Abstract

Fundo

A toxina da difteria (DT) tem sido utilizada como um agente anti-câncer potencial para a entrega alvo de terapia citotóxica a neoplasia de outra forma intratável. DT é uma toxina extremamente potente para o qual a entrada de uma única molécula numa célula pode ser letal. DT foi alvejado a células cancerosas por exclusão do domínio de ligação do receptor de células e a combinação da porção restante catalítica com segmentação proteínas que se ligam selectivamente à superfície de células cancerosas. Assumiu-se que “receptorless” DT não se pode ligar a e matar células. No presente estudo, relatamos que “receptorless” DT385 recombinante é de fato citotóxica para uma variedade de linhas celulares de cancro.

Métodos

In vitro

citotoxicidade de DT385 foi medido pela proliferação de células, das células coradas e ensaios de apoptose. Para

In vivo

estudos, o sistema de membrana corioalantóica de pintainho (CAM) foi usada para avaliar o efeito de DT385 na angiogénese. O sistema de CAM e modelo de ratinho foi utilizado para avaliar o efeito de DT385 em (LLC) e o crescimento do tumor HEp3 de carcinoma do pulmão de Lewis, respectivamente.

Resultados

Das 18 linhas de células de cancro humano testadas, 15 foram afetados pelo DT385 com IC

50 que varia 0,12-2,8 M. Além disso, altas concentrações de DT385 não afetou as células de crescimento preso. A toxicidade celular de DT385 era devido à inibição da síntese de proteínas e a indução de apoptose.

In vivo

, DT385 diminuiu angiogênese e diminuiu o crescimento de tumores no sistema CAM, e inibiu o crescimento subcutânea de LLC tumores em camundongos.

Conclusão

DT385 possui anti-angiogênico e actividade anti-tumoral e podem ter potencial como agente terapêutico

citação:. Zhang Y, W Schulte, D-de-rosa, Phipps K, Zijlstra a, Lewis JD, et ai. (2010) A sensibilidade das células cancerosas para truncado Difteria toxina. PLoS ONE 5 (5): e10498. doi: 10.1371 /journal.pone.0010498

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de novembro de 2009; Aceito: 14 de abril de 2010; Publicado em: 05 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nova Scotia Health Research (NSHRF). YZ é apoiado por uma bolsa de estudo do Programa de Treinamento de Pesquisa do Câncer, da Universidade Dalhousie. JDL é suportado por Grant # 018176 do Fox Foundation NCIC /Terry. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a toxina da difteria (DT) é sintetizado em

Corynebacterium diphtheriae

como uma enzima de cadeia simples de 535 aminoácidos com um peso molecular de 63.000 [1], [2]. DT consiste de três domínios principais: o amino-terminal de C, ou catalíticas, de domínio (resíduos 1-186); o t intermediário, ou transmembranar, domínio (resíduos 202-381); e o carboxi-terminal de R, ou de ligação a receptor, de domínio (resíduos 391-535). O domínio catalítico é ligado ao domínio T por um laço rico em arginina e uma ponte dissulfureto prontamente redutível (ligando C186 a C201). DT foi mostrado para entrar nas células de mamíferos sensíveis à toxina por endocitose mediada por receptores que envolve a interacção do domínio de ligação ao receptor da proteína com um precursor da superfície celular transmembranar do factor de crescimento de tipo factor de crescimento epidérmico de ligação de heparina [3] , [4]. Depois de se ligar a este receptor da superfície celular, DT é sujeita a endocitose e de tráfico para um compartimento vesicular ácida, onde se submete a um pH-dependente conformacional mudança, clivagem e libertação do domínio catalítico. O domínio T insere-se na membrana vesicular e o canal resultante é utilizado para a translocação do domínio catalítico para o citosol. Ali, a subunidade catalítica catalisa a ribosilação do ADP do factor de alongamento 2, resultando em inibição da síntese de proteína e de morte celular (revisto em [5]).

