Abstract

Objetivos

Nós desenvolvemos um modelo pré-clínico relevante associada a uma específica protocolo de imagem dedicada a onco-farmacologia estudos em camundongos.

Materiais e Métodos

Nós otimizado tanto o modelo animal e um procedimento de ultra-sonografia para o acompanhamento longitudinal do crescimento do tumor de pulmão em camundongos. Além disso foi proposto para medir por imagiologia fotoacústica a hipóxia intratumoral, o que é um parâmetro crucial responsável pela resistência a terapias. Finalmente, foram comparados dados de ultra-som para micro raios-x e tomografia computadorizada medições volumétricas para validar a relevância desta abordagem sobre o tumor de pulmão ortotópico humano NCI-H460.

Resultados

Este estudo demonstra a capacidade da ultra-sonografia para detectar e monitorar o

in vivo

o crescimento do tumor de pulmão ortotópico por ultra-sonografia de alta resolução. Esta abordagem permitiu-nos caracterizar parâmetros biológicos fundamentais, tais como oxigenação, estado perfusão e vascularização de tumores.

Conclusão

Tal abordagem experimental nunca foi relatado anteriormente, e que iria fornecer uma ferramenta não radiativa para avaliação da eficácia terapêutica anti-cancro em ratinhos. Considerando a ausência de propagação de ultra-som através do parênquima pulmonar, esta estratégia requer a implantação de tumores estritamente situados na parte posterior superficial do pulmão

Citation:. Raes F, Sobilo J, Le Mée M, Rétif S, Natkunarajah S, Lerondel S, et al. (2016) de alta resolução ultra-som e Fotoacústica imagem das ortotópico cancro do pulmão em ratos: novas perspectivas para Onco-Farmacologia. PLoS ONE 11 (4): e0153532. doi: 10.1371 /journal.pone.0153532

editor: Bernhard Ryffel, Centro Nacional Francês de Pesquisa Científica, França |

Recebido: 02 de fevereiro de 2016; Aceito: 30 de março de 2016; Publicação: 12 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Raes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

1. Introdução

Uma vez que o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte relacionada ao câncer, há uma necessidade de desenvolver protocolos pré-clínicos mais precisos e preditivos e modelos de cancro relevantes. Modelos ortotópicos de cancro do pulmão têm a vantagem de ser mais preditiva em relação relevância clínica, incluindo a capacidade dos tumores primários para desenvolver metástase espontânea mas também mais preditiva quanto à resposta terapêutica. A implementação e exploração de tais modelos ortotópicos nos permite melhorar a nossa compreensão da biologia do câncer de interpretar pré-clínicos

in vivo

resultados em humanos, especialmente para o potencial resposta terapêutica dos agentes anticancerígenos. Estudos tendo em conta os parâmetros mais representativos de situações clínicas, particularmente hipóxia, são de grande interesse para impulsionar a inovação de novos tratamentos anticancerígenos [1-3].

Um parâmetro importante na oncologia é a avaliação do volume do tumor antes, mas também durante tratamentos [4]. Num cenário clínico, as medições tumorais pulmonares são predominantemente realizada com raios X de tomografia computadorizada (TC) [5]. Para oncologia pré-clínico pulmonar, objetivos de imagem são de melhorar a precisão para determinar volumes, sem efeitos da irradiação ou interferências com a resposta anti-tumoral.

Graças aos avanços tecnológicos para ambas as fontes de raios-X e detectores, CT dedicado a pequena imagiologia animais fornece uma resolução sub-milimétrica fazendo esta ferramenta eficiente para a caracterização de volumes de tumor de pulmão. No entanto, a dose de radiação nos tumores continua a ser uma limitação, especialmente quando um estudo requer exames repetidos [6].

A bioluminescência imagem (BLI) provocou uma revolução na pesquisa oncológica pré-clínico, mas este método fornece informação quantitativa sobre tumor proliferação sem qualquer dimensionamento possível. Além disso, desde BLI é dependente do metabolismo, não é confiável quando os tumores se tornam hipóxico [7].

