Abstract

Introdução

Nós descrevemos um romance 3D co-cultura modelo usando não-pequenas linhas celulares de cancro do pulmão (NSCLC), em combinação com os fibroblastos de pulmão. Este modelo permite a investigação das interações tumor do estroma e aborda a importância de ter um mais in vivo como modelo de cultura celular.

Métodos

Automation compatível com multi-poço foram usadas penduradas placas de microtitulação de queda para a produção de mono- 3D e co-culturas. Nestes gotas de suspensão a duas linhas celulares de NSCLC A549 e Colo699 foram cultivadas isoladamente ou em co-cultura com fibroblastos de pulmão. A viabilidade de esferóides de tumor foi confirmada após cinco e dez dias, utilizando Anexina V /iodeto de propídio para coloração de citometria de fluxo. Tumor formação de fibroblastos esferóide foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (SEM), secções semi-finas, microscópio de fluorescência e imuno-histoquímica (IHQ). Além de histologia convencional, a expressão da proteína da caderina-E, vimentina, Ki67, fibronectina, citoqueratina 7 e actina de músculo α-liso (α-SMA) foi investigada por IHC.

Resultados

menor viabilidade foi observada em monoculturas A549 em comparação com co-culturas, ao passo que as monoculturas Colo699 apresentaram melhor viabilidade em relação à co-culturas. expressão de Ki67 variou significativamente entre os mono- e co-culturas em ambas as linhas celulares tumorais. Um aumento da expressão de vimentina e diminuição da E-caderina pode ser detectado durante o curso da cultura sugerindo uma transição para um fenótipo mais mesenquimais. Além disso, a linha celular de fibroblastos mostrou uma expressão de α-SMA apenas em co-cultura com a linha de células de cancro A549, indicando, assim, uma mudança de mesenquimal mesenquimais para um ainda mais fenótipo de miofibroblastos.

Conclusão

Nós demonstramos que o nosso método é uma ferramenta promissora para a geração de esferóides tumor co-culturas. Além disso, estes esferóides permitir que a investigação das interações tumor do estroma e um melhor reflexo de condições in vivo de células cancerosas em seu microambiente. Nosso método tem potencial para contribuir para o desenvolvimento de agentes anti-cancro e apoiar a busca de biomarcadores

Citation:. Amann A, Zwierzina M, Gamerith G, Bitsche M, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) Desenvolvimento de um sistema de cultura celular 3D inovadora para o Estudo de Tumor – Stroma Interações em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10.1371 /journal.pone.0092511

editor: Donald Gullberg, da Universidade de Bergen, Noruega |

Recebido: 03 de junho de 2013; Aceito: 24 de fevereiro de 2014; Publicação: 24 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Amann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por meio de uma concessão Ph.D da Sociedade austríaca de Hematologia e Oncologia (OeGHO) e ainda apoiado financeiramente pela Verein für Tumorfoschung. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:. Quanto Insphero (J. Kelm) ea afiliação ao trabalho dos autores: Esta autor contribuiu com a sua longa experiência em cultura celular 3D a este artigo. Além disso, os autores foram suportados pela sociedade sob a forma de placas de cultura de células em 3D para seus experimentos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Devido à crescente compreensão dos mecanismos relevantes para a gênese do câncer, estamos passando por uma transição da doença para atingir orientada terapia. Como consequência, o futuro da terapia alvo molecular de cancro reside em identificar subconjuntos de pacientes que beneficiem de terapias particulares que atingiram estruturas específicas expressas pela célula maligna. Um obstáculo principal para o desenvolvimento destes regimes terapêuticos individualizados, no entanto, é a disponibilidade limitada de modelos preditivos in vitro. O desafio fundamental é o desenvolvimento de modelos de cultura celular que reflete as condições in vivo e apoiando assim a investigação de biomarcadores preditivos que têm o potencial de aumentar o valor dos medicamentos contra o cancro e reduzir as taxas de tamanho, custo e fracasso dos ensaios clínicos melhor.

não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) é uma das principais causas de morte por câncer no sexo masculino e do sexo feminino em todo o mundo.

