Abstract

A proteína isolada a partir da casca de

Crataeva Tapia

(CrataBL) é ao mesmo tempo um inibidor de tipo Kunitz protease planta e uma lectina. Nós determinámos a sequência de aminoácidos e a estrutura tridimensional de CrataBL, bem como caracterizada suas propriedades bioquímicas e biológicas seleccionados. Encontramos duas isoformas diferentes de CrataBL isolado da fonte original, diferindo nas posições 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly), e 97 (Leu /Ser). CrataBL mostrou actividade inibidora relativamente fraca contra a tripsina (K

IAPP = 43 uM) e foi mais potente contra o Factor Xa (K

IAPP = 8,6 uM), mas não foi activo contra um certo número de outras proteases. Confirmámos que CrataBL contém dois locais de glicosilação e forma um dímero numa concentração elevada. As estruturas cristalinas de alta resolução das duas formas cristalinas diferentes de isoforma II verificada a dobra β-trevo de CrataBL e têm mostrado a presença de dímeros que consistem de duas moléculas quase idênticos fazendo contatos extensos (~645 A

2). A estrutura diferente dos das proteínas mais estreitamente relacionados com a falta do β-hairpin N-terminal. Nas experiências destinadas a investigar as propriedades biológicas de CrataBL, mostrámos que a adição de 40 uM de proteína durante 48 h causou inibição do crescimento máxima no ensaio de MTT (47% de células DU145 e 43% de células PC3). A apoptose de células DU145 e PC3 linhas foi confirmada por citometria de fluxo utilizando FITC e iodeto de propídio coloração /anexina V. O tratamento com CrataBL resultou na libertação de citocromo mitocondrial

c

e na ativação de caspase-3 em células DU145 e PC3

Citation:. Ferreira RDS, Zhou D, Ferreira JG, Silva MCC , Silva-Lucca RA, Mentele R, et al. (2013) a estrutura de cristal da

Crataeva Tapia

Bark Protein (CrataBL) e seu efeito em linhas de células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 8 (6): e64426. doi: 10.1371 /journal.pone.0064426

Autor: Enrique Pérez-Payá, Centro de Investigación Principe Felipe e IBV-CSIC, Espanha |

Recebido: 17 de dezembro de 2012; Aceito: 15 de abril de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ferreira et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A utilização de a APS foi apoiado pelo Departamento de Energia, Escritório de Ciência, Instituto de ciências básicas da energia dos EUA sob contrato nº W-31-109-Eng-38. Os autores agradecem a CAPES, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação São Paulo (FAPESP) (Processo 09 /53766-5) pelo apoio financeiro. Este projeto também foi apoiado em parte pelo Programa de Investigação Intramural do National Institutes of Health (NIH), Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Um grande número de proteínas são caracterizadas pela sua dobra β-trefoil [1]. Os membros desta características estruturais compartilhar superfamília mas não necessariamente outras propriedades e seu papel biológico pode ser muito diferentes [2]. Proeminente entre eles são inibidores da protease de plantas do tipo Kunitz, chamados inibidores Kunitz P ou do tipo Kunitz IST [2], [3]. Estas proteínas inibem principalmente proteases de serina, embora alguns também inibem cisteína proteases aspárticas e [4]. inibidores Kunitz P são caracterizadas por massa molecular de cerca de 20.000 Da (por toda a proteína ou um domínio), de baixo teor de resíduos de cisteína, e um ou dois locais reactivos que são a base da sua actividade inibidora. No entanto, algumas proteínas β-trefoil estruturalmente relacionados não são inibidores da protease de todo, mas exibem diversas outras propriedades, por exemplo, ligação [5], alteração do paladar (miraculina) clorofila [6], a ligação a receptores de citocinas (IL-1) [7 ], envenenamento ribossomo (ricina) [8] ou hidratos de carbono de ligação, exemplificado pelo

Clitocybe nebularis

lectina, CNL [9].

lectinas de plantas são proteínas que possuem pelo menos um não-catalítica domínio que se liga de forma reversível e, especificamente, mono ou oligossacarídeos [10], [11]. Devido a estas propriedades, tais proteínas estão a ser utilizada na caracterização dos glicoconjugados e em da superfície celular ou estudos Arquitectura célula-célula [12], [13]. Alguns inibidores da protease também mostram actividade de lectina, um exemplo fornecido pelo inibidor isolado a partir da epiderme da enguia, chamado enguia-CPI-1 [14]. Troncoso et ai. [15] isolado um inibidor com propriedades lectina de

canafístula

sementes que diminui a viabilidade das células de linfoma do rato Nb2.

