Abstract

Fundo

β-lapachona (β-lap), tem sido conhecido por causar a morte NQO1-dependnet em células cancerosas e sensibilizar células cancerosas para radiação ionizante (IR). Nós investigamos os mecanismos subjacentes à radiossensibilização causada por β-lap

Metodologia /Principais Achados

β-lap reforçado o efeito de IR para causar células clonogénicas em NQO1

+ -. MDA células MB-231, mas não em NQO1

– células MDA-MB-231. β-lap causou apoptose apenas em NQO1

+ células e não em NQO1

– células e aumentou significativamente a apoptose induzida por IR apenas em NQO1

+ células. O tratamento combinado de NQO1 geração de ROS

+ células induzidas, desencadeada estresse ER e estimulou a activação de ERK e JNK. A inibição da geração de ROS por NAC efetivamente atenuou a ativação de ERK e JNK, indução de estresse ER, e apoptose subsequente. É importante ressaltar que a inibição da ERK abolida geração de ROS e estresse ER, enquanto que a inibição da JNK não, indicando que a regulação feedback positivo entre a ativação ERK e geração de ROS desencadeia o estresse ER em resposta ao tratamento combinado. Além disso, a prevenção do stress ER bloqueou completamente combinação induzida por tratamento de activação de JNK e subsequente morte celular por apoptose. Além disso, o tratamento combinado eficientemente induzida a translocação mitocondrial de Bax clivado, interrompido potencial de membrana mitocondrial, e a translocação nuclear de FIA, todos os quais foram eficientemente bloqueada por um inibidor de JNK. Caspases 3, 8 e 9 foram activadas por tratamento combinado, mas inibição destas caspases não aboliu a apoptose indicando ativação caspase desempenhou um papel menor na indução de apoptose.

Conclusões /Significado

β- colo provoca radiossensibilização dependente de NQO1 das células cancerosas. Quando NQO1

+ células são tratadas com a combinação de IR e β-lap, regulação feedback positivo entre ERK e ROS leva ao estresse ER causando activação JNK e translocação mitocondrial de Bax clivada. A diminuição resultante na membrana mitocondrial leva a translocação de FIA ​​e apoptose

Citation:. Parque M-T, Song M-J, Lee H, Oh E-T, Choi B-H, Jeong S-Y, et al. (2011) β-lapachona significativamente aumenta o efeito da radiação ionizante para causar apoptose mitocondrial via JNK de ativação em células cancerosas. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10.1371 /journal.pone.0025976

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebidas: 1 de junho de 2011; Aceito: 14 de setembro de 2011; Publicação: 06 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Coreia do Saúde 21 R D Projeto (A062254), o programa de investigação e desenvolvimento nuclear da Coreia Ciência e Engenharia Foundation (2009-0093747) e pela concessão Fundação Nacional de pesquisa da Coreia financiado pelo governo da Coreia (MEST) (2011-0018954). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

β-lapachona (β-lap) é um agente biorredutivo que tem sido demonstrado que possuem uma forte actividade anti-cancerígena ambos

in vitro

e

in vivo

[1] – [3]. A actividade anti-cancro de β-colo foi demonstrado ser devido à redução de dois electrões do β voltas mediada pelo NAD (P) H: oxidorredutase quinona (NQO1, a DT-diaforase) usando NADH ou NAD (P) H como fontes de electrões [1] – [3]. Porque NQO1 é expressa mais abundantemente em uma variedade de cancros sólidos humanos do que em tecidos normais [1] – [3], β voltas pode selectivamente matar as células cancerosas humanas. β voltas também foi mostrado para sensibilizar células de cancro a radiação ionizante (IR) [4]. No entanto, a preciso subjacente a este mecanismo radiosuscetível ainda não foi elucidado.

ciclismo inútil entre as formas oxidadas e reduzidas do β-colo foi mostrado para causar depleção progressiva de NADH e NAD (P) H, que, por sua vez, induz a libertação maciça de Ca

2+ a partir do retículo endoplasmático (ER) para o citosol, que conduz à activação do

2 + proteinase dependente, calpaína e subsequente morte celular por apoptose [1], [2 Ca ], [5]. Além disso, ciclos redox causada por um electrão reduzido β-volta (isto é, a forma semiquinona de β-LAP), o intermediário entre dois electrões β-colo e a forma oxidada da β voltas pode desencadear a activação de percursos de morte celular [1]. Estudos recentes sugerem que a geração de espécies de oxigénio reactivas (ROS) por diversos estímulos de morte celular não apenas iniciam uma cascata de sinais de morte celular, mas também conduzir directamente a danos no ADN [6] – [10]. No entanto, as vias de sinalização ativadas por ROS em células tratadas com β-lap ainda não foram claramente delineados.

