Abstract

Fundo

Um polimorfismo de nucleotídeo único comum (SNP), rs10795668, localizado em 10p14, foi identificado pela primeira vez a ser significativamente associada com o risco de câncer colorretal (CRC) por um genoma estudo de associação -wide (GWAS) em 2008; No entanto, outro GWAS e seguintes estudos de replicação resultados conflitantes.

Métodos

Foi realizado um estudo de 470 casos e 475 controles de caso-controle em uma população chinesa e, em seguida, realizaram uma meta-análise, integrando o estudo atual e 9 publicações para avaliar a associação entre rs10795668 e risco de CRC. Heterogeneidade entre os estudos e viés de publicação foram avaliados pelo

χ

2

baseado teste estatístico Q e teste de Egger, respectivamente.

Resultados

No caso-controle observou estudo, associação significativa entre o SNP e risco de CRC, com per-a-alelo OR de 0,71 (IC 95%: 0,54-0,94,

P

= 0,017). A seguinte meta-análise confirmou ainda mais a associação significativa, com per-A-alelo OR de 0,91 (95% CI: 0,89-,93,

P

heterogeneidade Art 0,05) na população europeia e 0,86 ( IC 95%: 0,78-0,96,

P

heterogeneidade 0,05) na população asiática. Além disso, análises de sensibilidade e avaliação viés de publicação indicou a estabilidade robusta e fiabilidade dos resultados.

Conclusões

Os resultados de nosso estudo de caso-controle ea meta-análise seguiu confirmou a associação significativa de rs10795668 com o risco de CRC

Citation:. Qin Q, Liu L, Zhong R, Zou L, Yin J, Zhu B, et al. (2013) a variante genética no cromossomo 10p14 está associada a risco de câncer colorretal: resultados de um estudo caso-controle e uma meta-análise. PLoS ONE 8 (5): e64310. doi: 10.1371 /journal.pone.0064310

editor: Struan Frederick Airth Grant, Hospital Infantil da Filadélfia, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Janeiro, 2013; Aceito: 10 de abril de 2013; Publicado em: 22 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Qin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (NSFC-81172752, e NSFC-81222038) e o plano de introdução de talentos de Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (Li Liu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Xiao-Ping Miao é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum em homens ea segunda em mulheres, com mais de 1,2 milhões de novos casos e 608,700 mortes em 2008, em todo o mundo [1]. Nos países desenvolvidos, de acordo com a base de dados e Vigilância Epidemiologia Resultados Finais, CRC é a segunda principal causa de morte por cancro nos países desenvolvidos, com o risco de vida estimada em 5-6% [2]. Nos países em desenvolvimento, como a China, a taxa de incidência de CRC têm crescido rapidamente nas últimas décadas, especialmente em áreas urbanas [3]. Xangai, como uma cidade desenvolvida na China, experimentou um aumento anual de 4,2% na incidência de câncer colorretal, que foi ainda maior do que o nível global (2%) [4].

CRC é provocada pelas interações entre genética e fatores ambientais. Entre todas as causas do CRC, herdada factores genéticos são responsáveis ​​por aproximadamente 35% da etiologia da doença [5]. No entanto, as mutações de alta penetrância, como aqueles em

APC

,

SMAD4

e

MMR

genes, são responsáveis ​​por menos de 5% dos casos na patogênese da CRC [6]. Ligeira ou moderadamente alelos penetrantes poderia explicar cerca de 8,3% de etiologia em casos de agregação familiar [7], [8]. Espera-se que a proporção remanescente de susceptibilidade hereditária é susceptível de ser explicado por variantes de baixo risco [6].