Crataeva Tapia

(também conhecido como

Crateva Tapia

) pertence à família Capparaceae que é encontrada no nordeste do Brasil. Uma proteína da

Crataeva Tapia

casca foi purificado usando micelas reversas em isooctano [16] e por meio de processos cromatográficos [17]. Nomeado CrataBL (

Crataeva Tapia

Bark lectina), foi mostrado essa proteína possuir alguma especificidade para glicose e galactose [17] vinculativo. Um certo número das suas propriedades biológicas têm sido caracterizados, incluindo o atraso na formação de coágulos através da alteração da via intrínseca da coagulação em cascata [18]. Além disso, CrataBL foi demonstrado exibir anti-inflamatória, analgésica [19], insecticidas [17], anti-tumoral e [19] actividades.

O cancro da próstata é o cancro mais comum em homens [20], com DU145 e PC3 sendo as linhas de células de câncer de próstata mais estudados que servem como

in vitro

modelos para estudos de tratamento de câncer [21], [22], [23]. O cancro da próstata é associada com um nível elevado de expressão de proteases [24] e glicoproteínas [25], fazendo CrataBL um instrumento potencialmente útil para estudos envolvendo linhas de células de cancro da próstata, devido à sua combinação de propriedades que incluem tanto a inibição de protease e de ligação de hidratos de carbono.

neste trabalho, determinou-se a sequência de aminoácidos e a estrutura tridimensional de CrataBL e também investigada uma variedade de actividades bioquímicas, comparando-as com as propriedades de outros membros desta superfamília. Posteriormente, caracterizamos o efeito de CrataBL no crescimento e estabilidade de linhagens de células de câncer de próstata humano.

Materiais e Métodos

Isolamento de CrataBL

O isolamento da proteína foi realizada de acordo para o procedimento de Araújo et ai. [17]. Resumidamente, 10% (w /v) os extratos de

Crataeva Tapia

casca foram fracionados com sulfato de amônio 30-60%. A fracção contendo a proteína foi dialisada contra 10 mM de tampão citrato de fosfato, pH 5,5 e aplicado a uma coluna de CM-celulose equilibrada com o mesmo tampão. proteína adsorvida foi eluida com um tampão de equilíbrio contendo NaCl e conteúdo do único pico a 0,5 M foram submetidas a cromatografia de exclusão por tamanho em Superdex 75 coluna, equilibrada em NaCl 0,15 M utilizando um purificador ΔKTA (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Isto foi seguido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) numa coluna C18, para confirmar a homogeneidade da amostra. As eluições foram monitorizados a 280 nm.

A concentração de proteína e de hidratos de carbono ensaios

Determinação da proteína foi realizada como descrito por Lowry et ai. [26] utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. O teor de açúcar de CrataBL foi determinada pelo método do ácido fenol-sulfúrico de Masuko et al. [27], com manose, a concentrações de 2, 4, 6, 8, e 10 ug como um padrão.

MALDI-TOF /MS

A massa molecular de CrataBL foi analisada pela MALDI-TOF /MS. 1 uL CrataBL (2 mg /mL) foi adicionado a 1 mL de α-ciano-4-hidroxicinâmico solução matriz de ácido (10 mg /mL), manchada sobre uma placa alvo de MALDI de aço inoxidável e seca à temperatura ambiente antes da análise. Os espectros de massa foram obtidos com um instrumento Bruker Daltonics Microflex LT (Billerica, EUA) a operar no linear, modo de ião positivo, previamente calibrada com insulina, ubiquitina, citocromo C, e mioglobina. Para a análise da proteína, os espectros de massa foram adquiridos utilizando os seguintes parâmetros do instrumento: ião pulsado atraso de extracção de 30 ns, a tensão de uma fonte de iões, 20 kV, tensão da fonte de iões de duas, 18,65 kV, e a tensão de lente fonte de iões de 7,1 kV. Para cada amostra, os espectros de massa foram adquiridos por acumulando 50 disparos de laser na potência do laser de 50% no intervalo de m /z de 8.000-25.000 Da.

