Abstract

Recentemente, desenvolveu um método para gerar células mielóides com capacidade de proliferação de iPS humanas células. iPS-ML (derivadas de células iPS mielóide /linha de macrófagos), gerado através da introdução de proliferação e anti-senescência fatores em células mielóides derivadas de células iPS, cresceu continuamente de forma M-dependente-CSF. Um grande número de células que exibem propriedades de tipo macrófagos pode ser prontamente obtidos utilizando esta tecnologia. No presente estudo, foi avaliada a possível aplicação do iPS-ML em terapia anti-câncer. Nós estabelecemos um modelo de câncer gástrico peritoneal disseminada por via intraperitoneal injetar NUGC-4 células cancerosas gástricas humanas em ratos SCID. Quando IPS-mL foram injectadas intraperitonealmente em ratinhos com peritoneais NUGC-4 tumores pré-estabelecidos, IPS-ML massivamente acumulada e infiltrado nos tecidos tumorais. IPS-ML expressar o IFN-β (IPS-ML /IFN-β) inibiu significativamente o crescimento intra-peritoneal de cancro NUGC-4. Além disso, IPS-ML /IFN-β também inibiu o crescimento de cancro pancreático humano MiaPaCa-2 num modelo semelhante. iPS-ML são, portanto, um agente de tratamento promissor para o câncer peritoneal disseminada, para os quais nenhum tratamento padrão está disponível atualmente

Citation:. Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, et ai. (2013) Therapeutic Effect of Human iPS-Cell-derivados de células mielóides expressando IFN-β contra peritoneal câncer disseminado Em modelos de xenotransplante. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10.1371 /journal.pone.0067567

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 30 de setembro de 2012; Aceito: 21 de maio de 2013; Publicação: 24 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Grants-in-Aid nos. 23650609 e 24300334 para YN e 23659158 para S.S. do MEXT, Japão; uma bolsa para Y.N. de Princess Cancer Research Fund Takamatsu; Bolsa de Investigação para S.S. para doenças intratáveis ​​do Ministério da Saúde e Bem-Estar, Japão; e uma subvenção de S. S. da Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia (JST). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os macrófagos desempenham um papel essencial para manter a homeostase do corpo. Eles residem em todos os tecidos do corpo e está envolvida em várias funções, tais como a eliminação de patógenos invasores, remodelação de tecidos, e limpar as células mortas. Além disso, a infiltração de macrófagos é frequentemente observada em vários tipos de câncer [1]. Estudos recentes indicam que estes macrófagos associados a tumores (TAM) essencialmente promover a progressão do cancro, acelerando a invasão local e a metástase de cancros [2]. Em contraste, outros estudos demonstram efeito tumoricida de macrófagos [3], [4]. Com base nos efeitos anti-tumorais de macrófagos observados em estudos pré-clínicos, a aplicação de macrófagos para terapia do cancro tem sido tentado; por exemplo, transferência de macrófagos pré-activadas com IFN-γ foi testado como um potencial agente de tratamento para pacientes de cancro [5] – [9]. No entanto, nenhum benefício terapêutico clara contra o câncer tem sido observado até agora na terapia de macrófagos.

Para estabelecer a terapia de macrófagos como uma terapia mais eficaz anti-câncer, melhoria do método de macrófagos fornecimento é necessária. Nos ensaios clínicos publicados, os macrófagos usados ​​para fins terapêuticos foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico de dadores que foram isolados por leucaferese. No entanto, os monócitos de sangue periférico isolado de não podem ser prontamente propagadas. O número de macrófagos gerados por esses métodos é, portanto, limitada (no máximo 10

9-10

10), e pode ser insuficiente para conseguir efeitos clínicos. Se um número suficiente (por exemplo, mais de 10

10) de macrófagos com a propriedade potente anti-câncer pode ser administrado repetidamente, pudemos perceber terapia eficaz anti-cancro com macrófagos.

células-tronco pluripotentes, tais como células (ES) estaminais embrionárias ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), pode propagar-se indefinidamente e possuem a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos de células somáticas, incluindo as células do sangue. Destruição de um embrião humano é necessário para gerar células-tronco embrionárias humanas. células iPS, por outro lado, pode ser gerado através da introdução de vários factores definidos em células somáticas derivadas de qualquer doador [10] – [13]. Assim, a tecnologia de células iPS podem superar questões éticas, bem como a questão histoincompatibility entre as células terapêuticas dador e do receptor, e futura aplicação de células iPS para a medicina clínica é esperado [14], [15].