Apesar de β-lap foi demonstrado para ativar proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) nas células cancerosas, e, assim, induzir a morte por apoptose [11], as vias de sinalização envolvidas na ativação de MAPKs causadas por β-colo, e o papel preciso da ativação de MAPK na apoptose induzida β-voltas não foram esclarecidas.

a célula mitocondrial via de morte é regulada pela relação de pro- para proteínas anti-apoptóticas, incluindo membros da família Bcl-2. Entre estes membros da família, Bax ou Bak desempenha um papel chave na perda de potencial mitocondrial transmembranar [12]. Após a entrega de um estímulo apoptótico, citosólica Bax transloca para a membrana externa da mitocôndria, onde oligomerizes para formar homodímeros, criando poros que agilizem a liberação de citocromo

c

, indutor de apoptose fator (AIF) e endonuclease G (Endo L) do espaço intermembranar da mitocôndria para o citosol [7].

neste estudo, foram investigados o mecanismo pelo qual β voltas modula a resposta das células de cancro da mama à radiação. Nós demonstramos aqui que o tratamento combinado de IR e β-lap sinergicamente aumenta clonogênica e morte celular por apoptose em uma maneira dependente da NQO1. Também mostram que a geração de ROS, a indução do stress ER, e activação de cinase regulada extracelular (ERK) e cinase c-Jun N-terminal (JNK), por tratamento combinado são cruciais para a morte celular por apoptose mitocondrial. Especificamente, concluiu-se que a formação de um circuito fechado de realimentação positiva entre a activação da ERK e a produção de ROS é necessária para ER stress induzida pelo tratamento combinado, o que conduz à activação de JNK e subsequente morte celular por apoptose mitocondrial. Nossos dados fornecem um mecanismo potencial para explicar o efeito radiosuscetível de β-colo, e percepção obtida no presente estudo vai levar a avanços na aplicação clínica de tratamento combinado com IR e β-lap em terapias com base no tumor dirigido-NQO1 segmentação .

resultados

o tratamento combinado com IR e β-lap aumenta clonogênica e morte celular por apoptose de uma forma

dependente de NQO1

Para determinar o efeito da β-lap em clonogênica a sobrevivência de células, foram tratados parentais NQO1

– MDA-MB-231 células deficientes em NQO1, ou NQO1

+ – MDA-MB-231 células possuindo expressão abundante de NQO1, com diferentes doses de β voltas. Como mostrado na Figura 1A, um aumento dependente da dose na morte de células clonogénicas, a seguir ao tratamento β-volta foi óbvia em NQO1

+ – MDA-MB-231, mas não em NQO1 parental

– MDA-MB-231 células, indicando NQO1 desempenha um papel crucial para a morte celular induzida por β voltas

(a) NQO1

-. ou NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com várias concentrações de β-colo. As células foram deixadas crescer durante 10 a 14 dias e foram coradas com violeta de cristal a 0,5% e teve para a formação de colónias. Os resultados de três experiências independentes estão expressos como média ± SEM. * Diferença significativa entre NQO1

– e NQO1

+ – MDA-MB-231 células após o tratamento β-volta em p 0,05. (B) As células foram tratadas com 2 uM β-colo e, em seguida, expostos a doses crescentes de IR 30 minutos após tratamento com β voltas. Após 14 dias, as células foram pontuadas para formação de colónias. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (C) As células foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. A percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs

Nós analisamos o efeito da β-lap sobre a morte clonogênica induzida por IR de NQO1