Na prática clínica, ultra-som de pulmão (US) foi ganhando popularidade entre os médicos e tornou-se uma ferramenta essencial na gestão criticamente doente [8,9]. No entanto sobre oncologia pulmonar humano, não há nenhuma possibilidade de utilização de US excepto para endoscopia invasiva de nódulos de câncer e nódulos linfáticos [10,11]. A principal limitação da endoscopia e ultra-som é a detecção desses nódulos se a proximidade com a sonda não está perto o suficiente. Esta limitação do acesso é devido à ausência de propagação dos EUA através do parênquima pulmonar por causa do ar.

Pelo contrário, pré-clínico alta resolução de imagem e US fotoacústica (PAI) são modalidades promissores para investigar a progressão do tumor de pulmão e hipóxia respectivamente mas considerando os condicionalismos específicos dos Estados Unidos, a implantação de tumores na região posterior do pulmão superficial é necessária.

a grande células NCI-H460 modelo de carcinoma de pulmão ortotópico que escolhemos para melhorar, é baseada em um estudo realizado por Gagnadoux

et al

. [12], levando ao crescimento de um nódulo intrapulmonar solitária localizada perto da superfície do diafragma posterior

.

Aqui recomendamos que você refine tal um protocolo de onco-farmacologia em uma abordagem translacional ao superar limitações físicas dos Estados Unidos permitindo a exploração do tumor de pulmão. Neste estudo longitudinal que avaliou os volumes dos tumores de pulmão em camundongos ortotópicos por

in vivo

3D EUA e também estatuto de tumor hipóxico pela PAI. Além disso, comparamos os nossos dados para diferentes métodos de imagem, com o objectivo de validar esta nova abordagem.

2. Materiais e Métodos

2.1 Ética Declaração

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com orientações éticas europeias (directivas europeias 2010/63 /UE) e foram aprovados pelo Comité Regional para o cuidado de animais e ética em Experimentação animal (C2EA-03 Comité d’éthique en expérimentation animale Campus CNRS d’Orléans).

2.2 Cultura celular

A linha de humano NCI-H460-luc2 de células de câncer de pulmão foi obtido da Perkin Elmer (França). Esta linha de células de câncer foi mantida de acordo com as instruções do fornecedor.

2.3 Animais

nu camundongos fêmeas 6-8 semanas de idade Balb /c livre de patógenos foram adquiridos de Charles River Laboratories (França) . Os ratos foram aclimatados durante 7 dias no laboratório antes de experimentação e foram mantidas em gaiolas parou de filtro esterilizados dentro de um rack de ventilação controlada (EUA), com acesso a comida e água

ad libitum

. Eles foram examinados diariamente quanto a sinais clínicos, angústia, diminuição da atividade física e pesava 3 vezes por semana.

2.4 subcutânea e intra-celular brônquica Xenoenxerto

xenoenxertos de cancro de pulmão humano de NCI-H460-luc2 As células foram estabelecidos em ratinhos nus Balb /c. Nós primeira realizada implantação subcutânea a fim de obter dados de referência a partir de técnicas de medição em condições padrão, de modo que 10 ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano a 1,5% com o ar (ISOFLO

®, AXIENCE SAS, França) e inoculados por diferentes cargas de tumor (seja 1×10

5 a 2,5×10

6 células tumorais em 100 mL PBS) no flanco dorsal. Para implantação ortotópica, 24 camundongos foram inoculados (1.25×10

5 ou 2,5×10

5 células tumorais em 25 mL PBS) utilizando uma 1.9F × 50cm blunt-end cateter de silicone inserido no brônquio através de um laringoscópio (S1A Fig ). Este procedimento delicado para obter a deposição de células superficiais em uma parte posterior de um lobo inferior através de um brônquio principal requer imagem intervencionista. A posição do cateter de radio-opaco é verificada por meio de radiografia planar (Faxitron MX20, Faxitron Corp de raios-X, EUA) (S1B fig) deposição, em seguida real de células tumorais marcados com 99mTc é controlada por uma única Photon Emission Computed Tomography (Nano Spect CT , Mediso, Hungria), (Fig S1C).