Vários grupos, incluindo o nosso, têm estabelecido até agora métodos para gerar macrófagos de células-tronco pluripotentes humanas mouse ou [16] – [24]. No entanto, as células pluripotentes humanas stemα rendimento menor número de macrófagos que as células-tronco pluripotentes rato. Assim, os métodos agora estabelecido gerar números de macrófagos humanos que são menos do que 100 vezes o número de células indiferenciadas iPS utilizados como os materiais de partida; Além disso, a geração de macrófagos por métodos convencionais preciso mais do que um mês. Assim, os métodos convencionais são demasiado trabalhoso e caro para ser aplicado a prática da medicina.

Recentemente, foi estabelecido um método para induzir a proliferação das iPS-celulares derivadas de células mielóides (IPS-MC) por transdução mediada por lentivírus de genes que podem promover a proliferação celular ou inibem a senescência celular, tal como cMyc mais BMI1, EZH2 ou MDM2, para gerar uma linha celular mielóide /macrófago derivado de células iPS (iPS-mL) [25]. IPS-ML podem proliferar de uma forma dependente M-CSF durante pelo menos vários meses, mantendo o potencial para se diferenciarem em células dendríticas (IPS-ML-DC) com uma capacidade de estimulação de células T potente.

o presente estudo, foi avaliado o potencial da utilização de iPS-ML como células efetoras anti-câncer. Nós investigamos se ou não geneticamente modificado iPS-ML expressando anticorpo anti-HER2 ou interferon (IFN) poderia exercer efeito terapêutico contra gástrica peritoneal disseminada e pâncreas em modelos de xenotransplante.

Materiais e Métodos

células e reagentes

Este estudo foi aprovado pelo conselho de ética revisão de Kumamoto University Graduate School of Medical Sciences. Uma linha celular de cancro gástrico humano, NUGC-4, e uma linha celular de cancro pancreático humano, MiaPaCa-2, foram fornecidos pela colecção japonesa de Bioresources investigação (JCRB, Osaka, Japão). Os métodos para a geração, a manutenção, e a modificação genética das células iPS humanos foram descritos anteriormente [21].

análise de citometria de fluxo

Os seguintes mAbs conjugados com FITC ou PE foram adquiridos da BD Pharmingen (San Diego, CA), Beckman Coulter (Brea, CA), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Alemanha), Sigma (St. Louis, MO), ou eBioscience (San Diego, CA): HI30 anti-CD45 (clone, IgG1 de ratinho), anti-CD33 (WM53, IgG1 de ratinho), anti-CD36 (FA6.152, IgG1 de ratinho), anti-CD11b (ICRF44, IgG1 de ratinho), anti-CD14 (61D3, IgG1 de ratinho), anti-CD4 ( 11830, IgG2a de ratinho), anti-CD97 (VIM3b, IgG1), anti-CD13 (WM15, IgG1), anti-CD87 (62022, IgG1), anti-CD115 (2-3A3-1B10, IgG2a de rato), anti-CD116 (4H1, IgG1 de ratinho), anti-TLR2 (T2.5, IgG1 de ratinho), anti-RST4 (HTA125, rato IgG2a), anti-HER2 /neu (Neu 24,7, IgG1 de ratinho), e anti-cMyc ( 9E10, rato IgG1). controles do mesmo isotipo, IgG2a de ratinho (G155-178) e IgG1 de ratinho (MOPC-21), foram utilizados. As amostras de células foram tratadas com o reagente de bloqueio FcR (Miltenyi Biotec) durante 10 minutos, coradas com os mAbs fluorocromo-conjugados durante 30 min, e lavou-se 3 vezes com PBS /FCS (2%). amostras de células coradas foram analisadas utilizando um FACScan (Becton Dickinson) citómetro de fluxo.

Zymosan ensaio de fagocitose

As suspensões de células em DMEM /10% de FCS foram adicionadas a placas de cultura de 48 poços (2 × 10

5 células /alvéolo em 200 ul) e incubou-se a 37 ° C durante 2 horas para permitir que as células aderir às placas. partículas de zimosan A marcados com FITC (Molecular Probes) foram adicionadas aos poços (2 × 10

6 partículas /poço em 200 ul). Após incubação durante o período indicado, as células foram observadas ao microscópio (axio Observador Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e colhidas por tratamento com tripsina /EDTA para a análise de citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACScan.