estudos de associação

Genome-largos (GWAS), que tornaram possível a genotipagem de centenas de milhares de única polimorfismos de nucleotídeo (SNPs) que tag desequilíbrio de ligação (LD) blocos no genoma, identificaram com sucesso novela loci susceptibilidade para CRC [9] – [19]. Entre esses loci, o SNP, rs10795668, localizado na 10p14, em primeiro lugar foi identificado por Tomlinson, IP et al. a ser significativamente associada com o risco CRC em um 4-fase GWAS com 18831 casos e 18540 controles nos europeus [18]. No entanto, um outro GWAS relatado por Peters, U. et ai. encontrado nenhum papel desta variante no CRC susceptibilidade por um conjunto de teste de 2906 casos e 3416 controles e 10 conjuntos de replicação de 8161 casos e 9101 controles nos europeus [17]. Em estudos de replicação, alguns fornecida evidência estatística deste SNP para CRC risco [20] – [22], no entanto, muito mais conseguiram reproduzir essa associação [6], [23] – [28]. Além disso, rs10795668 exibiu uma diferença de população entre as populações americanas europeus, japoneses e africanos [23]. Desde padrões de freqüência e LD alélicas em diferentes populações são diferentes, esta variante tem de ser replicado para determinar seu papel no desenvolvimento CRC. Os estudos de replicação da associação entre o polimorfismo rs10795668 e CRC foram realizados nas regiões Norte, Sul e Hong Kong Chinese [20], [22], [25]. Aqui, foi realizado um estudo de replicação compreendendo 470 casos e 475 controles na central chinês. Além disso, uma meta-análise combinando o estudo atual e estudos publicados anteriormente sobre rs10795668 foi ainda realizado para esclarecer a relação entre este SNP e risco de CRC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional de Tongji Medical College da Universidade Huazhong da Ciência e Tecnologia. E todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar neste estudo.

populações de estudo

A população do estudo consistiu de 470 casos de CRC com CRC recém-diagnosticados e 475 controles sem câncer. Os pacientes foram recrutados consecutivamente entre 1 de Janeiro de 2007 e 31 de novembro de 2009 na Oitava Hospital de Wuhan, centro da China, que é um hospital especializado em doenças colorretais e absorvendo maioria dos doentes com câncer colorretal em Wuhan e regiões próximas. Controles eram indivíduos sem câncer que vivem na cidade e as regiões circundantes Wuhan, que foram selecionados de um grupo de voluntários saudáveis ​​que visitam o centro de check-up de saúde no mesmo hospital durante o mesmo período do recrutamento de pacientes com CCR. Os critérios de inclusão para pacientes incluídos histologicamente confirmados CRC, sem quimioterapia ou radioterapia e nenhuma restrição em relação ao sexo, idade ou estágio da doença. Casos com relatório da patologia designada polipose adenomatosa familiar, doença inflamatória intestinal, adenoma colorretal, síndrome de Lynch, tuberculose intestinal e esquistossomose não eram elegíveis. Os critérios de selecção para os controlos incluídos indivíduos livres de câncer e frequência combinados para casos por sexo e idade (± 5 anos). Todos os indivíduos eram independentes chineses Han étnicas. Os dados demográficos e de informação estilo de vida, e médicos foram coletados por entrevistadores treinados através de entrevista direta, utilizando questionários padronizados. Os dados clínicos foram extraídos dos prontuários hospitalares. sangue venoso periférico de 5 ml foi retirada de cada participante.

A genotipagem

DNA genômico foi extraído de amostra de sangue periférico usando o RelaxGene Sangue Sistema DP319-02 (Tiangen, Beijing, China) de acordo com as instruções do fabricante. O SNP rs10795668 foi genotipados usando a plataforma Sequenom MassARRAY (Sequenom San Diego, CA, EUA). Genótipos foram chamados usando software MassARRAY Typer 4.0 [29], [30]. Para garantir o controle de qualidade, 5 amostras% duplicados foram selecionados aleatoriamente para avaliar a reprodutibilidade, com uma taxa de concordância de 100%.

A análise estatística

Hardy-Weinberg (HWE) foi testado por um goodness-of-fit

χ

2

teste para comparar as freqüências genotípicas observadas para as freqüências genotípicas esperadas nos controles. Pearson

χ

2

teste foi utilizado para comparar as diferenças na distribuição das variáveis ​​categóricas (sexo, tabagismo, uso de álcool e história familiar de câncer) e de Student

t

-test WAS usados ​​para variáveis ​​contínuas [idade e índice de massa corporal (IMC)]. Para o SNP com freqüência do alelo menor (MAF) de 0,35, o poder de nosso tamanho da amostra foi calculada em 0,72 para detectar um OR de 0,7 em estudo caso-controle.