2.5 Tomografia Computadorizada

Os ratos foram anestesiados com isoflurano a 1,5% e colocado em uma cama em decúbito ventral. Para medições do tumor, a tomografia computadorizada foi realizada utilizando um pequeno gerador de imagens de animais (Explorar CT 120, Trifoil Imaging, EUA) com um dispositivo externo gating respiratório (Biovet, EUA). Alguns ratos receberam uma injecção intravenosa do agente de contraste vascular eXIA160

™ (Binitio biomédica, Canadá). Os volumes dos tumores foram obtidos por delinear manualmente margens de tumores a partir de secções sagitais de imagens de CT utilizando análise Microvisão + 2,3 software.

2.6 Imagiologia bioluminescência

BLI foi realizada uma vez por semana até ao fim do estudo ( dia 28) usando um IVIS Lumina-II (Perkin Elmer, França) geração de uma imagem de pseudo-colorida que representa a intensidade da luz e sobreposta sobre uma imagem de referência em escala de cinzentos. Cada rato foi injectado IP com 100 mg de sal kg /luciferina de potássio (Promega, França). Os murganhos anestesiados com isoflurano a 1,5% foram colocados numa almofada de aquecimento controlada por termostato (37 ° C) durante o exame. binning aquisição e duração foram definidos dependendo da atividade do tumor. A intensidade de sinal foi quantificado como o total fluxo (fotões /segundo) dentro de ROIs desenhada manualmente em torno da área do tumor usando o Image estar software 4.0 (Perkin Elmer, França). A soma dos sinais das posições prona e supina foi considerado para cada rato.

2.7 Ultra-som e de imagem Fotoacústica

Ratos anestesiados com isoflurano a 1,5% foram colocados sobre uma almofada de aquecimento controlado por termostato na posição prona com as patas gravadas ao longo dos eletrodos de ECG anexados à tabela. gating respiratória foi derivada de ECG. Foi aplicado um gel incolor ultra-som aquecido aquosa (Supragel

®, LCH, França), sem quaisquer bolhas de ar entre a pele eo transdutor. Os tumores foram fotografadas com o VisualSonics Vevo

®LAZR System (FUJIFILM VisualSonics Inc, Canadá). scans 3D de imagem US sendo gravado digitalmente. A área do tumor em planos coronal foi medida por margens que delimitam manualmente usando Vevo

®LAB 1.7.2 software. O software então calculado o volume correspondente de cada fatia coronal. Para avaliações de hipoxia, os tumores foram investigados por PAI com OxyHemo-Mode para que os valores médios de SO

2 foram determinadas e correspondentes volumes de hipóxia documentado. estado de perfusão do tumor e expressão VEGFR2 foram avaliadas por contraste de ultra-som (CEUs) de imagem após a injecção IV (veia da cauda) do Vevo MicroMarker

™ e Target-Ready MicroMarker

™ juntamente com tanto anticorpos de controlo de isotipo anti-VEGFR2 ou ( eBioscience, EUA). protocolos de imagem foram realizados com as sequências de destruição-reabastecimento. Os dados foram processados ​​com o VevoCQ

™ software. Um parâmetro chave que devem ser respeitados para a aquisição precisas 3D dos EUA é o posicionamento do transdutor (S2A Fig). O feixe dos EUA tem de ser dirigida para o tumor de pulmão com o melhor ângulo possível, de modo que todo o tumor pode ser detectado durante a aquisição. Apesar da presença de artefactos e sombras devido às nervuras, ao alterar o ângulo do transdutor, é possível seleccionar o posicionamento mais eficiente para o transdutor que permite a detecção. O tamanho mínimo de tumores que podem ser detectados é de 1 mm de diâmetro, no entanto, quanto maior o tamanho do tumor, a menos artefactos a partir da detecção do tumor impacto costelas. Transdutores com frequência central de 21MHz e 40MHz, foram utilizados para a imagem latente B-Mode de tumores grandes e pequenas, respectivamente. PAI foi realizada com o transdutor de 21MHz.

