Sumário
pâncreas e duodenal homeobox-1 (PDX-1) é um fator de transcrição que regula a expressão de insulina e manutenção ilhota no pâncreas adultos. Nossos estudos recentes demonstram que PDX-1 é um oncogene para câncer de pâncreas e é sobre-expressos em câncer de pâncreas. O objectivo deste estudo foi demonstrar que a PDX-1 é um alvo terapêutico para ambos os sintomas hormonais e o volume do tumor em modelos de ratinho de cancro do pâncreas, insulinoma e neoplasia das ilhotas. A imuno-histoquímica de espécimes pancreáticas e neoplasia ilhéus humanos reveladas marcado PDX-1 sobre-expressão, sugerindo PDX-1 como um alvo “drugable” dentro destas doenças. Para fazê-lo, uma plataforma romance efectora interferência de ARN, bifuncional shRNA
PDX-1, foi desenvolvido e estudados em linhas celulares de ratinho e humanos, bem como em modelos de ratinho de cancro do pâncreas, insulinoma e neoplasia das ilhotas. entrega sistémica de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes resultou em acentuada redução do volume do tumor e melhorou a sobrevivência em um modelo de rato pancreático humano xenoenxerto de cancro. bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes impediu a morte de hiperinsulinemia e hipoglicemia em um modelo de rato insulinoma. shRNA
mousePDX-1 lipoplexes revertida hiperinsulinemia e hipoglicemia em um modelo de rato imuno-competente de neoplasia ilhotas. PDX-1 foi sobre-expresso em tumores neuroendócrinos pancreáticos e nesidioblastose. Estes dados demonstram que a terapia com PDX-1 ARNi controla sintomas hormonais e o volume do tumor em modelos de ratinho de cancro do pâncreas, insulinoma e neoplasia ilhota, por conseguinte, PDX-1 é um potencial alvo terapêutico para estas doenças pancreáticas
citação.: Liu SH, Rao DD, J Nemunaitis, Senzer N, Zhou L, D Dawson, et al. (2012) PDX-1 é um alvo terapêutico para o cancro do pâncreas, Insulinoma e Ilhota Neoplasia usando uma plataforma de RNA Interferência Novel. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10.1371 /journal.pone.0040452
Autor: John J. Rossi, Instituto de Pesquisas Beckman do City of Hope, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de maio de 2012; Aceito: 07 de junho de 2012; Publicação: 08 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela subvenção R01-DK46441 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e renais; concessão R01-CA095731 do Instituto Nacional do Câncer; a Fundação Alkek; a Fundação Vivian L. Smith; a Fundação MD Anderson; ea generosidade da família Bill e Olivia Heintz. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. D. Rao, N. Senzer, Z. Wang e N. Templeton são empregados por gradalis, Inc. Os seguintes autores são acionistas gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, D. J. e Rao Nemunaitis. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
pâncreas e duodenal homeobox-1 (PDX -1) é um factor de transcrição que desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento embriológicos pâncreas, assim como na expressão de insulina e de manutenção dos ilhéus pancreáticos adultos [1], [2], [3], [4]. PDX-1 knockout é letal em ratinhos e mutação de PDX-1 conduz a amadurecer aparecimento de diabetes dos jovens (MODY subtipo IV) em ratos e em doentes humanos [5], [6]. a sobre-expressão persistente de PDX-1 leva a acinar ductal para metaplasia de células em ratinhos [7]. A sobre-expressão de PDX-1 em linhas celulares resulta na transformação de células não produtoras de insulina nas células produtoras de insulina após a GLP-1 estímulo [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 é bem conhecido como um regulador essencial de muitos genes endócrinas pancreáticas, como a insulina [1], [2], [3], [4], glucoquinase [14], polipéptido ilhota amilóide [15], [16], [17], de glicose tipo transportador 2 [GLUT2] [18], [19], polipéptido pancreático [20] e somatostatina [21], [22], e, por conseguinte, tem um papel crítico na manutenção da homeostase da glucose.