Construção de vectores de expressão

um clone plasmídeo contendo cDNA para um fragmento da região variável de cadeia única (scFv) específico para humano HER2 /neu foi um presente de Lieberman (Addgene plasmídeo # 10794) [26]. A sequência scFv foi ligado por PCR com sequências de nucleótidos para uma marcação cMyc (EQKLISEEDL) e um fragmento C-terminal de ratinho FcyRI. O fragmento de ADN que codifica a proteína foi primeiro clonado pENTR-D-TOPO (Life Technologies) e subsequentemente transferido para um vector de expressão de mamífero pCAG-IRES-puro, o qual é conduzido pelo promotor de CAG e inclui um sítio de entrada do ribossoma interno (IRES) -puromycin

N cassete gene

-acetil-transferase. Os ADNc para o IFN-α humano, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, e ligando Fas foram fornecidos por NITE Biological Resource Center (Kazusa, Japão), Kazusa DNA Research Center (Kazusa, Japão), ou RIKEN BRC (Tsukuba, Japão). Um vector de lentivírus, CSII-EF, e construções de empacotamento foram gerados por H. Miyoshi (RIKEN BRC) e colegas [27]. Os fragmentos de cDNA foram inseridos no plasmídeo CSII-EF juntamente com fosfotransferase de higromicina-IRES para gerar as construções de expressão de lentivírus. lentivírus recombinante foi produzido e purificado por um método anteriormente descrito [21].

A geração de IPS-ML expressando scFv

Um vector de plasmídeo (pCAG-IRES-Puro) que codifica para o scFv anti-HER2 foi introduzido nas células por electroporação iPS humanos e seleccionados utilizando puromicina (5 ug /ml). Os clones estavelmente transfectadas foram isolados por um método anteriormente descrito [21]. Subsequentemente, os clones de células que transportem a construção de iPS scFv anti-HER2 foram colocadas em cultura de diferenciação para geração de IPS-MC /anti-HER2. O IPS-MC que expressam scFv específicos para HER2 foram transduzidas com vetores de lentivírus para cMyc mais BMI1 ou cMyc mais EZH2, para gerar iPS-ML. O método para gerar e manter iPS-ML tem sido relatado anteriormente [25].

A modificação genética das iPS-ML /scFv para expressar factores adicionais

iPS-ML foram transduzidas com a codificação do vetor lentivírus IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, ligando de Fas, ou TRAIL. Para seleccionar as células que expressam de forma estável os transgenes, as células foram cultivadas num meio contendo higromicina (0.5~2 mg /mL). Para quantificar a produção de citocinas derivadas de transgenes e FAS-ligando, foram cultivados os IPS-ML transfectadas (1 × 10

5 células /cavidade em 200 uL) em placas de 96 poços de cultura de fundo plano de 24 horas, e a concentração de citocinas e ligando do FAS-no sobrenadante da cultura foi medida por ELISA utilizando kits adquiridos a partir de Endogen ou R D Systems. expressão de TRAIL foi examinado por análise de citometria de fluxo.

Análise da sensibilidade das células de cancro para citocinas

NUGC-4 ou células MiaPaCa-2 foram cultivadas (4 × 10

5 células /poço em 1 mL) em placas de cultura de 24 poços na presença ou ausência de 10 ng /mL de recombinante de IFN-α, IFN-β, IFN-γ, ou TNF-α durante 24 horas. Subsequentemente, as células foram recuperadas e coradas com FITC anexina-V (Biovision, Mountain View, CA) e analisadas num citómetro de fluxo FACScan. A luciferase que expressam as células cancerígenas foram cultivadas (5 × 10

3 células /cavidade em 200 uL) em placas de cultura de 96 poços (B W Isoplate, Wallac) na presença de 10 ng /mL de recombinante de IFN-α, IFN -β, IFN-γ, ou TNF-α. Três dias mais tarde, a solução de substrato de luciferase (SteadyLite Além disso, Perkin-Elmer) foi adicionado (50 ul /poço), e a luminescência foi medida num leitor de micro-placa (Tristar, BertholdTech, Bad Wildbad, Alemanha).