A estrutura primária de CrataBL

A sequenciação do proteína nativa foi realizada por degradação de Edman [28]. A amostra foi reduzido, alquilado, e em seguida submetidos a digestão com tripsina, quimotripsina, Asp-N e Lys-C endopeptidases (grau de sequenciação, Roche, Alemanha). Os fragmentos resultantes do tratamento com endopeptidases foram purificados em um 1 × 150 mm de coluna Júpiter Proteo 90A (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemanha) com um caudal de 0,1 mL /min, utilizando um gradiente de acetonitrilo (0-60%) com 0,1% ( v /v) de ácido trifluoroacético durante 40 min. A sequenciação foi realizada num sequenciador de fase gasosa automático (492cLC; Applied Biosystems, Foster City, EUA). Os péptidos glicosilados foram analisados ​​por espectrometria de massa para determinar a massa molecular das porções hidrato de carbono. similaridades entre as seqüências foram avaliados com o programa BLAST contra o banco de dados de proteínas NCBI [29]. As sequências foram alinhadas utilizando o programa MULTALIN [30].

Os ensaios de inibição da enzima

A actividade inibidora contra as proteases de CrataBL foi medida utilizando substratos cromogénicos ou f luorogénicos específicos em placas de microtitulação de 96 poços a 37 ° C. As enzimas (Factor Xa humano, tripsina bovina, quimotripsina bovina, humana calicreína do plasma (huPK), a calicreína pancreática porcina (POPk), elastase de neutrófilos humanos (HNE), plasmina humana e papaína) foram pré-incubadas ou com CrataBL ou com solvente durante 10 min. As reacções foram iniciadas pela adição dos substratos, e a cor ou fluorescência foram monitorizadas continuamente a 405 nm utilizando um espectrofotómetro (Packard, SpectraCount), ou pelo 380/460 nm utilizando um Hitachi F-2000 espectrofluorímetro (Tóquio, Japão), respectivamente, durante 30 min, e parada com a adição de 50 mL de 30% (v /v) de ácido acético. actividades enzimáticas foram analisadas nos seguintes tampões (concentrações finais): factor humano Xa (21 nM em Tris-HCl 0,02, pH 7,4, contendo 0,14 M de NaCl, CaCl 5,0 mM

2 e 0,1% de albumina de soro de bovino; Boc 0,57 mM -Ile-Glu-Gly-Arg-AMC); tripsina bovina (40 nM em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 contendo 0,02% (v /v) de CaCl

2; 0,8 mM de Bz-Arg-PNAN); quimotripsina bovina (88 nM em Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0; 0,8 mM de Suc-Phe-PNAN); HuPK (14,7 nM em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,5 M; 0,4 mM de H-D-Pro-Phe-Arg-PNAN); POPk (2,6 nM em Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0; 0,16 mM de HD-Val-Leu-Arg-PNAN); HNE (1,3 nM em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,0, contendo NaCl 0,5 M; 0,88 mM de MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-PNAN); plasmina humana (3,5 nM em Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, contendo NaCl 0,2 M; 0,9 mM de HD-Val-Leu-Lys-PNAN) e papaína (87 nM em 0,1 M de Na

2HPO

4, pH 6,3 contendo 0,4 M de NaCl, 0,01 M de EDTA; 0,4 mM de Z-Phe-Arg-PNAN). As

valores IAPP aparentes de K foram determinados ajustando os pontos experimentais à equação para lenta estanque ligação [31] com a ajuda do programa Grafit, versão 4.0 (Erithacus Software, Staines, UK) [32].

determinação local reactivo por cromatografia de afinidade sobre a tripsina-Sepharose

uma amostra contendo 1,8 mg de proteína em 0,1 M de tampão Tris-HCl pH 8,0 foi aplicado a uma coluna de 1,0 ml de tripsina-Sepharose equilibrada com o mesmo amortecedor. O inibidor foi eluído por M KCl /HCl, pH 2,0 a 0,5 e mantido neste pH até que o passo de determinação do terminal N.