Para o efeito principal do rs10795668, incondicional Regressão logística foi realizada para calcular odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC), ajustados para potenciais fatores de confusão (idade, sexo, tabagismo, uso de álcool e IMC). RUP e ICs de 95% como as métricas de tamanho de efeito foram calculados para genótipos AG contra GG e AA contra GG. A fim de evitar a suposição de modelos genéticos, modelos dominantes, recessivos e de aditivo foram também analisadas. análises interação gene-ambiente de dois fatores foram avaliados por meio de testes de razão de verossimilhança comparando modelos aninhados com apenas efeitos principais e os modelos com efeitos principais e o termo de interação relevante. Existem factores ambientais, como tabagismo, uso de álcool e IMC, foram incluídas nos modelos de interação. De acordo com a conclusão da Consulta de Especialistas da OMS, o IMC ponto de corte para sobrepeso para o chinês foi definida para ser de 24 kg /m

2 [31]. O método de Bonferroni foi aplicado para correção de comparação múltipla. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS 12.0 (SPSS, Inc., Chicago, III) e todos

P valores

foram bicaudais testado com um nível significativo de 0,05.

Meta-análise de rs10795668 em associação com CRC risco

para investigar a associação entre rs10795668 e risco de CRC, uma meta-análise foi conduzida de acordo com as orientações dos itens de relatório preferido para revisões sistemáticas e meta-análises (PRISMA) declaração (https://www.prisma-statement.org) (Checklist S1).

a sistemática da literatura de busca foi realizada no PubMed /MEDLINE e ISI web of Science sem linguagem restrição até o final de novembro, 2012. a estratégia de pesquisa foi baseada em combinações dos termos “rs10795668 ou 10p14” e “câncer colorretal ou neoplasia colorretal”. Para estender a cobertura das nossas pesquisas, foram realizados mais pesquisas na base de dados biomédica chinês (CBM) com base na mesma estratégia [32]. Além disso, referências em artigos recuperados foram digitalizados. Críticas, comentários e cartas também foram verificados por estudos adicionais. Pesquisando foi realizada em duplicata por dois revisores independentes (Qin Qin e Li Liu)

Os estudos foram incluídos se encontrou com o todos os seguintes critérios: (1). Estudo original; (2) avaliação da associação entre rs10795668 e risco de CRC; (3) O projeto de caso-controle ou estudo de coorte; (4) fornecimento de odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC 95%) ou dados suficientes para o respectivo cálculo correspondente; (5) estudos de seres humanos; (6) os genótipos de rs10795668 nos controles estão em HWE. Deixamos a cabo investigações em indivíduos com síndrome de Lynch. Relatos de Casos, comentários, revisões e editoriais também foram excluídos. Se os estudos tiveram temas que se sobrepõem, somente o estudo com a maior população foi finalmente incluído. Se mais de uma população geográfica ou étnica foram incluídos em um relatório, cada população foi considerada separadamente. Todos os dados foram extraídos independentemente por dois revisores (Qin Qin e Li Liu) e qualquer divergência foi julgado por um terceiro autor (Rong Zhong)

As informações a seguir foi extraído de cada estudo:. Primeiro nome do autor, ano de publicação , país de estudo, a etnia da população do estudo, desenho do estudo, tipo de estudo, método de genotipagem, o número de casos e controles, fonte de controle, MAF. HWE nos controles foi estimada novamente na meta-análise pela bondade-of-fit

χ

2

teste (

P Art 0,01) [33] – [35]. frequência combinada de alelo A rs10795668 em diferentes grupos étnicos foi estimada utilizando o método de variância inversa descrito por Thakkinstian A et al. [36]. A heterogeneidade estatística entre os estudos incluídos na meta-análise foi avaliada pela

Q de Cochran

-statistic e considerado significativo em

P Art 0,05 [37]. O

I

2

estatística foi então utilizados para estimar quantitativamente a heterogeneidade (

I

2

= 0-25%, sem heterogeneidade;

I

2

= 25-50%, a heterogeneidade moderada;

I

2

= 50-75%, grande heterogeneidade;