-. MDA-MB-231 e NQO1

+ – células MDA-MB-231. As células foram expostas a diferentes doses de IV na presença ou ausência de 2 uM β-colo e a sobrevivência clonogénica foi determinado como se mostra na fig. 1B. As curvas de sobrevivência de radiação para tratamento combinado foram normalizados para a morte por si só β-colo. A curva de sobrevivência de radiação para o tratamento combinado com IR e β voltas era idêntico em NQO1

+ – células MDA-MB-231. Por outro lado, a curva de sobrevivência de radiação para o tratamento combinado de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foi significativamente mais acentuado particularmente nas doses de radiação mais baixas do que para o tratamento de IR isoladamente, resultando em diminuição significativa no ombro da sobrevivência curva. A redução do ombro indicou que β-lap inibiu a reparação de danos causados ​​pela radiação subletais em NQO1

+ células, mas não em NQO1

-. Células

Nós investigamos o efeito combinado de IR e β-lap na morte celular por apoptose em NQO1

– MDA-MB-231 e de NQO1

+ – células MDA-MB-231. As células foram tratadas com 10 Gy de IV sozinho, 2 uM β-lap por si só, ou uma combinação de infravermelhos e β voltas durante vários períodos de tempo, e morte celular por apoptose foi avaliada. Embora a apoptose de NQO1

+ – MDA MB-231 células induzidas por IV sozinho foi de cerca de 13 e 14% às 24 e 48 h, respectivamente, β voltas apoptose sozinho-induzida em cerca de 18 e 40% de células em 24 e 48 h, respectivamente (Fig. 1C). O tratamento combinado com IR e β voltas notavelmente aumento da morte celular por apoptose em NQO1

+ – MDA-MB-231; cerca de 58 e 87% das células estavam apoptóticas passadas 24 horas e 48 horas, respectivamente. Pelo contrário, em NQO1

– MDA-MB-231, não apoptose significativa ocorreu após tratamento com IR ou β voltas sozinho ou mesmo com a combinação de IR e β-colo, muito provavelmente devido a uma deficiência de NQO1 e um forma mutante de p53 expresso em NQO1

-. MDA-MB-231 [13]

tratamento combinado com IR e β-lap marcadamente induz a produção de ROS em NQO1

+ – MDA-MB -231 células

Nós investigamos o envolvimento de ROS na morte celular por apoptose induzida por tratamento combinado em NQO1

– MDA-MB-231 e NQO1

+ – células MDA-MB-231. Nós primeira medida ROS com coloração de DCF. Comparado com o tratamento individual com IR ou β-colo, o tratamento combinado causou muito mais aumento nos níveis de ROS durante 3 h em NQO1

+ – células MDA-MB-231, mas não em NQO1

– MDA-MB-231 (Fig. 2A). Nós confirmamos ainda mais a geração de ROS por tratamento combinado com IR e β-lap usando outro corante ROS detecção, dihydroethidium (DHE). Tal como mostrado na Figura 2B, observou-se aumento acentuado na produção de ROS em NQO1

+ – células MDA-MB-231, mas não em NQO1

– MDA-MB-231 de células após o tratamento combinado com IR e β voltas . Para determinar se o aumento nos níveis de ROS intracelulares estava diretamente relacionado à morte celular por apoptose, nós pré-tratados

+ NQO1 – células MDA-MB-231 com o NAC antioxidante antes de expor as células a IR e β-colo. Tal como mostrado na Figura 2C, o pré-tratamento com NAC reduziu significativamente a morte celular por apoptose causada por tratamento combinado com IR e β voltas. Além disso, o pré-tratamento com NAC eficazmente atenuou a morte de células clonogénicas, causada pelo tratamento combinado com IR e β-volta (fig. 2D). Estas observações sugerem que a indução de ROS contribui de forma crítica para a morte celular por apoptose e clonogénico causada pelo tratamento combinado com IR e β voltas em NQO1

+ -. As células MDA-MB-231

(A) e (B) as células foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. Após 3 h, as células foram incubadas com 10 uM H2DCF-DA e 4 uM de DHE, respectivamente, durante 30 min e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (C) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou na ausência de NAC (10 mM). Após 24 h, a percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (D) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com a combinação de IV (2 Gy) e β voltas (2 uM) na presença ou na ausência de NAC (10 mM). As células foram deixadas crescer durante 10 a 14 dias e foram coradas com violeta de cristal a 0,5% e teve para a formação de colónias. Os resultados de três experiências independentes estão expressos como média ± SEM. * Diferença significativa entre as células na presença ou na ausência de NAC após o tratamento combinado com IR e β-colo, a p . 0,05