2.8 Sacrifício e Órgão Remoção

Ratos sob anestesia foram sacrificados por deslocamento cervical e os tumores foram recolhidos de cada animal para imediato

ex vivo

avaliações. A fim de avaliar a precisão de

in vivo medições

norte-americanos, os tumores foram recolhidos no final do estudo (dia 28) e foram fotografadas

ex vivo

com US 3D. A placa dedicada preenchido com gel de ultra-som nos permitiu medir os volumes dos tumores com precisão, evitando qualquer movimento de tecidos colhidos devido ao movimento do transdutor de US durante a aquisição 3D (S2B Fig).

2.9 medidas volumétricas

Os tumores foram dissecados cuidadosamente, em seguida, imersas em cilindros graduados adequados cheios com água. Os volumes foram avaliadas medindo o peso de água removida a partir do cilindro para fazer o menisco côncavo ajustado para o bordo superior da marca de graduação da linha de base (Fig S2C). Estas medidas foram realizadas em triplicado.

2.10 Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad, EUA). gráficos de correlação e R quadrado coeficientes foram obtidos por regressão não-linear.

3. Resultados

3.1 validação de técnicas para medições de volume tumoral em modelos subcutâneos

Para avaliar a precisão intrínseca de cada modalidade para determinar os volumes dos tumores, o modelo de tumor subcutâneo nos permite evitar a interrupção contribuições como respiratória movimentos e problemas bem conhecidos associados com exames de tórax dos EUA. Comparação dos resultados foi obtido a partir de tumores subcutâneos com tamanhos que variam de 15 a 700 milímetros

3. análise de correlação entre as medições dos EUA alcançou

in vivo

Vs

ex vivo

(R

2 = 0,94), Vs CT (R

2 = 0,93), ou o peso do tumor (R

2 = 0,98) e volumétricas avaliações (R

2 = 0,96) claramente validada a capacidade de protocolos CT EUA e para alcançar a determinação exata dos volumes tumorais (Fig 1).

regressão não linear dos dados Os pontos obtidos a partir de tumores subcutâneos ortotópicos (n = 10 animais). O coeficiente de correlação R quadrado é fornecido no lado inferior direito de cada gráfico.

3.2 Controle da implantação do tumor celular

Para os tumores subcutâneos, todos os 10 animais xenoenxerto foram inscritos para avaliação dos tamanhos dos tumores quando determinada pelos métodos de medição diferentes. Para os tumores do pulmão ortotópicos, sete dias após o enxerto do crescimento do tumor foi confirmada por BLI (Fig S1D), quer no pulmão esquerdo ou direito. Com base na intensidade da BLI, 12 ratos com actividade tumor variando de 7.45×10

5 a 8.55×10

7 fótons /seg foram selecionados para o estudo.

3.3 Avaliação dos volumes de tumor no pulmão pela

In Vivo

US Imagiologia

Tal como no pulmão humano US, observamos artefatos a partir da linha pleural devido a sua ecogenicidade. Como assinalado pelas setas brancas (Fig 2A), a linha pleural aparece brilhante, uma vez que é um aumento da reflexão de ultra-som na interface entre a pleura e pulmão saudável. Percebemos imóvel regularmente espaçados linhas hiperecogênicas, nomeou um linhas, que são artefatos repetição da linha pleural. A interrupção nas linhas pleurais e A nos permitiu identificar o tumor de pulmão com certeza, mesmo em fases iniciais (Fig 2B). Um artefato típico observado abaixo do tumor de pulmão, como uma sombra brilhante correspondente ao ponto de encontro entre tumores e parênquima pulmonar saudável, permitiu identificar margens do tumor. Este melhoramento posterior é explicada pela diferença de velocidade ultra-sons entre o tumor e o parênquima pulmonar