I

2

= 75-100%, extrema heterogeneidade ) [38]. O modelo de efeitos fixos, pela variância inversa, foi usado para calcular a estimativa agrupada quando heterogeneidade foi insignificante; caso contrário, foi aplicado o modelo de efeitos aleatórios, por DerSimonian e método Laird [39]. A análise de sensibilidade foi realizada para avaliar a influência de cada estudo sobre estimativa global por sequencial remoção de cada estudo [40]. viés de publicação foi estimada pelo gráfico de funil e teste de Eegger [41], [42]. Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa estatístico STATA (version11.0; Stata Corporation, College Station, Texas) e todos

P valores

foram bicaudais testado com um nível significativo de 0,05

resultados

resultados do Estudo de caso-controle

as características da população.

as características dos sujeitos do estudo foram detalhados na Tabela 1. Não houve diferenças significativas na distribuição de idade, sexo e uso de álcool entre os casos e controles. A idade média [± desvio padrão (SD)] foi de 58,1 (± 11,6) anos para os casos e 58,4 (± 13,1) anos de idade para os controles (

P

= 0,652). Mais fumantes foram observados nos casos do que nos controles (

P Art 0,001). Além disso, o IMC em casos foi significativamente maior do que nos controles (

P

= 0,023).

Associação análise.

Os dados de genótipos de rs10795668 para casos e controles foram apresentados na Tabela 2. A distribuição dos genótipos nos controles cumpridos Hardy-Weinberg (

P

= 0,433). foi observada diferença significativa na distribuição dos genótipos entre os casos e controles (

χ

2

= 9,89,

P

= 0,007). No modelo de regressão logística incondicional, indivíduos com o genótipo AA mostraram uma significativa diminuição do risco CRC comparados com os portadores do genótipo GG (OR = 0,51, 95% CI: 0,28-0,94). No modelo de alelos, A portadores do alelo também mostrou redução significativa do risco em comparação com aqueles com os portadores do alelo G (OR = 0,70, 95% CI: 0.52-0.93). Além disso, de forma significativa diminuição do risco de CRC também foi encontrado no modelo de aditivo, com per-A-alelo OR de 0,71 (95% CI: 0,54-0,94). Da mesma forma, associação significativa entre este polimorfismo e diminuição do risco CRC foi encontrado no modelo dominante (OR = 0,65 IC 95%: 0,44-0,96). Enquanto não foram encontradas associações significativas para a AG contra GG e modelo recessivo. Analisa

Two-fator de interação gene-ambiente.

Para explorar as interações potenciais entre rs10795668 e tabagismo, álcool usar e IMC, foi realizada de dois fatores interação gene-ambiente análises de regressão logística não condicional. Os resultados foram apresentados na Tabela 3. Não houve interação significativa foi encontrada de acordo com o

P valor do termo de interação

(

P

≥0.017). Entre os indivíduos com BMI≥24 kg /m

2, carrega com AA e AG genótipos apresentaram significativamente menor risco de CRC em comparação com aqueles com o genótipo GG, com um OR de 0,45 (IC 95%: 0,22-0,91). No entanto, a associação não foi encontrada entre os indivíduos com IMC .. 24 kg /m

2

Resultados da Meta-análise

Características dos estudos incluídos

Como se mostra na Figura 1, 31 artigos potencialmente relevantes foram identificados e rastreados, dos quais, 17 artigos preencheram os critérios de inclusão. No entanto, após um exame mais aprofundado, foram excluídos 4 estudos [26] – [28], [43] para a inclusão de pacientes com síndrome de Lynch e outros 4 estudos [44] – [47] para conter sobrepostas participantes com os estudos incluídos. Finalmente, combinando o estudo, um total de 10 publicações [6], [17], [18], [20] – [25] com 14 conjuntos de data que compreendem 39341 casos e 41566 controles foram incluídos na meta-análise (Tabela 4). Destes, 7 estudos foram conduzidos nos europeus, 5 em asiáticos e 2 em afro-americanos. Genótipos de rs10795668 nos controles conformados com Hardy-Weinberg para todos os estudos incluídos (

P Art 0,01)..