β voltas em combinação com IR rapidamente activa ERK e JNK, levando para apoptótico de morte celular

para revelar o potencial envolvimento de MAPK na morte celular por apoptose causada por tratamento combinado com IR e β-colo, estudámos os níveis das formas activadas de MAPK em NQO1

– MDA-MB-231 e de NQO1

+ – MDA-MB-231 células por análise de transferência de Western utilizando anticorpos anti-fosfo. Como mostrado na Figura 3A, em NQO1

– células MDA-MB-231, IV sozinho aumentou ligeiramente a fosforilação de ERK e JNK, enquanto por si só β voltas causada pequena mudança nos níveis de ERK fosforilada e JNK. O efeito combinado do tratamento foi semelhante ao do RI sozinho. A fosforilação de p38 MAPK em NQO1

– células MDA-MB-231 era negativo quer após tratamentos únicos ou combinados com IR e β voltas. No entanto, em NQO

+ – células MDA-MB-231, o tratamento combinado levou a um rápido aumento da regulação da ERK fosforilada e de JNK em comparação com o tratamento com IV sozinho ou β-lap por si só (Fig. 3A). activação de ERK foi aparente a 0,5 h, e permaneceram elevados durante 3 h após o tratamento combinado. Além disso, a activação da JNK começou a aumentar dentro de 0,5 h, mas diminuiu 2 h após o tratamento combinado em NQO1

+ – células MDA-MB-231. Os níveis celulares totais de ERK e JNK permaneceu constante. IR tratamento aumentou a fosforilação de p38 MAPK, enquanto que o tratamento β voltas não causou alteração na fosforilação de p38 MAPK. O nível de fosforilação de p38 MAPK após o tratamento combinado foi mais baixa do que após tratamento apenas com IR, indicando β voltas suprimiu a activação induzida por IR de p38 MAPK em NQO1

+ – células MDA-MB-231 (Fig. 3A). Para examinar a relação entre a activação de MAPK e morte celular por apoptose, que pré-tratado de NQO1

+ – MDA-MB-231 com SP600125, PD98059, ou SB203580, inibidores de JNK, MEK /ERK, e p38 MAPK, respectivamente, antes do tratamento com IR e β voltas. Tal como mostrado na Figura 3B, PD98059 e SP600125 eficazmente reduzida a morte celular por apoptose causada pelo tratamento combinado de 56% para 24% e 13%, respectivamente, enquanto que SB203580 foi ineficaz. Para investigar ainda mais o envolvimento das ERK e JNK2 na morte celular por apoptose causada por tratamento combinado com IR e β-colo, que pré-tratado de NQO1

+ – MDA-MB-231 com siRNAs segmentação de ERK e JNK2. Consistente com os resultados obtidos com os inibidores farmacológicos, a inibição específica de ERK e JNK2 com siRNAs quase aboliu completamente a morte celular por apoptose causada por tratamento combinado (Fig. 3C). Estes resultados demonstram que a ERK e JNK ato como importantes mediadores da morte celular por apoptose induzida por tratamento combinado com IR e β voltas em NQO1

+ -. As células MDA-MB-231

(A) NQO1

– ou NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (B) e (C) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratados apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou ausência de PD98059 (30 uM ), SP600125 (30 uM), SB203580 (30 uM), ou siRNA alvejando ERK1 /2 ou JNK2. A percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs.

regulação feedback positivo entre ROS e ERK induzida pelo tratamento combinado com IR e β-lap é essencial para a activação de JNK

para determinar se a produção de ROS está envolvido na activação de ERK e JNK por tratamento combinado com IR e β-colo, que pré-tratados

+ NQO1 – MDA-MB-231 com a NAC antioxidante antes do tratamento com IR e β -colo. Como mostrado na Figura 4A, a activação de ERK e JNK por tratamento combinado foi completamente bloqueada pelo pré-tratamento com NAC. A seguir, examinou a contribuição de ERK e JNK em geração ROS causada pelo tratamento combinado. Nós tratada NQO1

+ – MDA-MB-231 células com siRNAs segmentação ERK e JNK2 antes do tratamento com IR e β-colo. Como mostrado na Figura 4B, mediada por siRNA knockdown ERK bloqueou eficazmente a produção de ROS, tal como determinado com o DCF, induzida por β-lap por si só e para uma ainda maior extensão, por tratamento combinado, ao passo que siRNA alvejando JNK2 não atenuou a produção de ROS.