(A) (B) A detecção de tumores pulmonares pela alta resolução Ultrasound Imaging. (A) de aquisição 2D B-Mode em um pulmão saudável no mouse. setas brancas verticais apontar a linha pleural. setas amarelas verticais correspondem a um linhas, representando reverberações da linha pleural. (B) Em 2D B-Mode ultra-sonografia de um pulmão tendo um tumor ortotópico NCI-H460luc (2.8mmx2.4mm), setas vermelhas verticais apontar as margens do tumor, com destaque para o artefato típico de sombra brilhante. Nós também observar setas brancas e amarelas, indicando a linha pleural e linhas A, respectivamente. (C) de 2D para 3D ultra-sonografia B-Modo de um tumor de pulmão em rato. A área vermelha corresponde ao tumor de pulmão na cavidade torácica do mouse. A grade vermelha corresponde ao volume do tumor obtido traçando margens em cada 2D fatias de modo B da aquisição 3D. (D) Avaliação da carga tumoral com BLI (esquerda) e dos EUA (à direita), os dados são apresentados como média ± SEM e analisados ​​estatisticamente. Uma análise de duas vias-medidas repetidas de variância seguida de Bonferroni pós-teste foi utilizada para os dados de tempo ao longo do curso. As diferenças foram consideradas significativas para p 0,05. Esquerda: A intensidade do sinal a partir de

in vivo

acompanhamento longitudinal da proliferação do tumor por BLI após a deposição de 1,5×10

5 ou 2,5×10

5 células tumorais (fotões /sec). Direita:

In vivo

volumes de tumor medidos por US imagiologia usando um transdutor montado em um motor 3D, comparando o crescimento do tumor entre 2 cargas tumorais diferentes (mm

3). Os resultados representam a média ± SEM (n = 5 animais por grupo). (*** P 0,001; **** p 0,0001).

O posicionamento do transdutor com um ângulo apropriado tornou possível gravar imagens 2D sucessivas com um motor de passo para aquisições em 3D. volumes processados ​​foram exibidas como uma grade vermelha (Fig 2C).

Quando comparado com volumes tumorais dos EUA nos dois grupos diferentes de tumores pulmonares, BLI exibiu muito diferentes padrões de evolução (Fig 2D). No primeiro grupo (1.25×10

5cells), BLI aumentada progressivamente até ao dia 21, em seguida, manteve-se inalterada, enquanto a US volumes determinados aumentou durante todo o estudo. No segundo grupo (2,5×10

5cells), aumento constante dos volumes determinados por US era muito diferente do padrão BLI exibindo regressão pronunciada a partir do dia 14 ao dia 21, então estagnação.

In vivo

US acompanhamento de tumores pulmonares nos permitiu medir os volumes dos tumores com precisão e destacou as diferenças significativas entre as curvas de crescimento dos dois fardos tumor inicial.

3.4 Comparação de técnicas para medições de volume tumoral nos pulmões

no final do estudo (dia 28), sem intensificação de contraste CT foi realizada com o objetivo de comparar os dados dos EUA e CT. Os volumes reconstituídos 3D de pulmões saudáveis ​​e tumores foram processados ​​(Fig 3). Isosuperfícies de pulmões saudáveis ​​foram obtidos com uma segmentação automática enquanto os volumes dos tumores necessária delimitação manual sobre fatias 2D.

A rendição 3D de CT anterior de digitalização e posterior reconstrução, após o processamento da delimitação do tumor em fatias 2D a partir de coronal, sagital ou frontal avião. parênquima pulmonar saudável é azul enquanto tumor é destacada em amarelo.

A análise de correlação dos dados obtidos por cada método em tumores de pulmão ortotópicos é relatado na figura 4. Foram comparados os tumores com tamanhos diferentes, os dados obtidos a partir de

in vivo

e

ex vivo

US, CT, as medições volumétricas e pesos. A tomografia computadorizada fornece uma estimativa precisa do volume de tumor em comparação com

ex vivo

US (R

2 = 0,87), peso do tumor (R

2 = 0,98) e volumétricas medições (R

2 = 0,80).

regressão não linear de pontos de dados recolhidos a partir de tumores pulmonares ortotópicos (n = 12 animais). Estes gráficos comparar a correlação entre a imagem

in vivo

e

ex vivo

,

in vivo

tomografias computadorizadas 3D,

ex vivo

medições volumétricas e 3D US tumor peso.

Para

in vivo

medições, os resultados indicam claramente correlação bruta de volumes processados ​​com

in vivo

US, TC e peso do tumor (R

2 = 0,75). Estes resultados não refletem uma superestimação dos volumes de tumor medidos por US ou TC, em comparação com o peso do tumor. Essa correlação também é observada com ex vivo medições volumétricas EUA e (R

2 = 0,72 e R

2 = 0,65, respectivamente).