Apenas 15% -20% dos casos são diagnosticados numa fase inicial [1] . O prognóstico permanece pobre, com uma taxa de sobrevida em 5 anos variando de aproximadamente 60% para a fase I para menos de 5% para o estágio IV tumores [2].

Os pacientes diagnosticados com doença localmente avançada necessitam de tratamento multimodalidade para alcançar a longo remissão -TERM ou mesmo curar enquanto que os pacientes com doença metastática receber quimioterapia à base de platina, quer isoladamente ou em combinação com inibidores de EGFR ou alcalinos de [3] -. [5]

Numerosos outros agentes direcionados moleculares foram testados em clínica ensaios, mas não conseguiu mostrar um benefício para pacientes em relação a sobrevivência livre de progressão ea sobrevida global [6]. Vários destes ensaios destinados a definir biomarcadores de uma forma prospectiva ou retrospectiva, mas apenas um número muito limitado foram identificados [7], [8].

ensaios baseados em células de tão longe para explorar a biologia celular e eficácia da droga destina-se a células que crescem em superfícies de plástico bidimensionais ou em suspensão de células individuais [4]. A biologia das células, no entanto, ser profundamente influenciada pela sua micro-ambiente requerem ensaios baseados em células que reflectem os efeitos de factores, tais como a matriz extracelular (ECM), contactos célula-célula, as interacções célula-matriz, da polaridade celular e perfis de oxigénio [ ,,,0],5] – [8].

convencional dois dimensionais sistemas (2D) de cultura de células cultivadas em superfícies plásticas artificiais têm grandes limitações. Por exemplo, eles requerem altas concentrações não fisiológicas soro fetal de vitelo (FCS) e realimentação por meio mudando a cada 2-3 dias. Em contraste a isso, as técnicas 3D evitar superfícies de plástico permitindo que as células de modo a formar a sua ECM e requerem reduziu significativamente as concentrações de FCS. morfologia das células, não só mas também de sensibilidade às drogas de células cancerosas em sistemas 2D é diferente em comparação com em culturas de células em 3D [9], [15]. As células cultivadas em superfícies de plástico exibem normalmente um aumento da sensibilidade a drogas citotóxicas, enquanto que os compostos direccionamento celular – adesões celulares, a maturação das células, epitelial-mesenquimal transição (EMT) e características stemness frequentemente mostram uma eficácia reduzida em cultura de células 3D. Assim, os modelos de cultura celular 3D refletir no crescimento do tumor in vivo de forma mais confiável e pode proporcionar uma melhor ler outs para testes de drogas [9], [15], [10].

A maioria dos sistemas 3D utilizar agregados esferóides de células e sistemas de cultura de andaime . Estes sistemas suportam o crescimento celular 3D por homólogos produzidos artificialmente extracelulares (por exemplo, colágeno, matrigel, andaimes) que facilitam a adesão celular e agregação. Outros sistemas 3D utilizam tecnologias de sobreposição líquidos, malha de fibra feitas de polímeros biocompatíveis, grânulos sólidos ou porosos ou matrizes extracelulares e seus substitutos e requerem a adição de suplementos produzidos artificialmente para alcançar 3D culturas de células de crescimento [16] – [19].

a técnica de gota em suspensão é um método de cultura de células bem estabelecido para formar microtissues esféricas a partir de linhas de células primárias imortalizadas e [20] – [22]. Em contraste com a maioria das tecnologias de sobreposição de líquidos, o método de gota suspensa permite o controlo preciso sobre a composição da célula inicial em cada microtissue [23], [24]. Para gerar multicelulares microtissues co-Type Culture nem suplementos adicionais nem andaimes artificiais imitando componentes da matriz extracelular (por exemplo, colágeno matrigel) são obrigatórios.

Com base em uma automação e alta taxa de transferência compatível com a tecnologia queda pendurado estabelecemos um organot�ica modelos de co-cultura composto por duas linhas diferentes de células do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em combinação com os fibroblastos de pulmão. Este método permite, não só a investigação das interacções do tumor e de estroma representa um in vivo em mais como modelo de cultura celular para estudar interacções 3D tumorais droga, mas também pode ser implementado em campanhas de descoberta de drogas futuras.