Análise de actividade anti-tumoral de iPS-ML

in vitro

NUGC-4 células (5 × 10

3 células /poço) expressando luciferase foram cultivadas com ou sem iPS- ml (2,5 × 10

4 células /poço) em placas de 96 poços de cultura de fundo plano (B W Isoplate, Perkin-Elmer). Depois de uma cultura de 3 dias, a 50 uL /​​poço de solução de substrato de luciferase foi adicionado, e a luminescência foi medida num leitor de micro-placa.

Análise de infiltração IPS-ML em tecidos de cancro em ratinhos SCID

experimentos de rato foram aprovados pelo comitê de pesquisa animal da Universidade de Kumamoto. proteína de fluorescência verde (GFP) -expressing células NUGC-4 (5 × 10

6 células /rato) foram injectadas na cavidade peritoneal de ratinhos SCID. Após 15 dias, IPS-ML foram marcadas com PKH26 (Sigma), seguindo as instruções do fabricante, e foram intraperitonealmente (i.p.) nos ratinhos injectados (3 × 10

6 células /ratinho). Os ratinhos foram sacrificados no dia seguinte e submetido a análise de fluorescência para detectar a localização de macroscopicamente NUGC-4 tumores e IPS-ML em um nightowl II (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha). NUGC-4 /GFP foi detectado com 475 nm de excitação e 520 nm de emissão filtros, e IPS-ML foi detectado com 550 nm de excitação e 600 nm de emissão filtros PKH26-rotulados. Para análise microscópica, tecidos de cancro no omento maior foram removidas, fixadas em paraformaldeído a 4% /PBS, e embebidos em Tissue-Tek outubro composto (Sakura Finetechnical, Tóquio, Japão). As secções de tecido com uma espessura de 20 um foram feitas num crióstato e analisadas num microscópio de fluorescência (axio Observador Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Análise de actividade anti-tumoral de IPS-ML

in vivo

SCID foram ip injectado com as células cancerosas (5 × 10

6 células /ratinho). No dia 3 ou 4, os ratinhos foram submetidos a análise de imagem da luminescência para examinar o estabelecimento do tumor. Posteriormente, os ratos com tumores estabelecidos foram divididos aleatoriamente em grupos de tratamento e controle. Os ratinhos no grupo de tratamento foram injectados com IPS-ml de acordo com o cronograma indicado, e o crescimento de células de cancro foi monitorizada em ratinhos por análise de imagem de luminescência. A magnitude do crescimento do câncer foi determinada pela alteração das contagens totais de luminescência para cada rato.

Resultados

Caracterização de humanos iPS-células derivadas proliferação de células mielóides

Anteriormente estabeleceu um procedimento para gerar células mielomonocítica com proliferando capacidade (iPS-ML) por transdução mediada por lentivírus de cMyc além de IMC-1 em células mielóides humanas iPS derivadas de células iPS (-MC) [25]. IPS-ML cresceram principalmente em suspensão de uma maneira dependente M-CSF. Eles expressaram vários fabricantes de macrófagos, e eram heterogéneos na morfologia e na expressão de algumas das moléculas de superfície celular (Fig. 1A, B).

. Uma imagem de contraste de fase de IPS-vivo ml numa placa de cultura (superior) e uma imagem de IPS-ML coradas com May-Giemsa em uma lâmina de vidro (inferior) são mostrados. B. expressão na superfície celular de moléculas de marcador de macrófagos CD11b, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2, TLR4 e sobre IPS mL foi analisada por citometria de fluxo. Os perfis de coloração de mAb específico (linhas grossas) e um controlo de isotipo de mAb (área cinzenta) são mostrados. C. IPS-ML em placas de cultura foram adicionados com partículas de zimosan marcados com FITC. De contraste de fase (superior) e imagens de fluorescência (mais baixos) após uma incubação de 90 minutos são mostradas. D. Após uma incubação de 40 min na presença ou ausência de zymosans, as células foram recolhidas utilizando tripsina /EDTA e, em seguida, analisadas num citómetro de fluxo. Percentagens de células com alta intensidade de fluorescência indicando zymosan intracelular são mostrados. Claro E. Tempo para a fagocitose é mostrado. Os dados apresentados são média ± SD de ensaios duplicados.

Para analisar a capacidade fagocitária de iPS-ML, que microscopicamente observados a cultura iPS-ML após a adição de partículas de zimosan marcados com FITC. Após uma incubação de 90 min, os sinais de fluorescência foram detectados na maioria das células, indicando que a maior parte do IPS-ML ingerido partículas de zymosan (Fig. 1C). Aproximadamente 60% do IPS-ML continha partículas de zimosan após 40 min de incubação com partículas de zimosan marcados com FITC, como avaliado por análise de citometria de fluxo (Fig. 1D). Um curso de tempo para a fagocitose é mostrado na Figura 1E.