3,5 contraste de ultra-som, Doppler e Fotoacústica Imaging

Uma vez que era possível realizar

in vivo

US imaging B-Mode, a capacidade de medir diferentes parâmetros norte-americanos e PAI foi investigada. Curiosamente, notamos que micro imagem US permitiu a visualização do status de perfusão do tumor após a injeção de MicroMarker

™ agente de contraste (Fig 5A). Percebemos um sinal bem reforçada através da melhoria contrastou demonstrando um status de perfusão eficiente. imaging CEUS foi mais eficiente e sensível em destacar os parâmetros de vascularização do que Power Doppler. Graças ao Power Doppler (sem injeção de agente de contraste necessário), fomos capazes de observar os navios de maiores dimensões. Devido ao pequeno tamanho de outros navios e contribuição de parâmetros, tais como o movimento do fluxo sanguíneo lento, batimentos cardíacos e respiração, a visualização de sangue pequena flui é um desafio, mesmo com ECG e gating respiratório (dados não mostrados).

(a) imagem de modo B de um tumor pulmonar imagem de contraste correspondente com antes da injeção IV do Vevo MicroMarker

™. Projeção de intensidade máxima após a injeção de MicroMarker

™. (B) imagem em modo B de um tumor pulmonar hipóxica com os correspondentes OxyHemo imagens fotoacústica. Com o OxyHemo-Mode, áreas vermelhas indicam partes bem oxigenados do tumor enquanto que as áreas azuis e escuras indicam a presença de hipóxia. Em relação aos volumes 3D, a grade vermelho corresponde à região de hipoxia de tumor e grade corresponde a todo o tumor. imagem em modo B de um tumor pulmonar bem oxigenada com correspondente OxyHemo imagens fotoacústica, mostrando ausência de qualquer núcleo hipóxica (C).

Em relação à PAI, foram obtidas informações sobre o estado de oxigenação de tumores e foi possível para revelar a presença de hipoxia no interior de tumores de forma não invasiva (figura 5B). Nós notado áreas oxigenada na periferia do tumor, em comparação com o núcleo hipóxico. aquisições em 3D permitiu a quantificação de hipoxia e volumes para ambas as regiões (V

tumor = 29,4 milímetros

3, SO2

tumor = 11,4%; V

hipóxia = 10,2 milímetros

3, SO2

hipóxia = 0,4%, todos os números dados como valores individuais para o tumor mostradas aqui) (Fig 5B). É importante observar que alguns ratos com volumes tumorais totais comparáveis ​​exibiu um tumor bem oxigenado (V

tumor = 47,3 milímetros

3, SO2

tumor = 51,7%, todos os números fornecidos como valores únicos para o tumor mostrado aqui) (Fig 5C).

alvejado CEUS nos permitiu avaliar a expressão VEGFR2 relativa em tumores de pulmão. O software VevoCQ calculada diferencial alvejado valores Enhancement (DTE) para cada região de interesse, a mesma análise foi concluída, tanto para a VEGFR2 e agentes de contraste anticorpo de controlo de isotipo conjugados. A partir de imagens paramétricas a distribuição espacial do agente de contraste ligado pode ser claramente visto (Fig 6A e 6C). Comparação de DTE entre microbolhas marcadas com anticorpos de controlo de isotipo e VEGFR2 foi significativa (figura 6D). Além disso, as áreas hipóxicas determinados pela PAI correspondia à distribuição espacial da VEGFR2 (Figura 6E)

(A) (C) as imagens paramétrica da distribuição espacial de agente de contraste de bolhas. controle (A) Isotype microbolhas conjugado. (C) VEGFR2 microbolhas conjugados (Target Pronto Vevo MicroMarker

™). (B) imagem B-Mode do tumor correspondente. (D) Diferencial reforço alvejado de VEGFR2 e Isotype controlar microbolhas conjugados (DTE corresponde à diferença entre o poder eco de ambas as bolhas direcionados e livres, e o poder eco de apenas bolhas livres). A análise estatística foi realizada com o teste t não pareado de Student (n = 4 animais por grupo). (**** P 0,001). (E) Correspondente imagem PA destacando as áreas de hipóxia, onde VEGFR2 se expressa principalmente.