Um número de proteínas recombinantes truncados, DT foram produzidos em que o domínio de ligação ao receptor tem sido geneticamente substituído por ligandos que podem direccionar selectivamente células malignas. Estas proteínas de fusão representam uma nova classe de agentes citotóxicos que, ao contrário chemotherapeuticDT foi mostrado para entrar nas células de mamíferos sensíveis à toxina por endocitose mediada por receptores que envolve a interacção do domínio de ligação ao receptor da proteína com drogas, matar células alvo de inibição a síntese de proteínas e, assim, induzir apoptose [6]. Estas proteínas de fusão incluem DT508-MSF [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] – [13], DT388 -IL-3 [14], [15], o VEGF-DT385 [16], [17] e DT388 combinado com o domínio de ATF do uPA [18]. Entre as drogas resultantes, DT388IL-3 tem mostrado alguma promessa em ensaios clínicos [19], [20], enquanto que a toxina DT389-IL-2 recombinante (DAB389-IL-2, denileucina diftitox-Ontak) foi aprovado pela FDA para uso clínico no linfoma de células T cutâneo avançado fase (revisto em [21] – [23]

é amplamente aceite que a eficácia das proteínas de fusão DT reside na capacidade de o componente de ligando de direccionamento para. dirigir a DT para as células cancerosas, resultando em toxicidade celular alvo. Além disso, é esperado que a remoção do domínio de ligação ao receptor DT para resultar em uma DT truncada que é incapaz de interagir com o seu receptor na superfície das células eucarióticas e portanto incapaz de se ligar de e para matar as células. Este conceito foi reforçado pelo relatório que o DT truncada (DT385) não é citotóxico [16].

no presente estudo, mostramos que contrariamente aos relatórios anteriores, o recombinante DT truncada , DT385 é citotóxica para muitas células cancerosas. observamos também que DT385 inibe o crescimento de tumores humanos e de rato. Nossos resultados estabelecer a eficácia da DT385 como um potencial agente antitumoral.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram obtidos a partir de aplicações celulares, Inc. e cultivadas num meio de crescimento de células endoteliais com suplementos completos de crescimento celular (Aplicações, Inc.). células da artéria pulmonar bovina endoteliais (BPAEC) e células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) foram obtidos a partir de Lonza e foram cultivadas em meio EBM mais EGM SingleQuots de suplementos de crescimento e EBM 2-meio mais EGM-2 SingleQuots de suplementos de crescimento (Lonza) , respectivamente. linhas de células de glioma U-87 MG e U251 foram gentilmente fornecer pelo Dr. V. Wee Yong (University of Calgary, Calgary, Alberta, Canadá). A linha de células de carcinoma epidermóide humano HEp3 foi uma oferta generosa do Dr. Andries Zijlstra (Universidade Vanderbilt, EUA). fibroblasto embrionário células (MEF) de rato foram isoladas a partir de embriões de rato e foram utilizados nas suas passagens iniciais (menos de passagem 4). U-87 MG de células, U251, HEp3 e MEF foram cultivadas em DMEM contendo 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen) e 1% de penicilina-estreptomicina misturas (Invitrogen). Todas as outras linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e foram cultivadas em DMEM, MEM ou RPMI (Invitrogen) contendo misturas de penicilina-estreptomicina a 10% (v /v) de soro fetal bovino e 1% de acordo com a instruções da ATCC. Todas as células foram cultivadas num incubador a 37 ° C que contém 5% de CO2. Todas as células endoteliais e células de fibroblastos primários foram mantidas e utilizadas antes da nona passagem.

Indução e purificação de proteínas recombinantes

O plasmídeo pET17b-DT385 expressando “receptorless” DT385 foi generosamente fornecidos pelo Dr. Sundaram Ramakrishnan (Departamento de Farmacologia da Universidade de Minnesota Medical School, Minneapolis, MN). O plasmídeo pET17b-p22 foi construído por clonagem de fragmento p22 plasminogénio humano em pET17b (Merck Biosciences) aos locais de restrição Ndel e BamHI. O plasmídeo plic-DT385-p22 foi construído por clonagem do plasminogénio fragmento p22 humana no plasmídeo plic-DT385 para os sítios de restrição Ncol e HindIII, enquanto o plasmídeo plic-DT385 foi construído através da inserção de ADN que codifica para DT385, mas a que falta o codão de paragem para o pET -30 EK /vector LIC seguindo o protocolo do fabricante (Novagen). O plasmídeo que codifica a pSUMO ADNc para SUMO (pequena modificador relacionados com ubiquitina, Saccharomyces cerevisiae, o gene Smt3) foi gentilmente cedido pelo Dr. Kaisong Zhou (Dalhousie University). Todas as construções de plasmídeos foram confirmadas por sequenciação de ADN (DalGEN, o serviço de sequenciação do ADN Dalhousie University). p22 recombinante, SUMO, DT385, e DT-p22 foram expressas em