Os nossos estudos recentes demonstram que a PDX-1 é um oncogene [23], [24]. Ele é marcadamente sobre-expressos em câncer pancreático [23], [25], [26], [27] e regula a proliferação e invasão das células cancerosas pancreáticas humanas
in vitro
e
in vivo
em ratos [23]. PDX-1 sobre-expressão nas células benignas e malignas resultou num aumento da formação de tumor quando estas células são implantadas em ratinhos [24]. entrega sistémica de shRNA
humanPDX-1 lipoplexes resultou em uma acentuada redução do volume tumoral e prolonga a sobrevivência num modelo de ratinho de xenoenxerto de cancro pancreático humano [23].
A nossa equipa desenvolveu uma plataforma nova interferência de RNA bifuncional em que a tradução do mRNA alvo é reprimido através de ambos e dependente de clivagem independente de clivagem-RISC caminhos de carga, resultando em diferencial Argonaut incorporação e separados, mas coordenado, alvo mecanismos de inactivação [28].
neste estudo, um romance ARNi plataforma efectora segmentação PDX-1 foi desenvolvido e estudados em linhas celulares humanas e de ratinho, bem como em modelos de ratinho de cancro do pâncreas, insulinoma e neoplasias da ilhota para determinar se PDX-1 é um potencial alvo terapêutico para o controle de ambos hormonal sintomas e volume do tumor nestas doenças pancreáticas.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
SCID foram alojados em uma instalação BL-4 e cuidadas em conformidade com as directrizes em
o Cuidado e Uso de Animais de laboratório
preparado pelo Institute of Laboratory animal Resources, a Comissão de Ciências da vida, o Conselho Nacional de Pesquisa e da Comissão de Pesquisa animal da Baylor College of Medicine. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Baylor College of Medicine. (Número de autorização: AN 2404)
amostras humanas foram recebidos ao abrigo de um protocolo humano que foi aprovado pelo Institutional Review Board ( IRB), do Baylor College of Medicine (Permit Number: H 14054); espécimes foram processados estritamente de acordo com os procedimentos ditados pelo dito protocolo. Todas as amostras de tumor neuroendócrino e Nesidioblastose pancreáticos humanos foram amostras obtidas com o consentimento IRB (H 14054) de-identificado e informado consentimento por escrito.
As linhas celulares, vectores e anticorpos
Mouse βTC-6 e linha celular de cancro pancreático PANC-1 linhas de células humanas foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) e previamente relatada [29]. espécimes de tumor neuroendócrino pancreático humano e amostras Nesidioblastose humanos foram gentilmente cedidas pelo Dr. David Dawson, do Departamento de Patologia da UCLA e Dr. Milton Finegold, do Departamento de Patologia do Hospital Infantil do Texas, respectivamente. Rato PDX-1 shRNA (shRNA
mousePDX-1) foi concebido tal como previamente descrito [23]. ratinho bi-funcional (bi-shRNA
mousePDX-1) humana e PDX-1 (bi-shRNA
humanPDX-1) foram obtidas a partir de gradalis Inc (Dallas, TX). PRIP-mCherry_CMV-eGFP e PRIP-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA
mousePDX-1 foram subclonados com base no vector pai RIP-mCherry-NLS-mCherry que foi fornecida pelo Dr. Michael Mancini do Baylor College of Medicine. De cabra anti-coelho, anti-soro e de ovelha anti-ratinho anti-soro conjugado com peroxidase de rábano silvestre foram adquiridos da Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). IgG de coelho anti-cabra foi obtido a partir de ZYMED (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, EUA).
A transfecção e ensaio de repórter
β TC-6 ou PANC-1 era células plaqueadas em placas de cultura celular de 10 cm a 1 x 10
6 células por placa ou placas de 24 poços a 1 × 10
5 células /poço e incubadas a 37 ° C durante 24 h. ensaios de transfecção foram realizadas utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. sinais de fluorescência foram observados e contados utilizando microscopia de fluorescência como anteriormente descrito [23] para determinar as actividades repórter
ensaio de proliferação celular.
In vitro
A proliferação celular foi determinada pela MTS ensaio (Promega, Madison, WI) e incorporar BrdU ensaio (colorimétrica) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Alemanha) a 12, 24, 48 e 72 h após a transfecção. A absorvância foi lida num leitor de placas Multiskan EX (Thermo Electronic Corp., Franklin, MA) a 492 nm para o MTS e 500 nm para ensaio de BrdU e os níveis de proliferação foram calculados como descrito anteriormente.
análises Western blot
Quarenta e oito horas após a transfecção, como descrito anteriormente [23], βTC-6 células foram colhidas e lisadas em tampão RIPA. Vinte (20) ug de lisados de células foram aplicadas a gel de SDS-PAGE para a electroforese. A proteína foi então transferida para membranas de ser sondado com anticorpos contra vários PDX-1, ciclina D1, ciclina E, Cdk2, Cdk4, e p27. Imunocomplexos foram visualizadas por quimioluminescência aumentada (ECL) detecção utilizando peroxidase conjugada anticorpos secundários.