(a) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 30 min na presença ou na ausência de NAC. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (B) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 3 h na presença ou ausência de siRNA alvejando ERK1 /2 ou JNK2. Após 3 h, as células foram incubadas com 10 uM H2DCF-DA, durante 30 min e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (C) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 30 min na presença ou ausência de PD98059 ou SP600125. . Os dados representam uma experiência típica realizado três vezes com resultados semelhantes

Para melhor elucidar a possibilidade de cross-talk entre ERK e JNK, nós pré-tratados

+ NQO1 – MDA-MB-231 com PD98059 ou SP600125. Tal como mostrado na Figura 4C, a activação de ERK e JNK por tratamento combinado foi completamente abolida por pré- tratamento com PD98059 e SP600125, respectivamente. Além disso, PD98059 combinação bloqueou eficazmente a activação de JNK induzida por tratamento, ao passo que SP600125 não atenuou a activação de ERK, indicando que a ERK é um activador a montante de JNK (Fig. 4C). Estes resultados indicaram que β voltas em combinação com RI conduz a regulação por feedback positivo entre ROS e activação de ERK que pode contribuir para a activação de JNK.

geração de ROS induzida pelo tratamento combinado com IR e β voltas é necessário para o indução de estresse ER

a seguir, investigou se o tratamento combinado com IR e β-lap induz estresse ER em NQO1

+ – MDA-MB-231 células usando fosforilação de eIF2α e pique expressão. Como mostrado na Figura 5A, IV sozinhos não alterou os níveis de eIF2α fosforilados (p-eIF2α) e CHOP expressão, sozinho e β voltas ligeiramente aumentada p-eIF2α e CHOP expressão. No entanto, o tratamento combinado marcadamente induzidos p-eIF2α e aumentou CHOP nível de expressão (Fig. 5A). Para examinar ainda mais o envolvimento do estresse ER na morte celular por apoptose induzida pelo tratamento combinado com IR e β-volta, nós pré-tratados NQO1

+ – MDA-MB-231 células com Salubrinal (Sal), um inibidor ER stress. Como mostrado na Figura 5B, Sal combinação eficazmente suprimida tratamento induzida morte celular por apoptose. Estes resultados indicam que o stress ER é um dos principais contribuintes para a morte celular por apoptose induzida por tratamento combinado em NQO1

+ -. As células MDA-MB-231

(A) NQO1

+ – MDA-MB -231 células foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (B) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou ausência de Sal (10 uM). Após 24 h, a percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (C) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratados com IR sozinho β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 3 h na presença ou ausência de Sal (10 uM). Após 3 h, as células foram incubadas com 10 uM H2DCF-DA, durante 30 min e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (D) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 30 min na presença ou na ausência de NAC. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (E) e (F) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 30 min na presença ou ausência de Sal, SP600125 ou PD98059. Os dados representam uma experiência típica realizado três vezes com resultados semelhantes

A seguir, investigou a relação entre a geração de ROS e estresse ER em NQO1

+ -. MDA-MB-231 células tratadas com a combinação de IR e β-colo. Como mostrado na Figura 5C, o tratamento prévio com Sal não atenuou a geração de ROS causada pelo tratamento combinado, ao passo que o pré-tratamento com NAC prevenida eficazmente a fosforilação de eIF2α (Fig. 5D), o que indica que a produção de ROS induzida pelo tratamento combinado é necessária para a indução de ER stress.