E. coli

e purificado por coluna de Ni-NTA de afinidade (Qiagen), reunidas e dialisadas durante a noite contra tampão fosfato salino (PBS). Todas as proteínas recombinantes foram purificados como uma banda única, conforme revelado por análise de SDS-PAGE. LPS foi removido a partir de proteínas purificadas utilizando contas de sulfato de polimixina B (Detoxi-Gel Gel Remoção de endotoxina, Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. Múltiplas passagens através da coluna foram realizados até que o LPS foi nível

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada pela celular Titer96 Uma célula de solução aquosa Ensaio de Proliferação (ensaio MTS menos de 30 UE /mg. -Promega) utilizando o protocolo do fabricante. O

50 valores IC foram calculados por não linear dos mínimos quadrados ajuste de curvas de dose-resposta, usando o código-fonte aberto programa de computador PLOT QTI. Os dados foram analisados ​​com o de quatro parâmetros logística equação f = (a – d) /[1 + (x /c) b] + d, em que

um

é o máximo assintótica,

b

é um parâmetro de inclinação,

c

é o valor no ponto de inflexão (IC

50) e

d

é o mínimo assintótica. Para um controle, de 0,4 uM ou 1,2 uM DT385 foi adicionado ao meio de cultura de tecidos, na ausência de células, seguido de incubação com o reagente de MTS /PMS. Redução de MTS não foi observada nestas condições, confirmando que DT385 não interferir com este ensaio.

cristal mancha violeta

A proliferação celular foi também avaliada com coloração de violeta de cristal. No final do tratamento com DT385, as células foram fixadas com metanol a 100%, e coradas com 0,5% de violeta cristal em 20% de metanol durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células coradas foram fotografadas em 25 × ampliação em um Zeiss Axiover 200 microscópio invertido (Carl Zeiss, Alemanha).

apoptose e necrose Ensaio

apoptose e células necróticas foram visualizados com o ensaio de apoptose e necrose kit (Biotium, Inc.) seguindo o protocolo do fabricante. As células coradas foram fotografados em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan II (Carl Zeiss, Alemanha), com configurações de filtros adequados para isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Texas Red fluorescência. As imagens digitais foram processadas no Adobe Photoshop (Adobe Inc.).

Proteína síntese ensaio

L-87 MG de células ou Hela foram semeadas a uma razão de 1:10 em 1 mL de DMEM mais 10% de FBS por poço numa placa de 12 poços durante a noite. As células foram tratadas com 1 uM DT385 durante o tempo indicado, incubadas durante 15 minutos a 37 ° C com 0,5 ml de meio de rotulagem (DMEM isento de metionina, 10% de FBS dialisado e 50-100 ^ Ci Pro-Mix L – [

35 -S] – (Amersham)) e os lisados ​​celulares analisados ​​por SDS-PAGE. bandas radioactivas foram visualizados por radiografia usando um phosphorimager após a exposição durante a noite em uma tela de fósforo. Para quantificação, [

35S] incorporação foi medida por contagem de cintilação líquida.

pintainho membrana corioalantóica (CAM) ensaio de angiogénese

A actividade anti-angiogénica de proteínas foi testado sobre a CAM quanto descrito [24]. Ao analisar vascularização induzida por tumor, 50.000 células HEp3 substituído bFGF /VEGF como o estímulo angiogénico [25]. Quatro implantes foram colocados em cada CAM e dez embriões foram usadas para cada composto experimental.