freqüência de um alelo em populações de controle

Não foi observada uma heterogeneidade significativa nos grupos americanos europeus e africanos (

P

heterogeneidade

= 0,236 e 0,462, respectivamente). A frequência combinados usando o modelo de efeitos aleatórios fixa foram (IC 95%: 0,322-0,333) 0,327 nos controlos europeus e (IC 95%: 0,051-0,075) 0,063 nos controles afro-americanos. Houve heterogeneidade significativa entre os estudos asiáticos (

P

heterogeneidade Art 0,001), e a frequência reunidas era 0,385 (IC 95%: 0,352-0,419), sob modelo de efeitos aleatórios. Estas frequências combinadas foram semelhantes aos relatados na base de dados dbSNP de 0,353, 0,390 e 0,065 para os europeus, asiáticos e afro-americanos, respectivamente. Por causa da distribuição de freqüência diferente dos rs10795668 SNP em diferentes populações, a meta-análise foi iniciada em cada grupo étnico separado.

A meta-análise de rs10795668 no associada a CRC.

Como mostrado na Tabela 5, apenas em evidências significativas grupo asiático de heterogeneidade foi detectada (

P

heterogeneidade

= 0,031,

I

2 = 62,3%), portanto RUP no Asian grupo foram reunidas sob o modelo de efeitos aleatórios, e RUP no grupo americano Europeu e Africano ambos foram agrupados sob o modelo de efeitos fixos. associação significativa entre a variante eo risco CRC foi encontrada, tanto em grupos europeus e asiáticos, com RUP (IC 95%: 0,89-0,93) 0,91 (Figura 2) e (IC 95%: 0,78-0,96) 0,86 (Figura 3), respectivamente. Enquanto, no grupo americano Africano, a variante mostrou associação inversa fronteira com o risco de CRC (OR = 1,24, 95% CI: 0,99-1,56) (Figura 4)

para os conjuntos de dados europeias, a análise adicional sem o estudo inicial [18] foi realizada, de modo a evitar a polarização. Após a exclusão de amostras do estudo original, a associação entre a variante eo risco CRC ainda era significativo, com OR de 0,94 (IC 95%: 0,90-0,98,

P

heterogeneidade

= 0,242) (Figura S1) .

análise de sensibilidade.

Para avaliar a influência de cada estudo individual sobre o aditivo em pool ou, análises de sensibilidade foi realizada através da remoção do estudo sequencialmente individual. Como mostrado na Figura S2, as RUP agrupados foram semelhantes antes e após a exclusão de cada estudo, indicando a estabilidade robusta dos resultados atuais.

O viés de publicação.

plot Funil e teste de Egger foram utilizado para avaliar o viés de publicação. Conforme reflectido na Figura S3, a forma do gráfico de funil parecia simétrico. Eo teste de Egger não detectar qualquer viés de publicação (Tabela 5).

Discussão

O rs10795668 SNP localizado na 10p14 foi revelado pela primeira vez para ser associado com o risco de CRC por um estudo GWA múltiplos estágios, mas resultados inconsistentes foram relatados seguindo estudos. O estudo caso-controle encontraram uma associação significativa entre o polimorfismo rs10795668 e risco de CRC na população chinesa. Em seguida, a seguinte meta-análise também sugeriu que o SNP foi significativamente associada com o risco de CRC. Esta meta-análise foi o primeiro a integrar os estudos GWA publicados e estudos de replicação para esclarecer o efeito da variação rs10795668 sobre o risco de CRC.

O SNP mapas rs10795668 para um bloco de LD de 82 kb (8,73-8,81 Mb) dentro 10p14 [18]. IP Tomlinson et al. investigou três SNPs adicionais de participação neste bloco LD (rs706771, rs7898455 e rs827405) e não encontrou nenhuma evidência de locus de mais de uma doença na região [18]. Como a maioria de risco variantes identificadas por GWAS, rs10795668 reside fora das regiões codificantes dos genes. Os genes mais próximo previstos são

BC031880

, localizado 0,4 Mb proximal para rs10795668, e

LOC389936

, localizado 0,7 Mb distalmente. Embora as variantes rs10795668 foram encontrados para ser associada com o risco de CRC, pouco se conhece sobre a função do SNP. Para investigar possíveis funções de regulação na expressão de genes vizinhos, Loo LW realizou análise de cis-expressão quantitativa locos de características e encontrou uma associação significativa entre o alelo baixo colorectal risco de câncer (A) para rs10795668 em 10p14 e aumento da expressão de

ATP5C1

[48].