ER stress induzido pelo tratamento combinado com IR e β-lap é necessário para a activação de JNK

para analisar a relação entre o estresse ER e MAPKs (ERK e JNK), nós primeira examinou o efeito do Sal na ativação de ERK e JNK. Como mostrado na Figura 5E, o pré-tratamento com Sal suprimido eficazmente a activação de JNK induzida pelo tratamento combinado, mas não atenuou a activação da ERK. Para consolidar ainda mais o papel crítico da MAPKs na indução de estresse do RE, nós pré-tratados

+ NQO1 – MDA-MB-231 células com PD98059 ou SP600125. Como mostrado na Figura 5F, a fosforilação induzida pelo tratamento combinado de eIF2α foi completamente bloqueada por PD98059, mas não por SP600125. Estes resultados indicam que a ERK é um activador a montante do stress ER responsável pela activação de JNK em resposta ao tratamento combinado com IR e β voltas.

tratamento combinado com IR e β voltas induz a morte celular por apoptose através da translocação nuclear FIA de

Como a activação da via da caspase é um mecanismo importante para a indução de morte celular apoptótica [14], foi investigado o envolvimento de caspases na resposta apoptótica para o tratamento combinado de NQO1

+ – MDA-MB -231 células com IR e β-colo. Como mostrado na Figura 6A, o tratamento combinado levou a activações de caspase-8, -9 e -3. Note-se que a activação da caspase 9 e 3 ocorreu antes da activação da caspase 8. IR ou β-lap sozinho não causou ativações evidentes destas caspases. Citocromo c libertado a partir da mitocôndria tem sido relatado para formar um complexo com pro-caspase-9 e apoptótica factor-1 (Apaf-1), resultando na activação de proteases de activação de pro-caspase-9 [14]. Portanto, determinou-se o tratamento combinado com IR e β voltas induz a libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citossol. Como mostrado na Figura 6B, o tratamento combinado com eficiência aumentou o nível de citocromo C no interior da fracção citosólica durante 12 h, enquanto IR ou β-lap por si só não o fez. Foi estudada a exigência de caspase para a apoptose induzida por tratamento combinado com um inibidor de largo espectro de caspases, z-VAD-fmk. A Figura 6C mostra que z-VAD-fmk prevenida eficazmente a activação de caspases causados ​​pelo tratamento combinado. Surpreendentemente, no entanto, z-VAD-fmk só reduziu a morte celular por apoptose induzida por um tratamento combinado de cerca de 51% a 42% (Fig. 6D). Estes resultados indicam que a morte celular por apoptose causada por tratamento combinado com IR e β voltas ocorre, embora a activação de caspases é inibida

(A) NQO1

+ -. MDA-MB-231 foram tratou-se com IR sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (B) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 12 h. fracções citosólicas de NQO1

+ – foram preparadas células MDA-MB-231 e sujeitas a análise de Western blot. Os dados são representativos de uma experiência típica realizado três vezes. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (C) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com a combinação de IR e β voltas durante 12 h na presença ou ausência de Z-VAD-fmk. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes. (D) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou ausência de Z-VAD-fmk (30 pM ). Após 24 h, a percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (E) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com IV sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h. frações nucleares de NQO1

+ – foram preparadas células MDA-MB-231 e submetido a análise de Western blot. Os dados são representativos de uma experiência típica realizado três vezes. (F) NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas apenas com IR, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou ausência de siRNA alvejando FIA. Após 24 h, a percentagem de células com teor de ADN sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados de três experimentos independentes são expressos como médias ± SEMs. (G) de NQO1

+ – células MDA-MB-231 foram tratadas com a combinação de IR e β voltas durante 24 h na presença ou na ausência de NAC, PD98059, Sal ou SP600125. fracções nucleares foram preparados e submetidos a análise de Western blot. Os dados são representativos de uma experiência típica conduzida três vezes.