Materiais e Métodos

cultura celular

o NSCLC linhas de células A549 e Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) e a linha de células de fibroblastos de pulmão SV-80 (CLS, 300345) foram utilizados para nossos experimentos. Para a cultura 2D, as linhas celulares foram cultivadas como monocamada em meio DMEM de baixa glicose (PAA, Pasching, Austria) suplementado com FCS a 10% (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha, Lote 010M3396) e 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina solução, 2 mM de L-glutamina (PAA). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 contendo atmosfera.

cultura celular 3D

Para a produção de 3D mono- e co-culturas GravityPLUS ™ microtissue foram utilizados sistema de cultura (InSphero AG, Zurique, Suíça). A placa consiste de uma armação com 8 × 12 inserções e assim um canal periférico preenchido com 2-3 ml de água estéril para proporcionar uma barreira de humidade que reduz a evaporação do meio das gotas. Esta moldura é colocada sobre um tabuleiro inferior, que é preenchida com 5 mL de 0,2 × solução salina tamponada com fosfato (PBS) (PAA) com 0,1% de Triton X-100 (Sigma), de novo para reduzir a evaporação das gotículas. O poço é dividido em três elementos: (i) a entrada de ar no qual as pontas das pipetas são colocados directamente na superfície da cavidade, (ii) o compartimento de cultura e (iii) um micro-canal que liga a entrada e o compartimento de cultura. Cada poço é para compensar quaisquer pequenas variações na altura das pontas das 96 cavidades cabeças de pipetas carregadas por mola.

Após as células tinham sido cultivadas subconfluently em placas de cultura celular (Falcon) foram semeadas em gotas da suspensão. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com PBS e digerido com 1 × Accutase (PAA) durante dez minutos a 37 ° C. Depois disso, a digestão foi parada e as células lavadas uma vez com 20 ml de meio de cultura celular. Em seguida, as células foram contadas e semeadas em 40 ul de várias gotas contagens de células (monoculturas: SV-80 e A549: 2500 células /40 ul; Colo699: 1250 células /40 ul; co-culturas: carcinoma de células: fibroblastos proporção 01:02 /40 ul). troca de meio foi realizada a cada quatro dias e os esferóides foram colhidas após cinco e dez dias, carregando 100 ul de PBS (PAA) para os microcapilares para expulsar os esferóides. As gotas que caem contendo os esferóides foram então recolhidas com uma placa com 96 poços de fundo em U (Falcon), que está colocado por baixo da placa microcapilar.

coloração CFSE de fibroblastos.

Para a marcação fluorescente Kit de fibroblastos da Proliferação de células CellTrace CFSE ™ (Molecular Probes, Invitrogen) foi utilizado. Os fibroblastos foram dissolvidos e ajustada para 1 x 106 em 1 ml de PBS /0,1% de albumina de soro bovino (BSA) .CFSE solução foi adicionado para atingir uma concentração de trabalho final de 10 uM. As células foram então incubadas durante 10 minutos a 37 ° C. Em seguida, a coloração foi extinta com cinco volumes de meio de cultura de células de gelo frio e incubadas durante 5 minutos em gelo. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com meio de cultura celular. Os fibroblastos marcadas foram semeadas agora como co-culturas com células de carcinoma, como descrito na secção de cultura de células 3D.

citometria de fluxo

Oito microtissues, semeados em placas de 96 poços foram transferidas para 5 ml tubos de FACS (Falcon) e lavadas uma vez com 2 ml de PBS. Depois, microtissues foram solubilizados em suspensão de células individuais através da adição de 300 ul Accumax (Miltenyi Biotech) por microtissue incubando-as durante 20 minutos a 37 ° C. Depois de dez minutos microtissues foram misturados e pipetados para cima e para baixo para se obter uma solução homogénea. Este procedimento foi repetido após 20 minutos de incubação. Agora, a digestão foi parada com 2 ml de meio de cultura celular completo, em seguida, as células foram centrifugadas a 300 g durante dez minutos, e lavou-se duas vezes com 0,5% de BSA /PBS. Em seguida, as células foram coradas com 4 ul de iodeto de propídio (PI) de solução corante e 4 ul de Anexina V a APC. A coloração foi realizada em 100 ul de Tampão de Ligação Anexina retirado da Anexina V Apoptosis Detection Kit I (Becton Dickinson) durante 15 minutos. Finalmente, as células foram analisadas num BD FACS Calibur imediatamente. Cada medição de dados foi feita a partir de oito microtissues agrupados, repetindo todo o processo de forma independente por três vezes.

