. Essas informações são necessárias para se certificar de que os fundadores transgénicos com uma boa chance de transmissão de um transgene intacto em um único local de inserção pode ser selecionado para criação intensiva.