CAM crescimento tumoral ensaio

células tumorais

HEp3-GFP (100.000 células /10 ul de meio DMEM) foram aplicados directamente para um filtro de disco abrasiva área da CAM de 9 dias de idade embriões de galinha tal como descrito por [26]. Chicks foram incubados sob condições padrão até o dia 15 quando os tumores foram fotografadas e classificadas para distribuição aleatória de controle e os grupos de tratamento. Diariamente injecções intravenosas de DT385 sistémicos (2 ug em 50 ul de PBS) ou PBS (50 uL) foram realizadas no dia 15, 16 e 17. No dia 18, os tumores foram excisados, limpos de CAM e depois pesados. Alternativamente, fluorescentes tumores (GFP) HEp3 foram fotografadas

in vivo

usando uma fluorescência estereomicroscópio Zeiss Lumar. O contorno do tumor foi determinada utilizando o sinal de fluorescência das células tumorais (canal de GFP (EX470 /em525)). Especificamente, o software Volocity foi calibrado para seleccionar áreas com intensidade de fluorescência correspondente a 1 ou mais desvios padrão acima do fundo. A área do tumor foi definido e calculado utilizando o software Improvision Volocity (Perkin Elmer, Inc.) (Versão 5.3.0 Construção 0). Uma unidade de medida (1 mM) foi calibrado usando a grade de um hemocitómetro. A determinação do volume do tumor assume a forma de ser hemiellipsoidal ea equação para o volume do tumor é: V = π /6 • (comprimento) • (largura) • (altura), onde height = 1.63√ (Comprimento • Largura). Os dados foram analisados ​​por meio de teste t de Student.

Mouse modelo de tumor

Todo o trabalho animal foi realizado no biotério da Universidade Dalhousie, em conformidade com as diretrizes estabelecidas no Cuidado e Uso de Animais de laboratório de Dalhousie University. Todas as investigações foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal Dalhousie. Foram utilizados ratinhos C57BL6 /J fêmea de idade de 6 a 8 semanas (Jackson Laboratories). Os tumores foram induzidos por injecção subcutânea de células LLC (10 Sup

6 células) em 100 ul de PBS estéril. tumores palpáveis ​​foram estabelecidos três a quatro dias após a injecção, altura em que os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais, os que receberam SUMO recombinante (controlo) e aqueles que receberam tratamento DT385 recombinante. SUMO e DT385 foram administradas a ratos, peritumorally no dia 5 (25 g em 100 mL PBS), e nos dias 9, 12 e 15 (10 ug em 100 ul PBS cada injeção).

marcação de proteínas com FITC

DT385 e BSA foram marcadas com FITC usando o EZ-label FITC Kit de marcação de proteínas seguindo o protocolo do fabricante (Pierce).

estudos de washout de cloreto de amônio

células U87 foram incubadas na ausência ou presença de DT385 (2 ^ M) sozinho ou em combinação com cloreto de amónio a 10 mM. O meio foi removido em vários pontos temporais e substituído com meio fresco. Trinta e seis horas após a adição dos compostos de ensaio, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTS.

Análise estatística

O significado dos dados foi determinada utilizando o teste t de Student (unicaudal ). Os valores de P 0,05 foram consideradas significativas

Resultados

Caracterização de DT385

Estudos recentes do nosso laboratório identificaram e caracterizaram um novo fragmento antiangiogênico do plasminogênio chamado p22 [. ,,,0],27]. Desde p22 era um inibidor potente e específico de células endoteliais capilares, foi previsto que esta proteína pode ser utilizada para alvejar a vasculatura recém-DT formando. Nós expressa uma proteína de fusão em

E. coli

em que p22 foi substituído pelo domínio de ligação ao receptor de DT (DT385-P22). A actividade desta proteína de fusão foi comparado com DT385 recombinante e P22 recombinante. Para determinar o impacto destes compostos sobre a viabilidade celular, ensaios de MTS foram realizados em células endoteliais da artéria pulmonar bovina (BPAEC) após um tratamento de três dias. Curiosamente, observou-se que, ao contrário do p22 preparada por digestão proteolítica do plasminogénio humano [27], o p22 recombinante não conseguiu inibir a viabilidade do BPAEC (Figura 1A). Infelizmente, temos sido incapazes de produzir p22 recombinante ativo no