Animais e shRNA entrega
SCID foram alojados em uma instalação BL-4 e tratados em conformidade com o orientações em
o Cuidado e Uso de Animais de laboratório
preparado pelo Institute of Laboratory animal Resources, a Comissão de Ciências da vida, o Conselho Nacional de Pesquisa e da Comissão de Pesquisa animal da Baylor College of Medicine. As dosagens de ADN foram determinadas por satisfaz os critérios de morte do rato inferior a 10% após a injecção de lipossomas shRNA complexo em ratinhos SCID regulares. camundongos machos, com idade de 8 a 10 semanas de idade, foram inoculados com 1 × 10
6 beta TC-6 ou PANC-1 células por rato via intraperitoneal (ip). Duas semanas mais tarde, tanto ratos TC-6 ou PANC-1 beta foram agrupados aleatoriamente (30 ratos por grupo) e do primeiro ciclo do shRNA
mousePDX-1 ou bi-shRNA
mousePDX-1 ou bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente, foram dadas através de injecção na veia da cauda. Os ciclos foram repetidos nos dias 14 e 28 para um total de três injecções. O mesmo protocolo foi aplicado a SSTR
1/5
– /- ratos utilizando 3 ciclos de 35 ug de shRNA
mousePDX-1. Os lipoplexos shRNA foram preparadas como descrito anteriormente [23].
insulina e glicose medições
Nos dias 7, 21, 35 e 120 após cada entrega gene, 50 ul amostras de sangue total foram coletadas e centrifugada para separar o soro. Os níveis de glucose foram medidos utilizando um Beckman Coulter-Analisador de Glicose 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), e apresentados como a média ± S.E.M. em mg /dl. Os níveis de insulina foram determinados utilizando um kit de ELISA de insulina de rato a partir de Mercodia (Linco Research, St Charles, MO) e apresentados como a média ± S.E.M. . Em mg /l
Glucose Intraperitoneal Tolerance Test (IPGTT)
SSTR
1/5
– /- ratos nos dias 7 e 150 após a entrega inicial de shRNA
mousePDX-1 foram mantidos em jejum durante a noite antes da coleta de amostras de sangue como T
0. ratinhos agrupados foram então dado 1,2 g de glicose /kg de peso corporal através de injecção ip seguido de recolha de amostras de sangue aos 15, 30, 60, e 120 minutos após a injecção de glicose. Os níveis de glicose e insulina foram medidos como descrito acima.
amostras de tumor neuroendócrino e Nesidioblastose pancreáticos humanos Necropsia, coleta de tecido, imunohistoquímica e TUNEL ensaio
De-identificados foram obtidas do Dr. David Dawson e de Dr. William Fisher para IHC. pâncreas rato, ilhotas e amostras de tecido tumoral foram obtidos nos dias 0, 7, 21, 35, e tempo de término após o parto gene inicial. tumores peritoneais foram macro e microscopicamente avaliados eo maior (A) e menores diâmetros (B) medidos e registados. O volume do tumor (V; um elipsóide de rotação) foi calculada de acordo com a fórmula: V (mm
3) = A (mm) x B
2 (mm)
2/2. O volume total do tumor foi calculado, colocando todos os tumores juntos. Os ratinhos foram pontuados de acordo com a presença ou a ausência de tumores. O IHC foi realizada como descrito anteriormente. Anti PDX-1, insulina, PP, ciclina E, p27, anticorpos Cdk4 ou PCNA foram aplicadas a slides com 1:100 diluição seguido por incubação durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram incubadas com anti-coelho ou Cy3 conjugado com FITC, de cabra ou um anticorpo secundário de rato de acordo com a derivação de anticorpos primários durante uma hora, e montado com tampa desliza. TUNEL ensaio (ADN A fragmentação FragEL ™ Detection Kit, colorimétrico enzimático-TdT, Calbiochem, La Jolla, CA) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A taxa de apoptose foi expressa como a razão entre células cancerosas apoptóticos para o número total de células endoteliais em 10 campos de 100 × ampliação.