Como FIA, Flavoproteína localizada-mitocôndrias, é conhecido por estar envolvido na indução da morte celular por apoptose independente de caspase [7], que em seguida investigaram se FIA ​​desempenha um papel na indução de morte celular por tratamento combinado com IR e β voltas. FIA é libertado a partir da mitocôndria em resposta a estímulos de morte celular, subsequentemente, se transloca para o núcleo, onde se faz com que a fragmentação do ADN [7]. fracionamento subcelular demonstraram que o tratamento combinado induzida drasticamente a translocação nuclear de FIA, enquanto IR ou β-lap sozinho provocou pequeno aumento no FIA no núcleo (Fig. 6E). Além disso, siRNA mediada FIA knockdown morte celular por apoptose induzida por tratamento de combinação com eficácia reduzida de 55% para quase os níveis de controlo (Fig. 6F). Estes resultados sugerem que é necessária a translocação nuclear de FIA ​​para a indução da morte celular por apoptose por meio de tratamento combinado com IR e β voltas.

Para definir melhor os papéis de ROS, ERK, JNK e ER stress na translocação nuclear de FIA ​​tratamento após combinado com IR e β-volta, nós pré-tratados NQO1

+ – MDA-MB-231 células com os inibidores correspondentes, NAC, PD98059, Sal ou SP600125, e examinar a localização subcelular da FIA. Como mostrado na Figura 6G, a translocação nuclear de FIA ​​induzida pelo tratamento combinado, foi completamente bloqueada pelo pré-tratamento com a NAC, PD98059, Sal ou SP600125. Estes resultados mostram que as ROS, ERK, JNK e ER stress são activadores a montante de morte celular mediada por FIA-induzidas pelo tratamento combinado com IR e β voltas.

tratamento combinado com IR e β voltas induz a translocação de mitocondrial clivada Bax e rompimento de transmembrana mitocondrial potencial

Para determinar o papel da via mitocondrial na apoptose induzida pelo tratamento combinado em NQO1

+ – MDA-MB-231, examinamos primeiro as mudanças na Bcl-2 e Os níveis de expressão Bax e potencial de membrana mitocondrial. Como mostrado na Figura 7A, os níveis de Bax foram marcadamente reduzidos em resposta ao tratamento combinado com IR e β-colo, mas não em resposta ao tratamento individual com IR ou β voltas. Os níveis de Bcl-2 expressão não foram alteradas pelo tratamento individual ou combinada. Tem sido relatado que o Bax é clivado a partir de uma forma nativa de 21 kDa para um fragmento de 18 kDa, em resposta a estímulos de morte [15], [16]. Uma vez que a translocação de 18 kDa clivada da Bax a partir do citosol para a mitocôndria tem sido relatado para induzir uma diminuição na região transmembranar mitocondrial potencial libertação e subsequente das proteínas proapoptogenic de mitocôndrias [15], [16], foi investigado se o tratamento combinado induz a translocação mitocondrial de Bax clivado . Como mostrado na Figura 7B e C, o tratamento combinado com IR e β voltas mais eficazmente aumentado os níveis de 18 kDa clivada da Bax dentro da fracção mitocondrial de tratamento individual com IR ou β voltas. No entanto, de 18 kDa forma de Bax foi indetectável nos lisados ​​de células inteiras, após o tratamento combinado (Fig. 7C). Porque uma protease catepsina-como tem sido sugerido para ser envolvidas na rápida degradação de 18 kDa forma de Bax no citosol [17], que pré-tratadas células com o MG132 inibidor de protease de saber porque clivado Bax estava ausente no lisado celular total depois de combinados tratamento com IR e β-colo. Como mostrado na Figura 7D, quando as células foram tratadas com a combinação de IR e β voltas na presença de MG132, clivado da Bax foi detectado no lisado celular total, o que indica que clivado Bax é facilmente degradado no citosol após o tratamento combinado com IR e β -colo. Assim, a forma de Bax kDa 18 podem ser instáveis ​​no citosol, mas estável na fracção mitocondrial após o tratamento combinado com IR e β voltas. Além disso, como mostrado na Figura 7E, o tratamento combinado interrompido de forma significativa o potencial transmembranar mitocondrial de um modo dependente do tempo, coincidindo com as alterações observadas nos níveis de Bax. . Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a morte celular induzida pelo tratamento combinado envolve uma alteração no potencial de transmembrana mitocondrial mediada pela redistribuição intracelular de Bax clivado

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231 foram tratou-se com IR sozinho, β-lap por si só ou a combinação de IR e β voltas durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot. Os dados representam uma experiência típica conduzida três vezes com resultados semelhantes.