cristalização de proteínas

Uma amostra de proteína altamente purificada a partir de um pool de Superdex 75 coluna foi dialisado contra um tampão consistindo em Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, e 3% de glicerol, e, em seguida, foi concentrada até 8,5 mg /ml utilizando unidades de filtro de centrífuga (Millipore, Billerica, MA). ensaios de cristalização iniciais foram realizadas utilizando um robô Phoenix (Art Robbins Instruments, Mountain View, CA). Um número de acertos foram obtidos a partir de várias telas diferentes de cristalização [JCSG (Qiagen, Valencia, CA), Crystal HT Screen, Index (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), e Wizard1-2 (Emerald Biosystems, Bedford, MA)]. cristais de qualidade de difração foram obtidas a partir de telas JCSG-CORE-II D12 (0,2 M Li

2SO

4, 30% PEG3350) e do G8 (sulfato de 0,16 M de amónio, 0,08 M ​​de acetato de sódio pH 4,6, 20% PEG4000, 20 % de glicerol). Cristais apareceu no segundo dia e cresceu para o tamanho total dentro de alguns dias a 20 ° C.

raios-X de coleta de dados e processamento

Os dados de difracção foram recolhidos na equipa Sudeste Regional Acesso Collaborative (SER-CAT) beamline 22-ID no avançada Photon Source, Argonne National Laboratory. Os cristais individuais foram transferidas para uma solução crioprotectora (licor mãe com extra de glicerol 10-20%) durante aproximadamente 2 minutos e depois foram rapidamente congelados em 100 K em uma corrente de azoto líquido. Um cristal de raios-X difratados JCSG-CORE-II condição G8 (formulário denominado I) para a resolução de 1,5 Å. Os dados de difracção foram indexados, integrado, e escalado com o programa XDS [33]. O cristal pertence ao grupo de espaço

C

2 com parâmetros de célula unitária a = 114,9 Â, b = 46,2 Â, c = 71,5 A, β = 103,4 ° C e contém um dímero de CrataBL na unidade assimétrica. O coeficiente de Matthews estimado é de 2,26 Å

3 Da

-1, correspondendo a 45,5% de teor de solvente. Um cristal de JCSG-CORE-II D12 condição (denominada forma II) diffracted raios-X para a resolução de 1,75 Å. Os dados de difracção também foram processados ​​no programa XDS. O cristal também pertence ao grupo de espaço

C

2, mas com diferentes parâmetros de célula unitária a = 95,6 Â, b = 76,3 Â, c = 62,3 Â, β = 120,1 °, com um único dímero na CrataBL unidade assimétrica. O coeficiente de Matthews estimado é de 2,66 Å

3 Da

-1, correspondendo a 53,9% de teor de solvente. estatísticas de processamento de dados para ambas as formas cristalinas são apresentados na Tabela 1.

para definir solidez e requinte

A estrutura do CrataBL foi inicialmente determinada usando dados de difração da forma cristalina I e da consequente coordenadas foram subsequentemente utilizado como modelo de partida para a substituição molecular, com os dados recolhidos para a forma cristalina II. A estrutura de CrataBL foi resolvida por substituição molecular, com o programa Phaser [34], [35] utilizando a estrutura da proteína clorofila solúvel em água (PDB ID: 2DRE) como modelo de partida. A última proteína foi escolhida devido à sua maior identidade estrutura primária com CrataBL ( 30%). Uma solução única que representa duas moléculas na unidade assimétrica foi encontrado para dados entre 20,0 e 2,5 Å, com um ganho Log-Probabilidade de 122,3. O mapa de densidade de elétrons resultante era totalmente interpretável, a verificação da exatidão da solução. Refinamento foi realizado com REFMAC5 [36] e PHENIX [34], utilizando todos os dados entre 20 e 1,5 Å, após a anulação de 2% de reflexões selecionados aleatoriamente (total 1172) para o cálculo de R