Análise estatística
de Student desemparelhado
t
-test foi utilizado para análises estatísticas dos níveis de glicose, os níveis de insulina e proliferação celular com
P Art 0,05, indicando significância. A χ
2 teste foi utilizado para comparação de taxa. Rank-log foi usado para comparação ratos sobrevivência. Kaplan-Meier em SPSS 15.0 para MS Windows foi usado para traçar as curvas de sobrevida.
Resultados
PDX-1 é abundante em amostras humanas de tumores neuroendócrinos do pâncreas e nesidioblastose, bem como células de rato insulinoma e um modelo de rato ilhéu hiperplasia transgênica
PDX-1 foi sobre-expresso em 36 espécimes pancreáticas e neoplasia ilhotas humanos incluindo 26 tumores neuroendócrinos do pâncreas (Fig. 1a) e 10 espécimes nesidioblastose (Fig. 1b). PDX-1 foi também sobre-expressa em células de insulinoma de rato (TC-6 P) (Fig. 1C) e em ambas as dos ilhéus e células acinares do pâncreas de subtipos de receptores da somatostatina 1 e 5 ratinhos knock-out (SSTR
1/5
– /-.) (Figura 1E, F, respectivamente), em comparação com a dos ratinhos de tipo selvagem (Figura 1D).. Estes dados demonstram que a PDX-1 é significativamente sobre-expresso em ambos pancreático tumores neuroendócrinos, e nesiodioblastosis ilhota de rato neoplasia humana, sugerindo que é um alvo potencial para estas doenças.
A imunocoloração com anti-PDX-1 demonstra sobre-expressão do anticorpo PDX-1 em espécimes ilhota neoplasias humanas (26 tumores neuroendócrinos pancreáticos (a), 10 espécimes nesidioblastose (b), βTC-6 tumores (C) e 6 amostras de pâncreas de SSTR1 /5
– /- ratos (e, F .) PDX-1 é sobre-expressa em ambas as ilhotas (e) e células acinares (F) de SSTR1 /5
– /- ratos quando comparada com a dos ratinhos de tipo selvagem em que apenas as células dos ilhéus expressas PDX-1 (d). PDX-1 positivo é indicado pela seta (× 200).
Segmentação PDX-1 com bi-shRNA
humanPDX-1 controla o volume do tumor em um ser humano de pâncreas de xenoenxerto de cancro modelo do rato
In vitro
estudos.
uma vez que as células PANC-1 são células cancerosas pancreáticas humanas que marcadamente superexpressam PDX-1, estas células foram utilizadas tanto para
in vitro
e
in vivo
estudos. bi-shRNA
humanPDX-1 transfecção de células PANC-1 resultou em knock down do PDX-1. Isto foi associado com a redução da proliferação celular em 58%, 40% e 38% em relação ao controle de vetores vazios em 24, 48 e 72 h pós-transfecção, respectivamente. Houve uma maior inibição da proliferação de células do que a observada com shRNA
humanPDX-1 no 0,6 ug e 1,2 ug de doses médias /ml (Fig. 2a, 2b), dirigindo-se a vantagem potencial de shRNA bi-
humanPDX- 1 na terapia ARNi para cancros pancreáticos.
ensaio MTS mostrou o curso de tempo da proliferação celular para PANC-1 (a) células transfectadas com bi-shRNA
mousePDX-1 e bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente. Uma comparação das percentagens de inibição de proliferação celular entre bi-shRNA e transfecção shRNA em doses diferentes é mostrado em células PANC-1 (b).