E. coli ou de levedura

(dados não mostrados). De interesse particular foi a observação de que tanto o constructo DT385-p22 recombinante e DT385 recombinante diminuído dramaticamente o número de BPAEC viável. Determinou-se um

valor de IC50 de 0,21 uM e 0,14 uM para DT385-p22 e DT385, respectivamente (Tabela 1).

p22 recombinante, (expresso a partir de pET17b-p22), DT385 (expresso a partir de pET17b- DT385), DT385-p22 (expresso a partir de plic-DT385-p22), (ver Materiais e Métodos) ou um volume equivalente de PBS (controlo) foram incubadas com (A) BPAEC, (B), células HeLa e células HT1080, e (C ), as células HUVEC e HDMEC em meio de crescimento durante três dias. Após três dias de incubação, o número de células viáveis ​​foi quantificado pelo ensaio de MTS. O controlo do veículo de PBS foi considerada como 100% viáveis. Os resultados são expressos como percentagens de células tratados com PBS. Os resultados são a média ± S.D. de 3 experiências independentes realizadas em triplicado (n = 9).

Uma vez que a atividade de p22 recombinante foi inativa actividade, enquanto DT385-p22 retido, não ficou claro a partir destes resultados, se p22 pode ter retido quando expressa como proteína de fusão, DT385-p22. Tendo em vista a especificidade de p22 derivadas de plasminogénio por células endoteliais, espera-se que se o componente P22 da proteína de fusão DT385-p22, em seguida, DT385-p22 só deve direccionar células endoteliais e não de células cancerosas, como tem sido demonstrado para p22 derivadas de plasminogénio [27]. Portanto, testou a actividade citotóxica de DT385-p22 e DT385 com linhas celulares de cancro. Para estas experiências foi inicialmente testado duas linhas celulares de cancro humano vulgarmente utilizados, a célula de fibrossarcoma HT1080 e a célula de carcinoma cervical HeLa. Inesperadamente, descobrimos que DT385 causou uma perda dramática da viabilidade celular das linhas celulares de cancro de um modo dependente da dose (Figura 1B). Na dose mais elevada testada (2,4 ^ M), 10% de células viáveis ​​permaneceram Hela, enquanto cerca de 50% de células viáveis ​​permaneceram HT1080. DT385-p22 também causou uma perda de viabilidade celular, mas era menos potente que o DT385. Para determinar se a viabilidade das células endoteliais humanas foi afectada por p22-DT385, incubámos HUVEC e HDMEC com estas proteínas (Figura 1C). Surpreendentemente, a viabilidade de ambas as linhas celulares não foi afectada por DT385, D385-p22 ou p22 na concentração de até 2,5 uM. Nós estendeu o tempo de incubação de 7 dias com 2,4 uM destas proteínas recombinantes, e nenhuma perda de viabilidade celular foi observado (Figura S1, A). No entanto, com concentrações muito elevadas de DT385, a perda de viabilidade de HUVEC e HDMEC foi observado (Figura S1, B). Nós determinamos um IC

50 de cerca de 5,77 e 7,54 mM DT385 para a HUVEC e HDMEC, respectivamente. Estes resultados sugerem que a actividade citotóxica de DT385-p22 foi devido à actividade do domínio DT385 da proteína de fusão e não o domínio de p22. Concluiu-se também que DT385 pode matar células de cancro humano, a uma concentração que não afectam as linhas de células endoteliais primárias. A observação de que DT385 tinha actividade citotóxica era nova e inesperada. Por isso, investigamos a possibilidade de que DT385 pode matar outras células cancerosas.

efeitos citotóxicos de DT385 em linhas celulares de cancro

Nós estendeu o ensaio de citotoxicidade de 18 linhas de células cancerosas humanas (Tabela 1). Quinze linhas celulares de cancro foram afectados por DT385 e eficácia de DT385 variou entre as células cancerosas. linhas celulares de cancro com maior sensibilidade para DT385 (IC

50 a menos do que 0,5 mM DT385), incluídos U-87 MG, U251, 293T, HEK293, Hela e Calu-3 células. O grupo com sensibilidade intermediária para DT385 (IC