livre [37]. fatores de temperatura individuais isotrópicas foram refinado, com os parâmetros TLS adicionados na fase final de refinamento. Depois de vários outros ciclos de refinamento automatizada e correção manual usando GALEIRÃO [38], o modelo estrutural foi finalmente refinada para um factor-R de 17,3% e R

livre de 20,8%. A estrutura da forma cristalina II foi resolvido com Phaser eo formulário I coordenadas como o modelo de partida; seu refinamento foi realizada utilizando um protocolo semelhante ao descrito para a forma cristalina I. O modelo final foi refinado para resolução de 1,75 Å, resultando em um factor-R de 18,5% e R

livre de 23,2%. As estatísticas de refinamento para as estruturas de CrataBL nas duas formas de cristal são apresentadas na Tabela 1. As estruturas foram comparados usando o servidor Dali [39] com o conjunto de estruturas de proteína banco de dados com menos de 90% de identidade de sequência.

ensaio de viabilidade celular

linhas celulares.

As linhas celulares DU145 (HTB-81 ™) e PC3 (CRL-1435 ™) foram adquiridas da ATCC. As células foram mantidas no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 100 ug /mL de estreptomicina e 100 IU /mL de penicilina, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio colorimétrico modificado utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA). Ou DU145 PC3 foram plaqueadas em placas de 96 poços (TPP, Trasadingen, Suiça) com uma densidade de 5,0 x 10

3 células por poço, durante 24 h. Subsequentemente, as células foram tratadas com diferentes concentrações de CrataBL (5, 10, 20, e 40 uM) ou inibidor de tripsina de soja (SBTI) (5, 25, 50, 100 ^ M) preparada em meio RPMI a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2. Depois de 24, 48, e 72 h de cultura, 10 mL de MTT (5 mg /ml em salino tamponado com fosfato, PBS) foram adicionadas aos poços (2 h, 37 ° C), seguido pela remoção do meio e adição de 100 ul /poço de dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) para solubilizar os cristais de formazano. A absorvância foi medida a 540 nm utilizando um espectrofotómetro (Packard, SpectraCount). Cada experiência foi realizada em triplicado.

análise de morte celular por citometria de fluxo

DU145 e PC3 (células 1 x 10

5 células) foram semeadas em placas de 6 poços (TPP, Trasadingen , Suíça) durante 24 h, para aderência completa. Os poços foram subsequentemente lavadas três vezes com meio RPMI sem FBS (em períodos de incubação de 15 min a 37 ° C e 5% de CO

2). As células foram incubadas durante 24 h em meio RPMI sem FBS para sincronizar o ciclo celular. Em seguida, as células foram tratadas com CrataBL (40 uM) durante 24 e 48 h em meio RPMI sem FBS a 37 ° C e 5% de CO

2. No final de cada incubação, as células foram removidas a partir da placa, utilizando uma solução de tripsina-EDTA (Cultilab, Campinas, Brasil) [40], transferido para citometria tubos, lavou-se com 500 uL de tampão de ligação (BD kit de PharMingen), centrifugou-se, e ressuspensas em 50 uL do mesmo tampão contendo também 3 uL de anexina V-FITC e 5 mL de iodeto de propídio (PI). A mistura de reacção foi incubada durante 30 min no escuro, e, em seguida, 300 ul do mesmo tampão de ligação foi adicionada a cada tubo e analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD, San Diego, EUA) [41], [42].

Análise do citocromo mitocondrial C libertação

DU145 e PC3 células foram semeadas em lamelas de vidro de 13 mm (5 × 10

4 células /cavidade), colocados em placas de 24 poços e incubadas durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO

2 para a adesão completa. As células foram subsequentemente incubadas em meio RPMI sem FBS durante 24 h, seguido por tratamento com 40 uM CrataBL no meio RPMI sem FBS, e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 12 h. No final do tratamento, as células foram lavadas com PBS e as mitocôndrias foram marcadas com Mitotracker vermelho escuro 633 (1:500) (Molecular Probes) durante 20 min no escuro e fixado com 2% (v /v) em paraformaldeído PBS durante 15 min. As células foram novamente lavadas três vezes com PBS contendo 0,01 M de glicina e depois permeabilizadas com 0,01% de saponina durante 15 min. As células foram subsequentemente coradas durante 2 horas com o anticorpo primário, rato c anti-citocromo (1:400) (R D Systems), seguido por coloração durante 40 min com o anticorpo secundário, de ratinho anti-IgG conjugado com Alexa Fluor 488 (1:500) (Invitrogen, CA, EUA). núcleos de células foram marcadas com o fluororo DAPI (1:3000) (Invitrogen, CA, EUA) durante 30 min e, em seguida, fixados em lâminas com 7 uL de Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences). Visualização e medições das lâminas de fluorescência foram realizadas num modelo de laser confocal Carl Zeiss LSM780 microscópio de varrimento, 63 × objectivo, usando imersão em óleo e uma abertura numérica de 1,43. O programa utilizado para a aquisição de imagem foi Zen 2010.

caspase 3 atividade por citometria de fluxo

DU145 e PC3 células (1 × 10

5 células) foram semeadas em cada poço de uma 6 -bem placa (TPP, Trasadingen, Suiça) contendo meio RPMI suplementado com FBS a 10% para a aderência. As células foram então lavadas três vezes com meio RPMI sem FBS e incubadas por 24 h. Vinte e quatro horas mais tarde o meio foi substituído com 40 uM de CrataBL e ainda incubadas durante 48 h a 37 ° C e 5% de CO

2. No final do tratamento, as células foram removidas a partir da placa, utilizando uma solução de tripsina-EDTA (Cultilab, Campinas, Brasil) [40], transferido para citometria tubos e fixadas com 100 ul de 2% (v /v) de paraformaldeído durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram ressuspensas após centrifugação em 200 mL de 0,01% de glicina em PBS e incubadas durante 15 min à temperatura ambiente. As células foram então ressuspensas novamente em 200 mL de 0,01% de saponina em PBS e incubadas durante 15 min à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram incubadas com 10 uL de caspase 3 clivada anticorpo conjugado 488-AlexaFluor (BD, San Diego, EUA) durante 40 min. Os resultados foram analisados ​​por citometria de fluxo. (FACSCalibur – BD, San Diego, EUA)

A análise estatística

As diferenças entre os valores médios foram analisados ​​usando um one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os valores foram considerados significativos quando *

P

0,05; **

p Art 0,01; ***

p

. 0,001

deposição de dados

As coordenadas atômicas e fator de estrutura foram depositados junto do Protein Data Bank, www.rcsb.org (PDB códigos de adesão 4IHZ e 4II0 para formas cristalinas I e II, respectivamente). Os dados da sequência da proteína aqui relatados aparece na base de conhecimento UniProt sob os números de adesão B8WI86 e C0HJA4.

Resultados e Discussão

Purificação de CrataBL e avaliação das suas actividades

CrataBL é uma proteína básica (pi 10) que pode ser purificado de uma forma relativamente simples [17]. Os passos iniciais envolvidos extracção no seio de NaCl 0,15 M e cromatografia de permuta iónica em CM-Celulose (Figura 1A). cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna Superdex 75 (Figura 1B) permitiu a purificação da proteína numa forma homogénea adequada para estudos estruturais, com apenas um único pico principal visível após cromatografia de fase reversa numa coluna C

18 coluna de HPLC (Figura 1C ). proteína nativa migra principalmente como um homodímero para a concentração utilizada nos ensaios de cristalização (ver abaixo).

(A) A fracção de 30-60% foi submetida a cromatografia de permuta iónica em CM celulose equilibrada com 10 mM de fosfato tampão citrato (PCB), pH 5,5. Duas fracções ml foram recolhidas a um caudal de 0,3 mL /min. Uma seta indica a eluição com 10 mM de tampão citrato de fosfato, pH 5,5, contendo NaCl 0,5 M; A cromatografia de exclusão de tamanho (B) em Superdex 75, equilibrada com NaCl 0,15 M a uma taxa de fluxo de 0,5 mL /min. (C) A fracção de proteína foi eluída com um gradiente linear (5-100%) de 90% de acetonitrilo em TFA a 0,1% em água Milli-Q (solvente B) a uma taxa de fluxo de 0,7 mL /min (

t

= 0,1 min, 5% de B;

t

= 5 min, 5% de B;

t

= 30 min, 40% B;

t

= 50 min , 50% B;

t

= 60 min, 100% B;

t

= 65-68 min, 0% B)