In vivo
estudos.
num modelo de ratinho SCID PANC-1 xenoenxerto foi desenvolvida e bem estudada no nosso laboratório; quando colocado por via intraperitoneal em ratinhos SCID, células PANC-1 cresceram em grandes tumores no prazo de dois meses. Duas semanas após a implantação das células, três ciclos de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos (35 ug /ratinho, administrado por via intravenosa no dia zero, 14 e 28) reduziu significativamente o volume do tumor PANC-1, com apenas alguns ratinhos tendo tumores residuais média de 51 mm
3, em comparação a 100% do controle camundongos com tumores com média de 1199 mm
3 a 90 dias após o tratamento (p 0,05, Fig. 3a). Sobrevivência no grupo de tratamento foi significativamente maior do que os controles (115 ± 9.5d vs 85 ± 1.4D, respectivamente, (p = 0,001; A Fig. 3b), sem diferença significativa na sobrevida entre os ratinhos tratados com vetor vazias e ratos não tratados (85 ± 9d vs 76 ± 8d, p = 0,981). Nestas ratinhos com tumores residuais, tumor de PDX-1 foi significativamente reduzida de 95 ± 11,1% para 12 ± 1,3% no dia 0 e 90 pós-tratamento, respectivamente (Fig. 3c painel superior). análise IHC de tumores residuais revelou diminuição da expressão de marcadores de proliferação celular, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e ciclina e, (de 84 ± 9,6% para 15 ± 0,8% e de 66 ± 10,2% para 9 ± 2,3% , respectivamente;.. a Fig. 3c 2
º e 3
painéis rd), e um aumento na expressão P53 (Fig 3c 4
th painel) apoptose Marcado foi visto em tumores residuais no dia 90 pós- o tratamento, sugerindo que os tumores residuais foram compostos de células apoptóticas que carecem de PDX-1. (Fig. painel inferior 3c). Notavelmente, três ciclos de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos não teve efeito sobre os níveis de glicose e de insulina sistémicos , sublinhando a importância do desenho específico da espécie de PDX-1 RNAi (Fig. S1).
O volume do tumor foi avaliada e comparada aos 90 e 120 dias após o tratamento inicial entre os grupos de tratamento e de controlo (a). As taxas de sobrevivência de ratinhos que receberam tratamento e dos que receberam o controlo de vector vazio foram analisados usando Kaplan-Meier em SPSS (b). A imunocoloração para slides tumorais com PDX-1, PCNA, ciclina E, e p53, bem como ensaio TUNEL foram realizadas e analisadas (c). A positiva para cada marcador é indicado pela seta (200 ×).
Estes dados demonstram que vários ciclos de sistémica bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos foram bem tolerado e reduziu o cancro pancreático humano eficazmente o volume do tumor e a sobrevivência prolongada em ratinhos SCID. Estes dados demonstram que PDX-1 é um alvo potencial usando esta plataforma terapêutica inovadora para a forma mais agressiva de neoplasia pancreática.
Secreção
Segmentação PDX-1 com bi-shRNA
mousePDX-1 controles excessiva de insulina a partir de células de rato insulinoma e em um modelo de rato com insulinoma
In vitro
estudos.
bi-shRNA
mousePDX-1 resultou em maior knockdown de PDX- uma expressão em beta TC-6 células em doses de 0,6 ug e 1,2 ug /ml de meio de shRNA
controlos vector vazio em ambos western blot mousePDX-1 e (Figura 4-a;. p 0,05) e imuno-histoquímica (IHC) analisa (Fig. painel superior 4b).
a comparação da eficácia de bi-shRNA
mousePDX-1, shRNA
mousePDX-1 ou vector vazio na inibição do PDX-1 expressão em β TC-6 células é mostrada utilizando western blot (a) e imunocoloração de células (painel superior, b como indicado pela seta). expressão de insulina e de glucose estimulada em resposta a secreção de knockdown de PDX-1 é mostrado por imunocoloração de células (painel inferior, b, tal como indicado pela seta) (x 200) e ensaio de ELISA (d), respectivamente. Cada experiência foi repetida cinco vezes. expressão PDX-1 e de insulina em p imunologicamente TC-6 células são quantificados (c). PDX-1 expressão afetou a expressão repórter dirigiu-RIP (RIP-mCherry) em células βTC-6 (E e F). As células que expressam mCherry (vermelho) e GFP (verde) foram visualizadas e fotografadas utilizando microscopia de fluorescência (E e F). (× 200).
bi-shRNA
mousePDX-1 resultou em maior inibição da expressão de insulina e PDX-1 expressão do que a observada com shRNA
mousePDX-1 e vazio vector as células de controlo, respectivamente (Figura 4C, p . 0,05; e a Fig 4b.). A transfecção com bi-shRNA
mousePDX-1 resultou numa inibição significativamente maior da secreção de insulina estimulada por glicose desde β TC-6 células
in vitro
comparada com a observada com shRNA
mousePDX-1 e vazia controlos vectorial a concentrações de glucose de 5 mM e 11 (p 0,05), respectivamente (Fig 4d.). Estes resultados indicam que bi-shRNA
mousePDX-1 inibe a expressão e secreção de insulina através do PDX-1 knockdown, e fazê-lo a um grau maior do que shRNA convencional
mousePDX-1 em células de rato insulinoma.