50 entre 0,5-1,5 uM) incluído Colo201, Colo205, LNCap, PC-3, HT1080, e células MDA-MB-231. Fracas linhas celulares de cancro sensíveis com IC

50 maior do que 1,5 mM incluídos MCF7, HCT116, BT-20, NB4, HL-60, e as células HEp3. Em contrapartida, p22 recombinante não teve qualquer efeito na viabilidade celular a concentrações tão elevadas como 2,4 uM (dados não apresentados). As três linhas de células de cancro humano que não são afectadas por DT385 na maior dose testada (2,4 uM) foram as linhas celulares de leucemia promielocítica (HL-60 e NB4) e a linha celular de carcinoma epidemoid (HEp3).

O DT385 perda mediada na viabilidade celular foi também confirmada utilizando a coloração de violeta de cristal (Figura 2). Por exemplo, menos de 10% de glioma U-87 MG de células permaneceram após o tratamento DT385. Para confirmar a sensibilidade inter-espécies para DT385, testamos rato melanoma (B16-F10), carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) e as células de fibroblastos de rato embrionárias (MEF). Enquanto o B16-F10 e MEF foram altamente sensíveis para DT385, a LLC foram apenas fracamente sensível (Tabela 1). Juntos, os dados de ensaios STM e coloração de cristal violeta indicam que o “receptorless” DT, DT385, pode realmente ser citotóxica para muitas linhas de células tumorais. O mecanismo molecular que explica a ampla gama de sensibilidade para DT385 está atualmente sob investigação.

Várias linhas celulares de cancro foram cultivadas com DT385 2 � ou p22 recombinante (rP22) durante 3 dias. As células foram então coradas com violeta de cristal tal como descrito em Materiais e Métodos e as imagens foram obtidas em 25 × ampliação com um Zeiss Axiover 200 microscópio invertido (Carl Zeiss, Alemanha).

efeitos citotóxicos de DT385 sobre outra linhas de células primária

Para avaliar a citotoxicidade de DT385 em outras linhas de células primárias, culturas primárias de três linhas de células humanas de fibroblastos (CCD-1064Sk, BJ e IMR-90) e uma linha celular de monócitos (SC) foram incubadas com concentrações crescentes de DT385 e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. fibroblastos BJ CCD-1064Sk e tinha um IC

50 de 2,22 mM e 2,37 mM DT385, respectivamente. Os fibroblastos de pulmão (IMR-90) teve um IC

50 de 1,44 jiM e a viabilidade da monócitos (SC) não foi afectada pela DT385 em concentrações até 2,4 uM (Tabela 1). Mais uma vez, p22 recombinante não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular em concentrações até 2,4 uM (dados não apresentados). Em contraste, quando confluentes CCD-1064Sk, BJ e IMR-90 fibroblastos foram tratados durante 3 dias com 2 uM DT385, não se observou perda significativa de viabilidade celular (Figura S2). Estes dados indicam que, mesmo quando DT385 é eficaz na redução da viabilidade de proliferação de células primárias, ele falha para matar estas células quando elas são quiescentes /confluente. Tomados em conjunto, estes dados suportam nossa conclusão anterior de que DT385 sozinha tem potencial para matar as células cancerosas com o mínimo de efeitos sobre as células primárias.

Para determinar se a resistência à DT385 poderia ser superado por incubação contínua, as células com fraca ou nenhuma sensibilidade detectável receberam uma segunda dose, 48 horas após o primeiro tratamento e a viabilidade celular foi medida 2 dias mais tarde. A linha de células de carcinoma epidermóide humano, HEp3 e linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 exibiram ambas com o aumento da sensibilidade de incubação contínua com DT385. Em comparação com uma única aplicação de DT385, que não afectam as células HEp3 significativamente, duas aplicações de DT385 diminuiu a viabilidade celular (IC

50 de 2,07 jiM (Figura S3). Da mesma forma, o IC

50 para o cancro da mama a linha celular MDA-MB-231 diminuiu de 1,02 uM a 0,66 uM após uma segunda incubação com DT385 (Tabela 1). Em contraste, uma segunda incubação com DT385 foi sem efeito para as células endoteliais primárias, as HUVEC ou HDMEC (Figura S3) . Tomados em conjunto, os resultados mostram que a DT receptorless sob a forma de DT385 é citotóxica para um grande número de células tumorais. Embora a sensibilidade para DT385 varia, exposição contínua diminui a viabilidade do mesmo as linhas celulares de cancro mais resistente.

mecanismo de acção de DT385

DT mata as células por um mecanismo que envolve a apoptose celular. também foi observado um aumento da apoptose em células DT385 tratados (Figura 3). A incubação de cultura L-87 com DT385 resultou numa dramática aumento da apoptose celular, como medido por um aumento na coloração de anexina V (85%) e a absorção de homodímero de etídio (87%).