A lectina e hemaglutinante. actividades de CrataBL foram anotados anteriormente [17] e estas propriedades não foram ainda analisados. No entanto, nós avaliamos a capacidade de CrataBL funcionar como um inibidor de protease. Descobrimos que ele poderia inibir tripsina bovina e o factor Xa, mas não há outras peptidases de serina, incluindo a quimotripsina, plasmina, elastase de neutrófilos humanos, a calicreína plasmática humana, calicreína pancreática de porco, ou uma protease papaína cisteína (Tabela 2). K

iapp, calculado usando a equação descrito por Morrison et al. [32], foi de 43 uM para a tripsina e 8,6 uM para o factor Xa, o que indica que CrataBL é um inibidor relativamente fraco, e muito menos potente do que alguns outros inibidores que pertencem à mesma família que são frequentemente nanomolar do mesmo picomolar [43], [ ,,,0],44].

A estrutura primária, glicosilação, e as propriedades bioquímicas de CrataBL

A estrutura primária da madura CrataBL consiste em um único polipeptídeo 164 ou 165 aminoácidos de comprimento, presente em, pelo menos, duas isoformas distintas, diferindo nas posições 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly), e 97 (Leu /Ser) (Figura 2). O Gly165 C-terminal pode estar presente em apenas uma fracção das moléculas. A presença de cinco resíduos de cisteína indicou uma possibilidade de formação de duas ligações dissulfureto intramoleculares, a presença do qual foi verificada por as estruturas de cristal (ver abaixo).

Uma comparação da sequência de aminoácidos da isoforma I da com CrataBL as sequências de proteínas estruturalmente semelhantes, tal como determinado com o programa Dali [39]. Os resíduos de cisteína são apresentados em caixas pretas e aminoácidos altamente conservados estão destacados a cinzento. posições de resíduos de P1 e P1 ‘, entre as quais a clivagem proteolítica ocorre, são indicadas no quadro. Os asteriscos indicam sítios de glicosilação em CrataBL. A seqüência de isoforma II difere em posições 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) e 97 (Leu /Ser).

Araújo et al. [17] estimativa da massa molecular de cerca de 21 a CrataBL KDa em SDS-PAGE e têm mostrado por coloração de Schiff que a proteína seja glicosilada. Uma análise mais aprofundada de glicosilação por determinação espectrometria de massa e a sequência de proteína tem mostrado a presença de oligossacáridos ligados a N em Asn27 e Asn57. A análise MALDI-TOF MS a massa molecular da proteína nativa deu um pico a m /z 20388, com um ombro a cerca de 19700 (M + H)

+, indicando a presença de uma isoforma. Um pico adicional de 10.229 é devido ao ião molecular (M + 2H)

+ (Figura 3). O método do fenol-ácido sulfúrico [27] foi usada para determinar a concentração de hidratos de carbono na proteína, indicando ~ 6% de teor de hidrato de carbono.

A massa molecular de porções hidrato de carbono foram estimados por as diferenças entre o espectrometria de massa dos péptidos glicosilados e suas sequências de aminoácidos. No caso de a Asn57, o peso molecular é mostrado para ser 1170 Da enquanto que a Asn27, sinais adicionais de 162 Da ou mais foram detectadas (dados não mostrados).

As sequências de ambas as isoformas de CrataBL mostram alta semelhança com uma variedade de proteínas com dobra β-trevo (Figura 2), incluindo inibidores Kunitz tipo a partir da soja (STI) inibidores de tripsina da família [45]. Tal função de inibidores por força de ligação para a sua protease alvo e inserindo o seu laço reactivo no seu sítio activo, por vezes, também actua como substratos lentas [2].