Para delinear mais o mecanismo pelo qual knockdown do PDX-1 inibe a expressão e secreção de insulina através da ativação reduzida de insulina de rato promotor-1 (RIP), o repórter constrói (RIP-mCherry) com ou sem shRNA
mousePDX-1 foram transfectadas em células beta TC-6. PIR-mCherry-H1-shRNA
mousePDX-1 resultou numa redução significativa na expressão mCherry quando comparada com a de RIP-mCherry sem shRNA
mousePDX-1 (10 ± 1,6% vs 35 ± 8.1% e 12 ± 2.1 % vs 66 ± 13,2% às 24 h e 48 h, respectivamente, p 0,05; Fig. 4E). A transfecção de RIP-mCherry-CMV-EGFP-H1 revelou que 90% das células foram transfectadas com sucesso, tal como evidenciado pela expressão eGFP. Adicionalmente, 69% das células que expressam eGFP-expressa mCherry, e em PIR-mCherry-CMV-EGFP-H1-shRNA
mousePDX-1 transfectadas, 88% das células expressaram EGFP; No entanto, apenas 12% das células expressaram mCherry (p 0,05; Fig. 4F). Diminuição da expressão de PDX-1 foi confirmada utilizando Western blot. Estes dados sugerem que a ativação do promotor de insulina é significativamente inibida por shRNA
mousePDX-1 via knockdown do PDX-1 expressão.
A transfecção com bi-shRNA
mousePDX-1 em β TC-6 células resultou na supressão significativa da proliferação celular utilizando dois ensaio diferente: o ensaio MTS revelou reduções de 52%, 38%, e 31% versus os controlos vector vazio em 24, 48, e 72 h pós-transfecção, respectivamente (Figura 5a). , e o ensaio de incorporação de BrdU revelaram reduções de 42%, 35%, e 42% aos 12, 24, e 48 h pós-transfecção, respectivamente, (figura 5B.) (P 0,05 em todos os pontos de tempo). bi-shRNA
mousePDX-1 resultou na maior inibição da proliferação de células do que shRNA
mousePDX-1 em doses baixas (6 ug /10 cm de prato) após 48 h de transfeco (Fig. 5c). análise de proteínas de ciclo celular demonstrou uma maior diminuição da regulação de reguladores positivos, ciclina E, Cdk2 e Cdk4, e a sobre-regulação de reguladores negativos, p53 e p27, em bi-shRNA
mousePDX-1-células tratadas em comparação com a de controle de vetores vazios (p 0,05; Fig. 5d). Estes dados demonstram que a PDX-1 knockdown inibe a proliferação de células de insulinoma de rato através de alterações nas proteínas de ciclo celular.
ensaio MTS mostrou o curso de tempo da proliferação celular para β TC-6 (a) células transfectadas com bi-shRNA
mousePDX-1 e bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente. Uma comparação das percentagens de inibição da proliferação celular entre bi-shRNA e transfecção shRNA em doses diferentes é mostrado nas células beta TC-6 (b). A proliferação celular determinada por BrdU é também mostrada (C). A análise de Western blot de lisado de 20 ug de p as células CT-6 que foram transfectadas com shRNAi
mousePDX-1 após 48 h foi realizada com anti-PDX-1, ciclina E, Cdk2, Cdk4, p53 e p27 (d).
In vivo
estudos.
Anteriormente, nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato insulinoma letal, que tem sido bem estudada. SCID são implantados com células de insulinoma de rato e sucumbir à hiperinsulinemia e hipoglicemia em aproximadamente 60 dias. Neste modelo de rato, três ciclos de ambos os intravenosa bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (25 ug /rato quinzenal) ou shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /rato quinzenal) impediu a morte de hiperinsulinemia e hipoglicemia ( A Fig. 6a e b, e c e d, respectivamente). hiperglicemia transitória e hipoinsulinemia foram observados, mas os níveis retornou ao normal no dia 150 após o tratamento inicial em ambos os grupos de tratamento. No grupo de controlo, lipoplexos vector vazio tinha nenhum efeito sobre a hiperinsulinemia e hipoglicemia letal, como mostrado na Fig. 6a e b.