(a), U-87 MG de células crescendo numa câmara bem 8- slides foram tratados com 1,2 uM DT385, ou controlo (PBS), respectivamente, durante 3 dias. Após os tratamentos, as células foram coradas para a apoptose com a integridade da membrana celular anexina V marcada com FITC foi avaliada com etídio homodímero III (ETD-III). Imagens representativas (100 × ampliações) são mostrados. O

seta

indica células que foram marcadas com ambos os corantes fluorescentes. (B), a representação gráfica de (A). O número de células por campo de alta potência (HPF, × 400) era a média do número de células obtido a partir de 5 HPF aleatória. células isoladas, que foram coradas com ambos anexina V e ETD-III positivo, também foram incluídos na determinação do número de células. Os resultados são a média ± S.D. de 3 experiências.

DT tem sido demonstrado para entrar nas células de mamíferos sensíveis à toxina por endocitose mediada por receptores que envolve a interacção do domínio de ligação ao receptor da proteína com o seu receptor extracelular. Desde DT385 não possuem um domínio de ligação ao receptor, ele deve ser incapaz de se ligar às células e se tornar interiorizado. Para investigar se DT385 foi internalizada, acompanhamos fluorescente etiquetado DT385 com microscopia confocal. As células tumorais sensíveis para DT385 foram incubadas com FITC-DT385 e fotografada com microscopia confocal. Como mostrado na Figura 4A, a incubação de células com DT385 resultou na internalização da toxina que foi detectável em vesículas perinucleares. Em contraste, a incubação de células com concentrações semelhantes de albumina de soro bovino FITC não resultou na internalização da proteína (Figura S4). Esta experiência sugerem que a absorção de DT385 por células não foi devido a captação celular não específica da proteína.

(A), células de cancro foram cultivadas numa câmara de corrediça 8 poços. Marcado com FITC DT385 (1 uM) foi adicionado à cultura. As células foram observadas e fotografadas sob uma Zeiss LSM 510 microscópio de fluorescência confocal (Carl Zeiss, Alemanha) após 36 h. lados superior e direito de imagens demonstra a vista ortogonal do conjunto de dados confocal mostrado no x e eixo y de imagens. Ampliações são indicados abaixo imagens. (B), células U87 foram incubadas com sozinho ou em combinação com 10 mM de NH

4Cl durante os tempos indicados 2 uM DT385. O meio foi então substituído e as células foram cultivadas durante um tempo total de 36 horas, após o que a viabilidade celular foi acedido com o ensaio MTS. O controlo do veículo de PBS foi considerada como 100% viáveis. Os resultados são expressos como percentagens de células tratados com PBS. Os resultados apresentados são representativos de 2 expericias independentes realizadas em triplicado.

de cloreto de amónio é uma base fraca que se difunde para o endossoma e serve como um reservatório de protões, inibindo, assim, a acidificação do endossoma. Utilizamos tratamento com cloreto de amónio de células para investigar se DT385 introduzido na célula por endocitose. Observou-se que a incubação de células U87 com DT385 para tão pouco quanto 2 horas, produziu morte celular significativa (Figura 4B). No entanto, a adição simultânea de cloreto de amónio e DT385 revogada a actividade citotóxica de DT385. A observação de que o cloreto de amónio bloqueou a actividade citotóxica de DT385 sugere que a DT-385 entra nas células através de uma via endocítica ácida.