3.6 Limitações da imagem Modalidades

imagens

CT realizada após a injeção vascular agente de contraste permitiu delimitação clara do tumor a partir de tecidos circundantes (mais especificamente o fígado) (Figura 7A). Pelo contrário, sem intensificação de contraste CT realizados sobre este modelo ortotópico de cancro do pulmão era mais difícil de analisar especialmente para tumores grandes, resultando em menos preciso determinação do volume do tumor (Figura 7B).

(A) TC 2D digitalização de um rato tendo um tumor do pulmão, após a injeção IV com 100 de uma mistura com PBS e AIE 160, um agente de contraste iodado vascular. Delineação do tumor é visível em ambos os planos, com uma linha tracejada amarelo. verificação (B) CT obtido sem injeção de agente de contraste. Delineação do tumor é visível em ambos os planos, com uma linha tracejada amarelo. (C) Estudo longitudinal BLI em um rato tendo um tumor do pulmão entre o dia 7 e dia 35 (fótons /seg /cm

2 /esterradiano), após a implantação de 1.25×10

5 células tumorais.

Figura 7C corresponde à evolução dos sinais BLI dentro do mesmo animal ao longo do tempo. Estes resultados demonstram que os sinais BLI do tumor do pulmão foram interrompidos durante o crescimento do tumor uma vez que um aumento no BLI foi observado até ao dia 21, em seguida, foi observada regressão ao passo que o volume do tumor ainda estava a aumentar (Figura 2D).

4 . Discussão

O uso de modelos de tumores pré-clínicos nos permite acompanhar parâmetros biológicos ou o crescimento do tumor e testar a eficácia de agentes terapêuticos. As experiências descritas aqui têm provado a sua utilidade em proporcionar aos investigadores uma nova técnica competitiva para avaliar o crescimento do tumor de pulmão ortotópico por imagem US

in vivo

, permitindo investigações baseadas não-invasivos e não radiação.

cada uma das modalidades de imagiologia utilizadas durante este estudo tem vantagens e desvantagens. TC é relevante para a imagem do sistema respiratório, devido à baixa densidade no interior do espaço pulmonar [13]. Em relação à detecção de cancro de pulmão, CT tem sido provado ser útil na detecção de tumores pulmonares localizados na área do vértice e hilar mas menos eficiente para tumores localizados perto da superfície do diafragma [14], porque a falta de contraste com o tecido subjacente faz com que seja difícil medir os volumes dos tumores maiores e requer amplo conhecimento de ambas as imagens e contraste agentes CT com anatomia animal. A utilização de agentes de contraste de TC vascular, tais como exia

™, foi necessário realizar medições precisas de volume do tumor, mesmo que os tumores eram pequenos e em crescimento em torno da periferia dos pulmões. Infelizmente, o uso repetido de agente de contraste não é recomendado em estudos onco-farmacológica devido a potenciais efeitos sobre o crescimento do tumor ou terapias. A principal limitação da tomografia computadorizada é a dose de radiação ao tumor. Na verdade, neste modelo de tumor radiossensível, o impacto dos exames de imagem repetidas (1 por semana versus 1 por duas semanas, com uma tomografia computadorizada de tórax convencional entregando 38,9 ± 3,9 Gy) no crescimento do tumor é significativo. A influência de doses na proliferação do tumor e forte risco de potenciação de um efeito anti-tumor pode afectar a relevância dos dados sobre a avaliação da eficácia de agentes antitumorais [6,15,16].

Embora BLI é uma técnica quantitativa explorado rotineiramente para avaliar a proliferação do tumor, é estritamente dependente das condições metabólicas, nomeadamente a presença de ATP e S

2. Como mostrado na Fig 7C, a carga inicial do tumor nestes ratinhos foi pequeno (1.25×10

5 células), no entanto, que conduz à formação de um núcleo hipóxica e à diminuição do sinal bioluminescente. Estas condições de hipóxia tumorais são um ponto crítico a ser considerado para assegurar a relevância dos dados obtidos [7,17,18]. Porque tanto BLI e EU são não-invasivo, foram realizadas medidas longitudinalmente no mesmo animal. Os resultados confirmaram que a quantificação de sinais BLI do pulmão é delicada, e obtidos os dados devem ser utilizados com precaução em relação ao crescimento do tumor. No entanto BLI continua a ser um grande recurso na fase inicial de estudos para controlar a indução de tumores de pulmão e de destinação de animais em grupos homogéneos.