Os níveis de glicose A e C correspondendo a níveis de insulina B e D foram adquiridos a partir da β TC-6 ratinhos tratados com bi-shRNAi
mousePDX-1 ou shRNAi
mousePDX-1 , respectivamente. Em cada figura a-d, a linha do traço representa dados grupo de controle ea linha traço-ponto representa dados do grupo de tratamento. as células das ilhotas que expressam PDX-1, insulina, PP, PCNA, p27, CDK4 e ciclina E foram mostrados por IHC e apoptose das células dos ilhéus foi demonstrado por ensaio de TUNEL, como indicado pelas setas (200 ×) (e). sobrevivência do ratinho, após três ciclos de tratamento de um ou outro vector vazio ou bi-shRNAi
mousePDX-1 e vector vazio ou shRNAi
mousePDX-1 foi avaliada e comparada usando Kaplan-Meier em SPSS (f).
a sobrevida global na bi-shRNA
mousePDX-1 e shRNA
mousePDX-1 grupos de tratamento foi significativamente maior do que a dos controles (106 ± 7.8d vs 53 ± 1.4d e 146 ± 9.5d vs 53 ± 1.4d, respectivamente, p 0,05 vs controlos, Figura 6f, Fig S2)… É de notar que a pequena diferença na sobrevivência entre os dois grupos de tratamento foi devido ao sacrifício intencional do bi-shRNA
mousePDX-1 grupo de ratinhos, a um ponto de tempo anterior (Fig. S2F). Estes dados demonstram que PDX-1 knockdown usando sistêmicas bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes efetivamente impede hyperinsulinemic morte, hipoglicemiante em um modelo de rato SCID insulinoma; portanto, os tratamentos controlar a secreção hormonal excessiva associada com este tipo de neoplasia ilhotas.
Notavelmente, sistêmica bi-shRNA
mousePDX-1 e shRNA
mousePDX-1 lipoplexes resultar em hiperglicemia temporais, o que representa um previsível efeito fora do alvo em ilhotas de ratinho, uma vez que PDX-1 é o regulador de expressão predominante à insulina. Após o tratamento com bi-shRNA
mousePDX-1,
In situ
ilhota PDX-1 expressão foi reduzido de um modo dependente-tratamento, a partir de 88 ± 10,1% no dia 0 até ao 71 ± 8,6%, 49 ± 9.7% e 23 ± 6.6% nos dias 7, 21, 35 após os tratamentos, respectivamente, e devolvido para 83 ± 12,4% aos 120 dias após os tratamentos, conforme mostrado na Fig. 6e, painel superior. expressão de insulina também foi significativamente diminuiu de 92 ± 8,3% no dia 0-61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, e 12 ± 1,9% nos dias 7, 21, 35 após os tratamentos, respectivamente, e devolvido para 89 ± 15,3% no dia 120 após os tratamentos, conforme mostrado na Fig. 6e, 2
nd painel. Os níveis de expressão de PP também diminuiu significativamente nos mesmos pontos de tempo após o tratamento (Fig. 6e, 3
painel Rd). Os marcadores de proliferação de células dos ilhéus, as proteínas do ciclo celular e apoptose foram também estudados-tratamento pré- e pós. expressão Islet PCNA significativamente diminuiu de 16 ± 1,4% para 10 ± 0,8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% e 14 ± 2.0% nos dias 0, 7, 21, 35 e 120 após os tratamentos, respectivamente (Fig. 6e, 4
th painel). Ambos IHC e western blot análises de secções pancreáticas demonstraram aumento da expressão p27 e diminuindo a expressão dos níveis de proteína no ciclina E e Cdk4 após três ciclos de tratamento (Fig. 6e, 5
th, 6
th e 7
th painéis, e a Fig. S3, respectivamente). bi-shRNA
mousePDX-1 resultou num aumento significativo na apoptose de ilhotas de rato a partir de 1 ± 0,2% no dia 0, a 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5.5%, e 10 ± 1.1% em dias 7, 21, 35 e 120 após os tratamentos, respectivamente (Fig. 6e painel inferior). terapia de controlo de vector vazio tinha nenhum efeito sobre a ilhota PDX-1, insulina, PP expressão, proteínas do ciclo celular e apoptose. Estes dados são consistentes com os resultados vistos seguinte PDX-1 knockdown em células de insulinoma de rato
in vitro
. Eles também sugerem que sistêmica bi-shRNA
PDX-1 lipoplexes resultar em temporais hiperglicemia, suave que emana de supressão de PDX-1 dentro das ilhotas de Langerhans com subseqüente supressão da insulina e expressão PP, correlacionando com alterações nas proteínas do ciclo de células da ilhota e aumento da apoptose das ilhotas.