A actividade anti-câncer do iPS-ML expressando

in vitro

Um antígeno relacionado ao câncer anti-HER2 scFv, HER2 /neu, é expresso por vários tipos de cancros humanos, incluindo cancros da mama e gástricas [28]. Decidimos para examinar o efeito anti-cancro de IPS-ML expressando scFv anti-HER2 contra uma linha celular de cancro gástrico expressando HER2, NUGC-4 (Fig. 2A). Para este efeito, foram geradas IPS-ML expressando estavelmente anti-HER2 scFv (IPS-ML /anti-HER2) (Fig. 2B). IPS-ML /anti-HER2 foram gerados a partir de IPS-MC derivado de um clone de células iPS introduzido com um vector de expressão de scFv anti-HER2 por um método anteriormente descrito [21]. Nós esporadicamente examinou e confirmou a expressão do scFv por iPS-ML /anti-HER2.

A. HER2 expressão /neu em NUGC-4 células cancerosas gástricas humanas foi analisada. Os perfis de coloração de HER2 anti-mAb (linha grossa) e um anticorpo de controlo de isotipo (área cinza) são mostrados. B. expressão da superfície celular de anti-HER2 de scFv sobre IPS-ML (IPS-ML /anti-HER2) foi detectado por coloração com um anticorpo anti-cMyc-tag. C. luciferase-expressando NUGC-4 células (5 × 10

3 células /poço) foram cultivadas isoladamente ou co-cultivadas numa placa de cultura de 96 cavidades com (1 × 10

4 células iPS ml /poço ) com ou sem expressão anti-HER2 scFv. O número de células vivas NUGC-4 foi medido por actividade de luciferase após a cultura de 3 dias. Os dados são indicados como a média + SD de ensaios duplicados.

No primeiro, avaliou o efeito do iPS-ML /anti-HER2 contra células NUGC-4

in vitro

. Luciferase de pirilampo-introduzidas células NUGC-4 foram co-cultivadas com o IPS-ml com ou sem expressão de scFv anti-HER2. Observou-se que a IPS-ML reduzida células vivas NUGC-4, e que a expressão de anti-HER2 de scFv em IPS-ML aumentou o efeito inibidor contra o crescimento de células NUGC-4 (Fig. 2C).

Acumulação e infiltração de ip injetado iPS-ML em tecidos tumorais

Nós queríamos avaliar se iPS-ML tinha um efeito terapêutico sobre o câncer peritoneal disseminada. infiltração de macrófagos é frequentemente observada em amostras clínicas de tecido de câncer [1]. Foram examinados ou não i.p. administrados IPS-ML infiltrada em tecidos de cancro do pré-estabelecidos na cavidade peritoneal de ratos.

Para este fim, NUGC-4 células gástricas humanas cancerosas que expressam GFP, estabelecidas a partir de uma lesão metastática peritoneal de um-tipo difuso IP paciente de cancro, foram injectados por via gástrica em ratinhos SCID. Após 15 dias, IPS-ML marcado com corante fluorescente vermelho PKH26 foram injectados. Nós simultaneamente injectada activador do plasminogénio tecidual recombinante (tPA) dentro da cavidade peritoneal do rato, esperando que o tPA promoveu a infiltração de IPS-ML em tecidos tumorais. Os ratinhos foram sacrificados no dia seguinte, e dissecados para determinar a localização do injectados IPS-ML por análise de fluorescência

análise de fluorescência de GFP detecção macroscópica (excitação /emissão: 475/520 nm). Indicaram que NUGC-4 tumores localizados principalmente no omento maior (Fig. 3A). iPS-ML injetados detectados pelo PKH26 de fluorescência (excitação /emissão: 550/600 nm) também foram em sua maioria localizada no omento maior, demonstrando que iPS-ML eficiência acumulada nos tecidos tumorais. Tal acumulação clara de IPS-ML no omento maior não foi observada quando IPS-ml foram inoculados em ratinhos sem tumores estabelecidos (dados não mostrados).