A toxina da difteria mata células por catalisar a ADP-ribosilação de EF-2, que conduz à inibição de proteínas a síntese de [5], [28]. Para investigar se o DT385 diminuiu a viabilidade celular por inibição da síntese de proteínas, glioma U-87 MG de células foram tratadas com 1 uM DT385 durante 36 horas, seguido de marcação com [

35S] metionina durante 15 minutos. Como mostrado na Figura 5A, a análise de SDS-PAGE do lisado celular mostraram que a síntese de proteínas foi severamente reduzida em células tratadas DT385. Esta inibição ocorreu dentro de 24 horas de tratamento e persistiu durante o período de duração do ensaio (48 horas) (Figura 5B). A 36 h de tratamento deu o maior decréscimo na marcação de proteínas. Estes dados sugerem que, mecanicamente, DT385 diminui a viabilidade celular por bloqueio da síntese de proteínas. Foram obtidos resultados semelhantes para as células HeLa (dados não mostrados).

(A), U-87 MG de células DT385 foram tratadas com 1 uM ou controlo (quer rP22, sumo ou PBS) durante 24, 36 he 48 h, respectivamente, e, em seguida, marcadas com [

35S] metionina durante 15 minutos. Os lisados ​​celulares (10 ug) foram separadas por SDS-PAGE (gel a 12%) e os geles foram corados com azul de Coomassie (esquerda), secou-se sobre papel Whatman e visualizados por radiografia utilizando um Phosphorimager (à direita). imagens representativas de 36 h de tratamento são mostrados. (B), a quantificação de (A). A radioactividade dos lisados ​​de células foi determinada por contagem de cintilação líquida. Os dados são expressos como percentagem do controlo. A média de CPM de proteína irrelevante, rP22 SUMO ou recombinante ou tratamento de PBS foi considerada como o valor de controlo de CPM. Os resultados são a média ± S.D. (N = 6, 2 experiências independentes). A viabilidade das células foi também medida como descrito na legenda da Figura 1. Os resultados são a média ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado.

Chick membrana corioalant�ca ensaio

A progressão e metástase da doença neoplásica requer extensa vascularização do tumor para sustentar as exigências nutricionais e oxigênio da proliferação células cancerosas. Isto é geralmente conseguido através de um processo chamado de angiogénese [29]. O ensaio de membrana corioalant�ca pinto (CAM) é um instrumento útil

in vivo

sistema modelo para investigar os efeitos das toxinas sobre a angiogênese. Como mostrado na Figura 6A, DT385 a uma concentração de 40 nM (1,2 pmol em 30 mL) causou a inibição completa da germinação induzida HEp3 (angiogénico) vascular. Esta concentração é muito abaixo do IC

50 das células de tumor e, portanto, um efeito directo na viabilidade de DT385 HEp3 é improvável.

(A), células HEp3 foram usadas para estimular a angiogénese na CAM. controle PBS sem células HEp3 indicado o nível basal de angiogênese. A angiogénese, na presença de células HEp3 e na ausência ou na presença de DT385 recombinante ou proteína de controlo recombinante (Sumo) foi analisado. Os resultados são a média ± E.P. de 80 pontos de dados de dois ensaios replicados * P 0,05 (teste t de Student). (B), DT385 diminuíram significativamente o crescimento do tumor. Hep3 crescimento tumoral no sistema de CAM foi avaliada tal como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são a média ± E.P. Os valores médios dos tumores para DT385 ou controlo tratamentos foram 13,88 ± 1,56 mg (média ± S.E. .; n = 23) e 23,33 ± 4,3 mg, (média ± S.E. .; n = 12), respectivamente, p = 0,012. (C), DT385 diminuiu significativamente o volume do tumor. Hep3 volume do tumor no sistema CAM foi avaliada tal como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são a média ± E.P. Os valores médios do tamanho do tumor para DT385 ou controle tratamentos foram 8,86 × 10

9 ± 2,42 mm

3 (média ± SE; n = 18) e 2,97 × 10

9 ± 0,49 mm

3 (média ± sE; n = 8). respectivamente, p = 0,02

Para investigar se DT385 poderia reduzir o crescimento tumoral, tumores HEp3 foram cultivadas na CAM e os tumores 6 dias de idade foram então tratadas com 2 ug de DT385 injectados intravenosamente diariamente durante três dias.