cálculo do volume de microtissues

Seis microtissues de mono e co-culturas foram avaliadas por uma luz invertida microscópio (Motic AE31) de um dia para dez. Depois de cinco, sete e dez dias, dois diâmetros (d) de cada microtissue foram medidos e o volume foi calculado pela fórmula V = 4/3 * Π * r

3, onde r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. medição do volume foi repetida três vezes. Depois disso, média e desvio padrão foi calculado e significância estatística testada com t-teste do estudante no Microsoft Excel.

análises imuno-histoquímica

A preparação da amostra.

Microtissues foram lavadas em PBS e, em seguida, imediatamente fixados por imersão em água fria a 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS, durante quatro horas à temperatura ambiente. Microtissues foram então lavadas outra vez em PBS e embebidas em agarose a 2% (Invitrogen). O excesso de agarose foi removida com um bisturi, e os blocos de agarose contendo os microtissues foram desidratadas em álcoois graduados e embebido em cera de parafina (Paraplast regular, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) Um micrótomo Microm ERGO estrela rotativa (Microm, walldorf, Alemanha) foi utilizado para levar secções em série de 4 mm de espessura. Uma de três a quatro séries de secções parafinado foram, em seguida, montado em um padrão de meandros sobre SuperFrost Além disso, as lâminas (Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemanha) e secou-se durante a noite, em seguida cozido a 60 ° C durante uma hora para aderir as secções firmemente às lâminas. Para orientação cito-arquitectónica, cada décimo de slides foi hematoxilina /eosina (HE), utilizando um Shandon Varistain 24-4 Deslize Stainer (Histocom Viena, Áustria).

anti-soros.

Hosts, diluições , os tempos e as fontes de anticorpos primários, bem como de recuperação de epítopo induzida pelo calor (HIER incubação) são listados na Tabela 1.

a imunocitoquímica

imunocitoquimica foi efectuada em 4 uM de secções microtissues embebidos em parafina em um Ventana Roche descoberta imunohistoquímica (Mannheim, Alemanha) de acordo com o procedimento padrão pesquisa de descoberta de DAB-MAP. Se necessário, a recuperação de antigénio foi iniciada por desmascaramento induzida termicamente dos epitopos enquanto as lâminas foram imersas em conformidade com as instruções do fabricante (curto ou padrão para diferentes tempos de incubação) em tampão de EDTA (Cell Condicionado Solução CC1, Ventana). Após incubação das secções com anticorpos primários (listados na Tabela 1.) a 37 ° C, um cocktail de imunoglobulina IgG biotinilado de cabra anti-ratinho, de cabra anti-ratinho IgM, IgG de cabra anti-coelho e bloco de proteína (Descoberta Universal Anticorpo , Ventana) foi aplicada durante 30 minutos à temperatura ambiente. A detecção foi realizada com o Kit de Detecção de DAB-MAP (Ventana) de acordo com o método de desenvolvimento de diaminobenzidina (DAB). As secções foram contrastadas com hematoxilina, finalmente, (Ventana) durante quatro minutos. Posteriormente, os cortes foram manualmente desidratadas em série álcool rebaixado, apuradas em xileno e tampa escorregou permanentemente com Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).

As imagens digitais de HE- e imunocoradas lâminas foram adquiridos em software AxioVision microscópio ligado a uma câmera de cor AxioCam HRc e um Axioplan 2 microscópio (Zeiss, Jena, Alemanha).