. células NUGC-4-expressando GFP (5 × 10

6 células /rato) foram injectadas na cavidade peritoneal de ratinhos SCID. Após 15 dias, IPS-ML PKH26 marcado com fluorescentes foram injectados i.p. nos ratinhos (3 × 10

6 células /ratinho). Os ratinhos foram sacrificados no dia seguinte e submetido a análise de imagem de fluorescência para determinar a localização dos tumores NUGC-4-GFP (excitação /emissão: 475/520 nm) e PKH26-IPS-ML (excitação /emissão: 550/600 nm ). B. tecidos tumorais no omento maior dos ratinhos foram isoladas e 20 mícrons de espessura secções congeladas foram feitas. Os cortes foram analisados ​​em um microscópio de fluorescência, e uma imagem mesclada com fluorescência verde indicando NUGC-4 células /GFP e fluorescência vermelha, indicando manchado de PKH26 iPS-ML é mostrado. C, D As secções de tecido foram feitas por um procedimento semelhante ao do B, excepto que o tPA não foi usada. Uma visão maior ampliação da região rodeada por um quadrado pontilhada em C é mostrado na D.

Em seguida, isolado e microscopicamente examinado os tecidos tumorais. Na secção de tecido mostrado na Figura 3B, PKH26-rotulados IPS-ML infiltrado no ninho de células NUGC-4-expressando GFP. Experiências semelhantes foram realizadas sem injecção de tPA, e maior ampliação análise das secções de tecido demonstra claramente a infiltração de IPS-ML em tecido de cancro (Fig. 3C e D). Estes resultados indicam que a IPS-ML eficientemente infiltrado nos tecidos de cancro, quando i.p. injetado em camundongos portadores de cânceres estabelecidos na cavidade peritoneal.

Não há atividade anti-câncer do iPS-ML expressar anti-HER2 scFv

in vivo

A seguir, examinou o efeito de iPS-ML /anti-HER2 contra NUGC-4

in vivo

. células NUGC-4 que expressa luciferase foram inoculados na cavidade peritoneal de ratinhos SCID (5 × 10

6 células /ratinho). Após 3 dias, o enxerto de células de cancro em ratinhos foi examinado por análise de bioluminescência, e ratinhos portadores de células cancerosas foram divididos aleatoriamente em grupos de tratamento ou de controlo. De 4 a 8 dias, os ratos grupo de tratamento foram injectados diariamente com IPS-ML /anti-HER2 (2 × 10

7 células /ratinho). No dia 10, os ratinhos foram submetidos a análise de bioluminescência novamente para examinar a progressão do cancro.

Como se mostra na Figura S1, NUGC-4 tumores nos ratinhos tratados com IPS-ML cresceu ainda mais rápido do que na ratinhos de controlo. Eles sim valorizado crescimento de células cancerígenas NUGC-4 nesta

in vivo

modelo, embora estatisticamente não significativa. Isso pode ser porque iPS-ML /anti-HER2 foram afetados pelo microambiente do câncer de adquirir um fenótipo pró-câncer.

Sensibilidade do NUGC-4 células para citocinas e moléculas que matam células

para fazer iPS-ML capaz de superar o microambiente do câncer e para exercer efeitos anti-câncer

in vivo

, determinou-se para modificar mais iPS-ML /anti-HER2 para expressar moléculas adicionais. As citocinas, tais como IFN, são conhecidos para induzir a morte ou inibir o crescimento de células cancerosas [29], [30]. Além disso, estas citoquinas são conhecidos por aumentar a actividade anti-cancro dos macrófagos [31] – [33].

Analisou-se a sensibilidade das células NUGC-4 ao IFN-α recombinante, IFN-β, IFN -γ, ou TNF-α. Após uma incubação de 24 horas na presença quer destes factores (10 ng /mL), analisou-se a apoptose por coloração das células com FITC anexina-V. Observou-se que todas as citocinas testadas induzida certos níveis de NUGC-4 apoptose celular (Fig. S2A). Para examinar o efeito de reduzir o número de células vivas NUGC-4, células NUGC-4 que expressa luciferase foram cultivadas durante 3 dias na presença destes factores. Consistente com os dados de anexina-V-coloração, todas as citoquinas testadas diminuíram significativamente o número de células vivas NUGC-4 (Fig. S2B). Em ambos os ensaios, o IFN-β e IFN-γ exibiu o efeito mais profundo.