A localização do local reactivo de CrataBL foi determinada por cromatografia em tripsina -Sepharose em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. Após a ligação ao suporte, em que o inibidor foi mantida durante 30 minutos na coluna e, em seguida, foi eluída com M KCl /HCl 0,5 pH 2,0 e mantida a este pH. Tripsina ligada a Sepharose hidrolisa especificamente o inibidor no local reactivo e a amostra foi mantida em condições escolhidas para evitar a re-ligação do péptido de ligação. A proteína modificada resultante foi sequenciado e dois aminoácidos N-terminal foram encontrados no eluato, uma delas correspondente à Ala1 N-terminal do inibidor intacto, enquanto que o outro pode ser identificado como Ser59. Este resultado indica que este resíduo tem de estar presente na posição P1 ‘, tal como definido por Schechter e Berger [46], assim Ser58 deve ocupar a posição P1. Os inibidores de tripsina mais potentes geralmente contêm um resíduo básico (Lys ou Arg, tal como Arg63 no IST [44], [45]) na posição P1. Apenas alguns inibidores Kunitz P conhecidos têm Ser na posição P1 [47], mas verificou-se que a presença de serina em P1 ‘aumenta as interacções com tripsina [48]. O local de clivagem observada de CrataBL corresponde ao lacete reactivos na maioria dos inibidores de tipo Kunitz conhecidos P, tais como STI [44] (Figura 4).

Uma comparação da sequência de aminoácidos da isoforma I de CrataBL com as sequências de BvTI – inibidor de tripsina purificada a partir de

Bauhinia variegata

; Buxi – inibidor do factor Xa de

Bauhinia ungulata

; ECTI – inibidor de tripsina purificada a partir de

Enterolobium tripsina inibidor

[42], [43]. Os resíduos de cisteína são mostradas a cinzento e aminoácidos altamente conservados estão realçadas em preto. Resíduo posições P1 e P1 ‘, entre as quais a clivagem proteolítica ocorre, são indicados em caixas. Os asteriscos indicam locais de glicosilação em CrataBL.

A estrutura de cristal de CrataBL

A estrutura tridimensional do CrataBL foi determinada em duas formas cristalinas. Ambos estavam no grupo de espaço

C

2 e continha duas moléculas na unidade assimétrica, mas os parâmetros de célula unitária e embalagens de cristal eram diferentes. As estruturas foram refinadas a comparativamente alta resolução, 1,5 Å de forma cristalina I e 1,75 Å para a forma cristalina II, com parâmetros geométricos aceitáveis ​​(Tabela 1). Os modelos finais foram completo para todas as quatro moléculas independentes com resíduos 1-164 rastreados. A presença de carboxilato C-terminal muito bem definido na molécula A da forma cristalina I sugere que o último resíduo foi Ser164 e Gly165 que, embora anotada na estrutura primária, não estava presente na proteína de cristal (Figura 5). Embora, como mencionado acima, CrataBL isolado da sua fonte natural é uma mistura de isoformas, parece que principalmente moléculas de isoforma I foram cristalização, uma vez que a densidade de electrões correspondente aos resíduos que diferem entre as duas isoformas foi bastante clara. glicosilação extensa em Asn27 foi observado, com até quatro unidades de hidrato de carbono ligado a esse resíduo ser visível. A melhor densidade estava presente na molécula A de forma cristalina I, onde o padrão típico do tipo planta glicosilação [Manβ1-4GlcNAcβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ-Asn] [49] pôde ser observado. Os hidratos de carbono foram menos bem ordenada em outras moléculas de ambas as formas cristalinas. Uma densidade fraca que poderia corresponder a um hidrato de carbono ligado a Asn57 na forma de cristais que não permitir a modelação adequada. Na forma cristalina II, no entanto, a densidade adjacente para Asn57 foi bastante clara e permitiu modelagem de um GlcNAc ligado covalentemente. Duas pontes dissulfeto foram feitas por Cys33-Cys80 e Cys126-133, enquanto Cys74 estava presente em todas as moléculas na forma de ácido Sulfênicos.

O 2F

de

c mapa foi contornado em 1,2 σ nível. A forma da densidade correspondente ao carboxilato C-terminal indica claramente que Gly165, embora encontrados na sequência, não se encontra presente na isoforma formando o cristal. Figura preparado com PyMOL [69].

A dobra de CrataBL consiste de uma β-trefoil, típicos desta família de proteínas. Zhang et al.