Ki67 positividade foi determinada pela contagem núcleos de células positivas e negativas Ki67 em três diferentes esferóides de A540 e Colo699 em mono e co- culturas representativas. Posteriormente, calculou-se a percentagem de núcleos de células positivas para o número de células inteiras. Média e desvio padrão e significância estatística foi calculada como descrito antes.

microscópio de fluorescência

Microtissues em mono e co-culturas foram colhidas como descrito acima e lavadas uma vez com PBS. Depois, microtissues tumorais foram fixadas com PFA a 4% durante duas horas a 4 ° C e lavadas três vezes com PBS. Agora, que foram bloqueados por incubação com PBS contendo BSA a 2% (Sigma) /0,3% de Triton X-100 (Roche) durante uma hora à temperatura ambiente. Microtissues foram depois incubadas 40 minutos com 50 ug /ml faloidina Atto 633 (Sigma) à temperatura ambiente no escuro. Depois disso, eles foram lavados novamente cinco vezes com PBS e foram incubadas, em seguida, cinco minutos com 1,5? G /mL de DAPI (Invitrogen) à temperatura ambiente no escuro. Depois de lavar uma vez com microtissues PBS foram trazidos para um slide de objeto com meio de montagem fluorescente (Dako Glostrup, Dinamarca) e foram analisadas num LSM 510 Meta Confocal Microscope (Zeiss).

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

microtissues tumor foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% (Fluka BioChemika) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4). Após uma breve lavagem em PBS, seguido por pós-fixação durante uma hora com 1% de tetróxido de ósmio aquoso (ReagentPlus; Sigma-Aldrich), as amostras foram gradualmente desidratados com etanol. Depois da secagem (CPD 030, Bal-Tec), microtissues foram montadas em bases de alumínio com fita adesiva dupla-face, revestida por borrifamento com 10 nm de ouro /paládio (Au /Pd) (Bal-Tec) e examinadas com uma emissão de campo microscópio eletrônico de varredura (Gemini 982; Zeiss, Goettingen, Alemanha).

secções semi-finas

microtissues tumorais foram processados ​​de acordo com a técnica padrão para microscopia eletrônica de transmissão. Microtissues foram fixadas em fixador de Karnovsky (glutaraldeído a 2,5% e 2% de paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,1 M) durante a noite e, em seguida, lavadas três vezes (10 minutos cada) em tampão de cacodilato 0,1 M, seguido pela fixação com 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato 0,05 M a 4 ° C durante 1 hora. Excesso de tetróxido de ósmio foi removido por lavagem da microtissues três vezes (10 minutos cada) em tampão de cacodilato 0,1 M. Microtissues foram, em seguida, desidratou-se com etanol (2 x 70% de etanol a cada 30 minutos, 2 x 96% de etanol a cada 30 minutos, 2 × 100% de etanol a cada 30 minutos) e acetona (2 × a cada 30 minutos) antes da incubação numa diluição de resina epoxi líquida (Epon mistura do meio: 20 ml incorporar-812, 16 ml DDSA, 8 ml de NMA e 1,2 ml de BDMA; Electron Microscopy Sciences, Munique, Alemanha) e acetona numa proporção de 30% a 70% durante três horas. Os microtissues foram infiltradas com uma mistura de acetona e Epon em partes iguais a 4 ° C durante a noite em frascos fechados. No dia seguinte, o líquido foi substituído por uma mistura de resina epoxi e 70% de 30% de acetona durante três horas. Subsequentemente, microtissues foram incubadas duas vezes em 100% Epon (3 horas e a 4 ° C durante a noite). Em seguida, a resina epóxi pura foi mudado, e as microtissues foram infiltradas com Epon numa câmara de vácuo durante 2 horas. Microtissues foram então transferidas para um molde de incorporação, rotulados e colocados numa câmara de vácuo durante 1 hora adicional. Microtissues foram transferidos para uma câmara de incubação a 60 ° C durante 48 horas para aumentar a polimerização da resina epoxi. seções de um micrômetro foram cortados em um micrótomo Leica Ultracut, corados com azul de toluidina a 60 ° C, e em seguida examinadas usando um microscópio de luz.