a expressão de todos os marcadores de ilhotas retornou aos valores basais após o sacrifício, o que sugere uma capacidade de regeneração de ilhotas de murino, resultando em normalização dos níveis basais de insulina e glicose. Isto está em contraste com os tumores residuais PANC-1 de células que tinham níveis baixos de PDX-1 e marcadamente elevados de apoptose, sugerindo uma falta de regeneração. Padrões semelhantes de expressão de PDX-1, insulina, PP, e proteínas do ciclo celular e a apoptose em células de ilhotas Foram também observadas após três ciclos de shRNA
mousePDX-1 lipoplexos (Fig. S4). Estes dados demonstram que sistémicos bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes prevenir eficazmente a morte de hipoglicemia em um modelo de rato insulinoma SCID e resultar em
in situ
knockdown do PDX-1 dentro das ilhotas, levando a supressão da insulina expressão e secreção e hiperglicemia subsequente. Notavelmente, os efeitos das ilhotas fora do alvo foram ligeiros e temporal, o que sugere uma capacidade regenerativa do pâncreas endócrino murino. Dado que não existem células de insulinoma residuais encontrados neste modelo após a terapia, os dados de ilhéus demonstrar a capacidade do tratamento sistemicamente-entregue para knockdown PDX-1 neste modelo.
Sistémico shRNA
mousePDX-1 lipoplexos hiperinsulinemia e hipoglicemia reverter e alterar a tolerância à glicose em subtipos de receptores de somatostatina 1 e 5 (SSTR
1/5
– /-) camundongos knockout
O SSTR1 /5
– /- modelo de ratinho foi utilizado como os ratinhos representam um modelo de rato imuno-competente insulinoma, como com sobre-expressão de PDX-1 tanto em células acinares e células dos ilhéus, caracterizado com hiperinsulinemia e hipoglicemia. Queríamos determinar se vários tratamentos intravenosos reverteria hiperinsulinemia basal e hipoglicemia e ser tolerada nestes ratos imuno-competentes. Três ciclos de shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /rato) foram bem toleradas e significativamente revertidas hiperinsulinemia basal e hipoglicemia em SSTR
1/5
– /- ratos (3 ± 0,2 ug /L e 83 ± 19,5 mg /dl no dia 0 e 0,5 ± 0,1 ug /L e 205 ± 25,9 mg /dL no dia 35 após três tratamentos, respectivamente, como pode ser visto na figura 5a e b).; lipoplexos vector vazio tinha nenhum efeito sobre a hiperinsulinemia e hipoglicemia (Fig. 7a e b). Surpreendentemente, os níveis de glicose e de insulina sistémicos retornou ao normal no dia 150 após o tratamento inicial, indicando uma capacidade regenerativa destas ilhotas murinas.
os níveis de glicose (a) e os correspondentes níveis de insulina (b) foram medidas como descrito em a secção de método. Imunocoloração para slides pancreáticos com PDX-1, foram realizados PCNA e TUNEL. coloração vermelha no painel superior (c) indica PDX-1 expressão (seta); coloração verde no painel do meio (c) indica expressão PCNA (seta). células tumorais por apoptose de SSTR1 /5
– /- ratos são coradas marrom e são mostrados no painel inferior de (C) (seta) (x 200). ensaio IPGTT mostrou níveis e os níveis de insulina (d) glucose no dia 7 e glicose e os níveis de insulina (e) no dia 150 após shRNA
mousePDX-1 terapia. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. e P 0,05 indicam significância
testes de tolerância à glucose intraperitoneal (IPGTT) foram realizados em SSTR
1/5
– /- ratos nos dias 7 e 150 após a.