Entre outras modalidades de imagem disponíveis, US é não-invasivo, não-radiante, não necessariamente exigem que os agentes de contraste e, portanto, oferece a vantagem de ser rápido, barato e com um impacto mínimo sobre o processo investigado. Além disso, este método não é sujeito a interrupções devido ao aparecimento de hipóxia. Dado que a forma de tumores não é elipsóide aquisições 3D foram necessárias para medir com precisão volumes. Combinada com uma alta resolução de imagem dos EUA, PAI é uma modalidade de imagem não invasiva e quantitativa em tempo real para o estudo de hipoxia tumoral e heterogeneidade. SO

2 mapeamento pode ser realizado graças às diferenças existentes na absorção óptica entre hemoglobina oxigenada e desoxigenada [19]. PAI, combinando alto contraste absorção óptica com ultra-som de alta resolução, fornece ambos os dados anatômicos e funcionais. Em oncologia, numerosos parâmetros têm de ser avaliados em tumores, pois este multimodalidade é bastante relevante para monitorar a resposta terapêutica ou carga da doença. No entanto, devido à limitação da propagação dos EUA através do parênquima pulmonar, a tradução com as investigações clínicas não pode ser considerado.

Graças ao ultra-som imagiologia molecular, foi possível avaliar a expressão e distribuição espacial de microbolhas VEGFR2-alvo em comparação com microbolhas marcadas com anticorpos de controlo de isotipo. Diferenças na ecos acústicos entre bolhas livres e os ligados ao alvo molecular são o elemento-chave para facilitar a discriminação [20]. Isso abre perspectivas interessantes para caracterizar as mudanças em um nível molecular [21] e para as investigações sobre terapias específicas [22] e, mais particularmente anti-angiogênico estratégias baseadas em tratamentos anti-VEGFR [23].

Em conclusão, descrevemos pela primeira vez uma estratégia de imagem fotoacústica e ultra-som para investigar o crescimento do tumor de pulmão ortotópico e avaliar biomarcadores chave, tais como hipóxia ou expressão VEGFR2

in vivo

. A hipoxia é um importante parâmetro envolvido na resistência do tumor de pulmão em direção rádio e quimioterapias. Para a medicina personalizada, a hipóxia pode ser avaliada por marcadores de PET marcadas com

18Fluorine [24,25] e quimioterapias dedicados a tumores hipóxicos já foram incluídas na fase III de ensaios clínicos [26,27]. Este recurso de imagem validado médio /alto rendimento seria de grande interesse para acompanhamento longitudinal tanto o crescimento do tumor e do estado hipóxico em animais ao testar a eficácia de novas terapias anticâncer. Isso evita qualquer risco de interrupção da progressão do tumor em comparação com outros métodos de imagem, como BLI e CT.

Dada a sua capacidade de fornecer imagiologia molecular alta resolução, é possível imaginar uma aplicação potente adicional de PAI para intra- tumoral micro-biodistribuição de agentes terapêuticos, tais como anticorpos monoclonais [28].

Informações de Apoio

S1 Fig. implantação do tumor de pulmão ortotópico e avaliação do enxerto.

(A) O diagrama representa a via de inoculação. O cateter é inserido no brônquio profunda através da traqueia, de modo a que o tumor cresce nos lobos inferiores dos pulmões, perto da superfície do diafragma posterior. (B) O controlo in vivo do posicionamento do cateter por planar por raios X é realizado a fim de evitar a implantação no local errado. (C1) O controlo da exactidão de deposição de células para o brônquio profunda por SPECT /CT de células 99Tcm-rotulados. (C2) vista sagital demonstrando o local adequado, na parte posterior do pulmão.