Resultados

formação de tumor microtissue

em primeiro lugar, investigou-se a disposição de células de tumor e fibroblastos em esferóides durante o período de cultura. Para este efeito SEM imagens (figura 1) de A549 e Colo699 mono- e co-culturas foram tomadas após dez dias de cultivo. Além disso, A549 /Colo699 mono e co-culturas foram preparadas para as secções semi-finas e corados com azul de toluidina (figura 2)

Sem fotos foram tiradas depois de dez dias:. As monoculturas de A549 e SV80 foram semeadas numa razão de 2500 células /40 ul, ao passo que as monoculturas Colo699 foram cultivadas em forma de 1250 células /40 ul. Todos os co-culturas foram semeadas em uma célula de carcinoma: relação de fibroblastos de 01:02 /40 ul (A549 co-culturas: 2500 células cancerosas +5000 fibroblastos /Colo699 co-culturas: 1250 células cancerosas +2500 fibroblastos). (A /B) monoculturas A549, (C /D) A549 co-culturas; (F /E) monoculturas Colo699, (G /H) Colo699 co-culturas; (/J I) monoculturas SV80. Todos os co-culturas exibida uma superfície mais homogênea e microtissue redondo comparação com monoculturas.

secções semi-finas (1 mm fatias) de A549 /Colo699 mono e co-culturas depois de dez dias de cultivo manchado com toluidina. Bar em todas as imagens: 20 mm. As células A549 formar esferóides robustos que se assemelham a um tecido mais multi-camadas e exibem uma superfície áspera. monoculturas Colo699 revelam uma estrutura esférica com uma superfície solta. Quando os fibroblastos são adicionados ambas as linhas celulares construir uma microtissue mais compacto com uma superfície regular.

Como mostrado na SEM fotos e seções cortes semifinos, células A549 formar esferóides robustos que se assemelham a um tecido mais multi-camadas e exibem uma superfície áspera. Depois de cinco dias microtissues não tinha totalmente formada e foi facilmente rompido durante o procedimento de colheita. Em contraste, quando usado em co-cultura destas células formar esferóides apertados com superfícies lisas. Em secções de cortes semifinos fibroblastos pode ser detectado como células que têm uma morfologia plana dispostos principalmente perto da superfície das microtissues.

Durante o curso das monoculturas Colo699 cultivo revelar uma estrutura esferoidal com uma superfície solta. Quando os fibroblastos são adicionados esses esferóides construir um esferóide mais compacto com uma superfície regular. Como todas as células apresentaram a mesma morfologia, no entanto, as células de tumor e fibroblastos não poderia ser discriminados em secções de cortes semifinos.

Em contraste com as linhas celulares de cancro, fibroblastos SV80 formar pequenas esferóides apertado olhando com uma superfície lisa quando cultivados sozinhos .

Como todas as co-culturas mostrou uma superfície mais homogênea, com uma arquitetura apertado, decidimos examinar se esta depende da produção de ECM das células. Na Figura 3 demonstram que as células estão a produzir significativamente SV80 fibronectina quando cultivadas por si próprios, enquanto que ambas as monoculturas de células de tumor eram completamente negativos para a fibronectina. Em Colo699 co-culturas ECM foi distribuída uniformemente ao longo de todo o microtissue. No entanto, em co-culturas de A549 fibronectina foi segregada principalmente pelas células que acumularam o anel como a estrutura em torno do núcleo interior do microtissue.

A fibronectina foi apresentado no microtissues depois de dez dias. (Bar no A549 monoculturas /SV80: 50 mm, bar em todos os outros microtissues: 100 mm); Secreção de fibronectina pode ser observado em microtissues contendo fibroblastos, enquanto que em todas as monoculturas de células tumorais sem secreção fibronectina pode ser detectado.

Curva de crescimento e estabilidade da microtissues tumorais

Três microtissues de mono . – e co-culturas foram avaliadas por microscopia de luz e depois de cinco, sete e dez dias microtissue volumes foram calculados (Figura 4A)

a: volumes microtissue foram calculados pela fórmula V = 4/3 * Π * R3, em que R = ½ * √ * D1 D2. volumes médios são exibidos em μm3 com seus desvios padrão correspondentes. B: Média e desvio padrão de Ki67 positividade foi calculado pela contagem núcleos de células positivas e negativas Ki67 em fatias de três esferóides diferentes representativamente. Posteriormente, calculou-se a percentagem de núcleos de células positivas para cumber célula inteira. A co-cultura de ambas as linhas celulares tumorais com uma linha celular de fibroblastos levou a uma regulação positiva significativa (p 0,05). De expressão de Ki67 em todos os microtissues