A geração de IPS-ML /anti-HER2 que expressam moléculas adicionais

gerados vectores de expressão de lentivírus para os IFNs e TNF-α, e introduziu-los em iPS-ML /anti-HER2. Além disso, nós introduzimos os vectores de expressão lentivírus para “fatores de indução de apoptose”, FAS-ligando ou TRAIL. Fomos capazes de gerar iPS-ML transfectadas que produzem citocinas em mais de 3 ng /24 hora /10

6 células, com excepção para o IFN-γ (Fig. S3A). Poderíamos gerar transfectantes IPS-ML produzindo apenas um baixo nível de IFN-γ, provavelmente por causa da toxicidade dos IFN-γ para IPS-ML. expressão na superfície celular de TRAIL nos IPS-ML transfectadas foi confirmada por análise de citometria de fluxo (Fig. S3B).

co-cultivadas as iPS ml /anti-HER2 que expressam moléculas anti-cancro adicionais luciferase- expressando NUGC-4 células e analisaram o número de células vivas NUGC-4 com base na actividade de luciferase depois de 3 dias (Fig. 4). IPS-ML /anti-HER2 que expressa IFN-α, IFN-β, ou TRAIL mostraram um efeito mais profundo para reduzir células NUGC-4 de IPS-ML /anti-HER2, e os que expressam IFN-β foram os mais potentes. IPS-ML /anti-HER2 que expressa IFN-γ ou TNF-α exibiu um efeito semelhante ao IPS-ML /anti-HER2. A falta de aumento significativo do NUGC-4 anti-efeito pela transdução de IFN-γ pode ser devido a que a quantidade de IFN-γ produzido pela IPS-ML /anti-HER2 /IFN-γ foi menor do que o nível de exercer anti efeito -Câncer. Nesta experiência, a expressão forçada de ligando do FAS-inesperadamente enfraqueceu a NUGC-4-anti efeito de IPS-ML /anti-HER2.

NUGC-4 células que expressam luciferase foram cultivadas numa placa de cultura de 96 poços (5 × 10

3 células /cavidade) com o iPS-ML /anti-HER2 que expressa IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, ligando de Fas, ou TRAIL (2,5 × 10

4 células /cavidade). O número de células vivas NUGC-4 foi medido por análise de luminescência após a cultura de 3 dias. Os dados são indicados como a média + SD de ensaios em triplicado.

O efeito terapêutico das iPS-ML /IFN-β sobre peritoneal disseminada NUGC-4 células cancerosas gástricas em ratos SCID

com base nos resultados de

in vitro

experimentos, examinamos a

in vivo

-NUGC-4 anti efeito do iPS-ML /anti-HER2 que manifestou o IFN-α, IFN-β, ou TRAIL. O tratamento com nem IPS-ML /anti-HER2 /IFN-α nem IPS-ML /anti-HER2 /TRAIL mostraram efeito inibidor evidente sobre o crescimento de células cancerosas

In vivo

(dados não mostrados). Por outro lado, IPS-ML expressar o IFN-β exibiram efeito significativo para inibir o crescimento do cancro, como descrito abaixo.

Nas experiências mostradas na Figura 5, o crescimento de tumores NUGC-4 foi monitorizada por meio de bioluminescência análise nos dias 4, 10 e 17 após a inoculação de células de cancro. Os ratinhos portadores NUGC-4 tumores no dia 4 foram divididos em grupo de terapia ou sem terapia (controlo). Os murganhos dos grupos de terapia foram injectados i.p. com iPS-ML /IFN-β ou iPS-ML /anti-HER2 /IFN-βfrom dia 4 (2 × 10

7 células /injecção /rato, 3 injecções por semana). A Figura 5A mostra os dados de imagem da análise luminescência dos ratinhos. Figura 5B indica a alteração vezes a actividade de luminescência a partir de 4 dias dos grupos de controlo e de tratamento, demonstrando que o crescimento tumoral foi inibido pelo tratamento com IPS-ML /IFN-β ou IPS-ML /anti-HER2 /IFN-β. iPS-ML /IFN-β e iPS -ML /anti-HER2 /IFN-β foram equivalentemente eficazes, indicando que a expressão de anti-HER2 é dispensável para efeito anti-câncer de iPS-ML produção de IFN-β.

células NUGC-4 que expressa luciferase foram injectados em ratinhos SCID (5 × 10

6 células /mouse). No dia 4, os ratinhos foram submetidos a análise de imagem de luminescência. Os ratos foram injectados nos dias 4, 6, 8, 11, 13 e 15 com iPS-ML /IFN-β ou iPS-ML /IFN-β /anti-HER2 (2 × 10