ATP5C1

codifica a subunidade gama do núcleo catalítico (F1) da ATP sintase mitocondrial, o complexo enzima responsável pela síntese de ATP, conhecida por desempenhar um papel central na respiração celular. Um evento comum em células tumorais é a chave de respiração metabólica (na mitocôndria) de glicólise (no citosol), muitas vezes referido como “o efeito Warburg” [49]. Vários mecanismos podem iniciar este interruptor, um dos quais é um decréscimo na expressão da subunidade beta da sintase ATP (F1) (

ATP5B

), que conduz à ruptura da função catalítica do complexo ATP sintase, um evento que foi anteriormente observado em vários tipos de cancro [50], [51]. A expressão aumentada de

ATP5C1

associado com o alelo A em rs10795668 seria consistente com a manutenção das actividades de ATP-sintase e a respiração celular e potencialmente inibir a progressão do tumor para o cancro colorectal. No entanto,

ATP5C1

, at10p15.1 localizado, não é o gene mais próximo vizinho. Alguns estudos [52], [53] sugere que as variantes de risco não pode GWAS preferencialmente regular os genes que são mais próximo. Os mecanismos reguladores da transcrição impactados por status alélica pode envolver complexos estados e função de confirmação da cromatina dentro de um contexto específico do tecido. Adicionalmente, a maioria das variantes identificadas por GWAS implica a probabilidade de estar em ligação com as “verdadeiras” variantes causais [54], por isso é possível que o polimorfismo está em desequilíbrio de ligação com loci de causalidade “real”. Além do mais, a compreensão da função biológica destes loci, concentrando-se em variantes não-codificantes, talvez seja o maior desafio na era do ‘pós-GWAS “[55].

Os resultados meta-análise mostrou associação significativa entre a rs10795668 variante e risco CRC tanto na população europeia e asiática, mas em afro-americanos a associação foi marginalmente significante e na direção oposta. O pool A freqüência do alelo através diferente população de etnia variada. Além disso, observou-se que Kupfer SS et ai. também constatou que houve heterogeneidade genética em associações CRC em americanos de Africano contra descendentes de europeus [24]. As análises de sensibilidade e avaliação viés de publicação indicou os resultados atuais deste meta-análise eram confiáveis.

Algumas limitações no estudo de caso-controle e meta-análise precisam ser abordadas. Em primeiro lugar, o tamanho da amostra do nosso estudo de caso-controle foi relativamente pequeno, resultando no poder estatístico relativamente inadequada. Em segundo lugar, na meta-análise, o número de estudos publicados ainda era insuficiente para as análises em grupo americano Asiático e Africano, que pode mascarar ou exagerar a possível verdadeira associação. Em terceiro lugar, embora a associação significativa entre rs10795668 e CRC foi confirmada neste estudo, as experiências funcionais não têm sido feito, por isso se esta variante está protegendo permaneceu incerto.

Em conclusão, nosso estudo de caso-controle em uma Chinese população ea meta-análise verificou que a rs10795668 variante foi significativamente associada com o risco de CRC. Além disso verificação funcional devem ser realizados para confirmar os resultados, que podem ajudar a desvendar os mecanismos subjacentes desta variante no desenvolvimento CRC e progressão.

Informações de Apoio

Figura S1.

O enredo da floresta de associação de rs10795668 com câncer colorretal para o grupo europeu sem o estudo original. (TIF)

doi: 10.1371 /journal.pone.0064310.s001

(TIF)

Figura S2. analisa

Sensibilidade para o grupo europeu. (TIF)

doi: 10.1371 /journal.pone.0064310.s002

(TIF)

Figura S3.

Funil lote de viés de publicação para o grupo europeu. (TIF)

doi: 10.1371 /journal.pone.0064310.s003

(TIF)

Checklist S1.

A lista de verificação PRISMA 2009