Não foi possível calcular os volumes de esferóides microtissues A549 por causa das monoculturas estas células não formam redonda ou elipsóide esferóides em forma. O mesmo problema evoluiu com os A549 co-culturas que só começou a se formar rodada esferóides mensuráveis ​​após cinco dias. Por conseguinte, o primeiro cálculo de volume de co-cultura A549 foi feito no dia sete, em que um volume de 63 | iM

3 foi medida. Durante o curso de três dias, o volume deste co-cultura aumentou para 81 mm

3.

monoculturas Colo699 exibido um aumento contínuo no volume de 43 mm

3 a f 83 mm

3. Em contraste, Colo699 co-culturas apresentaram um volume de 74 mm

3 após cinco dias com uma diminuição no volume de 39 mm

3

.

Em monoculturas SV80 um volume constante de 33 mm

3 após cinco dias a 27 mm

pôde ser observado 3 depois de dez dias.

Finalmente, os volumes microtissue foram comparados entre si com um t-teste do estudante. Depois de dez dias um aumento significativo do volume pode ser medido em co-culturas de A549 e Colo699 monoculturas quando comparada tanto com monoculturas de SV80 ou co-culturas Colo699. Por outro lado, depois de cinco dias, o volume de Colo699 co-culturas tinha sido significativamente mais elevada em comparação com Colo699 e monoculturas de SV80 (Figura 4A).

Para investigar a viabilidade celular, uma APC Anexina V e iodeto de propídio (PI ) FACS ensaio foi estabelecida. células SV80 foram incubadas com CFSE antes da semeadura, assim, a viabilidade das células e fibroblastos de câncer poderia ser medido de forma independente por discriminação no FACS analisa. Microtissues foram recolhidas, digerido com Accumax e incubadas com PI e Anexina V APC. As análises foram realizadas num sistema BD FACS Calibur. Cada barra representa a viabilidade celular médio de 24 microtissues diferentes medidos em três corridas independentes. Para avaliação estatística do teste t de Student foi utilizado (figura 5).

Os fibroblastos foram incubados com CFSE antes inicialmente semeadura-los juntos com células tumorais na suspensão cai. A apoptose foi medida quer depois de cinco ou dez dias. Cada barra representa a viabilidade celular médio de 24 esferóides e os seus desvios padrão correspondentes que foram medidos em dois ensaios diferentes (As diferenças significativas estão marcadas com *, P 0,05). borrões Dot representam analisa a FACS de uma corrida contendo células A549 em co-cultura com fibroblastos SV80 após dez dias de cultivo. A: viabilidade específicos de células cancerosas em mono-e co-culturas são exibidos. B: viabilidade de fibroblastos solitários em mono e co-culturas são exibidos. C: A distribuição entre os fibroblastos e as células tumorais após cinco e dez dias é apresentada. D: viabilidade microtissue inteiro é mostrado após cinco e dez dias

monoculturas A549 exibido 77% de células viáveis ​​após cinco dias com um aumento mínimo na viabilidade após dez dias para 79%.. Co-culturas com fibroblastos mostraram um aumento significativo na viabilidade de 60% após cinco dias a 79% após dez dias. células Colo699 exibido 93% de células viáveis ​​depois de cinco dias sem diminuição na viabilidade a 92% após dez dias. Em co-culturas de 82% de células viáveis ​​persistiu após cinco dias e 76% após dez dias. Quando a viabilidade das células foi analisada SV80, foi demonstrado um aumento menor de 65% após cinco dias a 67% após dez dias. No entanto, uma diminuição significativa da viabilidade das monoculturas Colo699 Colo699 a co-culturas poderiam ser observado (Figura 5D).