7 células /rato para cada injecção, n = 5 para cada grupo). Como um controlo, 8 ratinhos foram deixados sem tratamento. Todos os ratinhos foram submetidos a análise de bioluminescência nos dias 10 e 17. A. As imagens são mostradas luminescência. B. Para cada ratinho, o sinal de luminescência foi calculada como um valor relativo, em que o fotão contar no dia 4 foi definido como 1. A média ± DP da prega-mudança desde o dia 4 em grupos de controlo e de tratamento são mostrados.

a figura S4 mostra os resultados de experiências semelhantes para analisar comparativamente os efeitos de iPS-ML, iPS-ML /IFN-β, iPS-ML /anti-HER2, e IFN-β recombinante contra o cancro NUGC-4

in vivo

. Em consistentes com os dados mostrados na Figura 5, o tratamento com o IPS ml /IFN-p suprimiu significativamente a progressão do cancro. Por outro lado, ambos os IPS-ML e IPS-ML /anti-HER2 em vez promovido o crescimento do cancro, embora estatisticamente não significativo. A injecção de 400 ng, mas não a 200 ng /murganho /injecção de IFN-β recombinante no mesmo esquema como a injecção IPS-ML exibiu algum efeito inibitório sobre o crescimento do tumor, embora o efeito não foi estatisticamente significativo.

Colectivamente , simples iPS-ML não apresentou efeito anti-câncer

in vivo

. A modificação genética para produzir IFN-β conferido significativa actividade anti-câncer para iPS-ML. Por outro lado, a expressão de anti-HER2 scFv não tem esse efeito.

O efeito terapêutico das iPS-ML /IFN-β contra o câncer de pâncreas em um modelo de xenotransplante

A seguir, examinou o efeito do iPS-ML /tratamento de IFN-β contra células de câncer pancreático. A adição de IFN-β recombinante para MiaPaCa-2 pancreáticas células cancerosas humanas apoptose induzida e reduziu o número de células vivas em

in vitro

experiências (Fig. S5).

Foi examinado o efeito do iPS-ML /IFN-β contra células MiaPaCa-2

in vivo

. Poderíamos estabelecer um modelo de câncer peritoneal por injecção i.p. injecção das células MiaPaCa-2 que expressam a luciferase em ratinhos SCID. Nas experiências apresentadas na Figura 6, 6 os ratinhos foram tratados com injecção de IPS-ML /IFN-β 3 vezes por semana durante 2 semanas a partir de 4 dias; os resultados dos ratinhos de controlo 8 sem tratamento, também são mostrados. Observou-se que o tratamento IPS-ML /IFN-β inibiu significativamente o crescimento do tumor MiaPaCa-2, em comparação com ratinhos de controlo. A diminuição da luminescência médio contar desde o dia 10 até ao dia 17 do controlo (sem tratamento) grupo deve ter sido devido ao aumento de ascites causadas pelo cancro, porque observou-se aumento progressivo do abdómen na ratinhos deste grupo. Os resultados mostrados na Figura 6 sugerem que a terapia com o IPS-ML /IFN-β é eficaz contra o cancro pancreático. I.p.

células MiaPaCa-2 que expressam luciferase foram inoculados em ratinhos SCID (5 × 10

6 células /ratinho), e os ratinhos foram submetidos a análise de imagem luminescência no dia 3. Os ratinhos enxertados com células cancerosas foram divididos aleatoriamente em tratamento (n = 6) e de controlo (N = 8 ) grupos. Os ratos no grupo de tratamento foram injectados com iPS-ML /IFN-β (2 × 10

7 células /mouse para cada injeção) nos dias 4, 6, 8, 11, 13 e 15. Todos os ratos foram submetidos a análise bioluminescência nos dias 10 e 17. as imagens de luminescência são mostrados em A. Para cada ratinho, a alteração do sinal de luminescência por ratinho foi calculada como um valor relativo, em que a contagem de fotões no dia 3 foi definido como 1. a média ± SD da mudança vezes em grupos de controle e tratamento são mostrados na B.

Discussão

a infiltração de macrófagos é frequentemente observada em amostras clínicas de tumores sólidos, e estes macrófagos são chamados TAM. No presente estudo, observou-se que i.p. IPS-ML injectadas eficientemente acumulada e infiltrado nos tecidos pré-estabelecido de cancro na cavidade peritoneal de ratinhos SCID (Fig. 3).