Como próximo passo, a viabilidade das duas fracções diferentes, as células de tumor e fibroblastos foram analisados ​​por discriminar los por citometria de fluxo. células de cancro A549 na co-culturas permaneceram viáveis ​​durante toda a incubação com uma viabilidade de 74% após cinco dias e 71% após dez dias. Em Colo699 co-culturas de um aumento na viabilidade podia ser observada a partir de 78% após cinco a 89% após dez dias, mostrando uma viabilidade significativamente melhor quando comparado com células de cancro A549 co-cultivados após dez dias (Figura 5A).

Uma observação semelhante foi feita sobre a viabilidade de fibroblastos na microtissues. Quando co-cultivadas com as células de cancro A549, células SV80 exibida uma regulação positiva significativa na viabilidade de 46% após cinco dias a 71% após dez dias. Na co-culturas Colo699 a viabilidade também aumentaram significativamente mas não variando entre 70% após cinco a 83% após dez dias. Ao mesmo tempo, uma melhor viabilidade significativa para os fibroblastos quando co-cultivadas em conjunto com células Colo699 após cinco dias pode ser exibido quando comparado com co-culturas de A540 (Figura 5B).

Além disso, a relação entre os fibroblastos e as células tumorais in co-culturas foram analisados ​​depois de cinco e dez dias. Quando co-culturas foram cultivadas na gota em suspensão, as células de fibroblastos e de cancro foram semeadas em sempre uma proporção de 1:2 (2500 células de cancro /5000 fibroblastos). Após cinco dias em ambas as co-culturas poderiam ser observado um quase uma distribuição uniforme entre fibroblastos e células cancerosas, variando de 43% fibroblastos para células tumorais 57% no A549 co-culturas e 49% a 51% na co-culturas Colo699. No entanto, após dez dias significativamente mais células tumorais do que os fibroblastos em ambos os co-culturas poderia ser exibido. Em A549 co-culturas, 19% e, em Colo699 co-culturas foram identificadas 14% de todas as células de fibroblastos (Figura 5C).

organização celular e proteína padrão de expressão

Depois de incubação A549 e células Colo699 sozinhos ou em co-cultura com fibroblastos de cinco e dez dias, a análise imuno-histoquímica foi realizada (figura 5-7 /tabela 2). Vimentina foi escolhido como uma proteína, indicando uma mudança para um fenótipo mesenquimal em células epiteliais. α-SMA expressão indica um fenótipo ainda mais mesenquimais de fibroblastos e reflecte uma mesenquimais para mesenquimal. E-caderina, uma proteína de adesão celular epitelial foi escolhido como um marcador para as células aderentes e Ki67 como uma proliferação celular e marcador de activação. Três esferóides diferentes foram analisados ​​para cada coloração das proteínas e fatias consecutivas de um esferóide são mostrados de forma representativa aqui (figura 7-9)

monoculturas (A) Colo699 Depois de dez dias.; (B) Colo699 co-culturas, após dez dias; DAPI (azul) foi utilizado para a coloração de núcleos celulares, faloidina Atto 633 (vermelho) para a indicação F-actina e CFSE (verde) como uma mancha citoplasmática para fibroblastos (Bar na A /B: 50 mm). Fibroblastos ainda podia ser detectado em microtissues após cinco dias de co-cultura com Colo699

IHC fatias de A549 em mono e co-culturas, após cinco e dez dias (Bar em AD:. 100 mm, bar em Inserir: 25 mm); um aumento da vimentina e uma redução simultânea da E-caderina é apresentada em co-culturas. Também foi detectada uma regulação positiva da expressão de Ki67 em co-culturas

fatias de IHC de Colo699 em mono e co-culturas após cinco e dez dias (Bar em A /C:. 50 mm, barra em B /D: 100 mm, bar em Inserir: 25 mm); Em comparação com monoculturas Colo699 co-culturas formada esferóides muito menores. No entanto, as reações de coloração positivos para E-caderina e vimentina são comparáveis ​​com as monoculturas no período de dez dias. depois de dez dias, porque não foi detectada nenhuma diferença no padrão de coloração entre cinco e dez dias. Microtissues foram completamente positivo para vimentina e Ki67, ao passo que não foi observada expressão de E-caderina e α-SMA

fatias de IHC de SV80 em monoculturas Depois de dez dias (Bar em A: 100 mm).;