Abstract

Fundo

a galectina-3 é conhecida para regular a metástase do cancro. No entanto, o mecanismo subjacente não foi definida. Através dos estudos de microarranjos de DNA após a galectina-3 silenciamento, demonstramos aqui que a galectina-3 desempenha um papel fundamental na-se-regulando a expressão de activado pela protease do receptor-1 (PAR-1) e da metaloproteinase-1 de matriz (MMP-1) PAR-1 promovendo, assim, a metástase do câncer gástrico.

Metodologia /Principais achados

Foram examinados os níveis de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 expressão no câncer de tecidos gástricos paciente e também os efeitos de silenciar estas proteínas com siRNAs específicos e de excesso de expressá-las usando construções lenti-virais específicas. Nós também empregou modelo de embrião de peixe-zebra para análise da

in vivo

invasão de células de câncer gástrico. Estes estudos demonstraram que: a) a galectina-3 silenciamento diminui a expressão de PAR-1. b) a galectina-3 sobre-expressão aumenta a migração celular e invasão e este aumento pode ser revertida por PAR-1 silenciamento, indicando que a galectina-3 aumenta a migração celular e invasão via PAR-1 sobre-regulação. c) a galectina-3 interage directamente com AP-1 factor de transcrição, e este complexo liga-se ao promotor de PAR-1 e PAR-1 dirige a transcrição. d) a galectina-3 também amplifica fosfo-paxilina, um alvo a jusante de PAR-1, através do aumento da expressão de MMP-1. MMP-1 bloqueia de silenciamento fosfo-paxilina e amplificação de células causada por invasão de galectina-3 sobre-expressão. e) O silenciamento de qualquer galectina-3, PAR-1 ou MMP-1 reduziu significativamente a migração celular para os navios em modelo de embrião de peixe-zebra. f) A galectina-3, PAR-1 e MMP-1 são altamente expressos e co-localizada em tecidos malignos de doentes com cancro gástrico.

Conclusões /Significado

A galectina-3 desempenha a tecla papel de activar o receptor da superfície celular através da produção de protease e estimula a metástase do cancro gástrico. A galectina-3 tem o potencial de servir como um alvo farmacológico útil para a prevenção de metástases de cancro gástrico

citação:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Parque SH, et ai. (2011) galectina-3 Facilita a motilidade celular no câncer gástrico por-regulador Up Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) e Matrix Metaloproteinase-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10.1371 /journal.pone.0025103

editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, França |

Recebido: 18 de maio de 2011; Aceito: 23 de agosto de 2011; Publicação: 22 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Cancer Center (NCC) da República da concessão Coreia (NCC-0910150 e NCC-0810060), Instituto de pesquisa inovadora para Terapia celular, República da Coreia (A062260) e esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de pesquisa Basic442 Ciência através do Fundação nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (1031790-1), República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os cânceres que se espalham (metástase) de seu local original para outra área do corpo, são chamados cancros metastáticos. cancros metastáticos têm pior prognóstico e alta mortalidade [1]. A plena compreensão do mecanismo (s) biológico envolvido na metástase e abordagens racionais para prevenir ou controlar a metástase pode levar a abordagens práticas para melhorar a taxa de sobrevivência dos doentes que sofrem de cancros metastáticos. Em estudos anteriores, verificou-se que a galectina-3 aumenta a motilidade celular de cancro gástrico por cima de regulação de fascina-1, uma proteína do citoesqueleto de actina-agregação [2]. A galectina-3 é uma proteína de 31 kDa de hidratos de carbono de reconhecimento, envolvido na tumorigénese, o crescimento de células de cancro e metástase [3], [4], [5] e a sua expressão elevada em vários cancros humanos, foi encontrada a correlação com o mau prognóstico de cancros metastáticos.

Para esclarecer o papel da galectina-3 na metástase do cancro, nós knocked-down sua expressão em células cancerosas gástricas usando seu siRNA e examinou os resultados de expressão gênica por análises de DNA microarray [6]. Entre os resultados anteriores, verificou-se uma redução significativa do nível de activada com protease do receptor-1 (PAR-1), um membro da família de receptores transmembranares de proteína G acoplado a [7], e o seu activador, matriz metaloprotease-1 ( MMP-1) (Figura S1). Clivado PAR-1 é de auto-fosforilada e transduzidas por sinal extracelular (s) através de várias vias, e desempenha um papel crítico na metástase tumoral [7], [8], [9]. Sobre-expressão de PAR-1 tem sido relatada em vários tipos de câncer, incluindo melanomas, mama e câncer gástrico. MMP-1 também é regulado para cima em uma ampla variedade de cancros avançados, e uma correlação negativa significativa foi observada entre a sua expressão e sobrevida do paciente [10], [11], [12], [13]. Também vários estudos descobriram que MMP-1 desempenha um papel crucial na metástase do câncer de mama [14], fígado e cancros do cólon [15], e os cancros gástricos [16], [17], entre outros. Afigura-se que, uma vez segregado, MMP-1 promove a invasão de células de cancro através da degradação da matriz extracelular e /ou camadas submucosas de vasos linfáticos [10], [14]. Numerosos estudos demonstraram que a inibição de MMP leva à inibição da invasão de células [18], [19].

stas descobertas nos levou à hipótese de que a galectina-3, PAR-1 e MMP-1 pode estar envolvido na aumentando a migração e invasão do cancro gástrico. Para testar esta hipótese, foram realizadas estudos para o seu papel em células de cancro gástrico. Em ambos

in vitro

e

In vivo

estudos, foi utilizado modelo de embrião de peixe-zebra para determinar seus efeitos sobre a migração e invasão das células cancerosas com organelas vivos. Também determinou os níveis de expressão de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 em tecidos malignos de pacientes com câncer gástrico para as correlações clínicas entre estas proteínas em amostras humanas.

Resultados

galectina Silenciando -3 ou PAR-1 reduz a migração e invasão das células cancerosas gástricas humanas

os níveis de galectina-3 e PAR-1 expressão foram elevadas em linhas celulares de cancro mais gástricas. Nós silenciados galectina-3 e PAR-1 em células MKN 28 empregando os respectivos ARNsi. O tratamento com a galectina-3 siRNA diminuição dos níveis de ambos galectina-3 e PAR-1 de expressão, enquanto que PAR-1 tratamento de siARN diminuiu apenas PAR-1, enquanto a expressão não foi observada nenhuma diferença de galectina-3 (Figura 1A). A transfecção de células SNU-638, que originalmente mostrar nenhuma expressão de galectina-3, com o plasmídeo de galectina-3 que codifica resultou num aumento da expressão de ambos PAR-1 e galectina-3 (Figura 1B). Silenciamento quer a galectina-3 ou PAR-1 reduziu o número total de migração (

P

0,001) (Figura 1C) e células invasoras (

P

0,001) (Figura 1D), quase pela metade. Estes dados mostraram que a galectina-3 aumentou PAR-1 e expressão tanto de galectina-3 e PAR-1 modulada migração celular e invasão do cancro gástrico.

A, expressão de ARNm e proteína níveis após transfecção de cancro gástrico humano MKN- 28 células com 20 nM de ARNsi, ou pARNc de galectina-3 ou PAR-1. O ARN total e a proteína obtida após a transfecção durante 48 h. As células foram colhidas e analisadas por RT-PCR e transferência de Western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. B, os níveis de proteína de galectina-3 e PAR-1 por transferência de Western após a transfecção com pcDNA3.1 /NT-GFP-galectina-3 e o vector de controlo de pcDNA3.1 /NT-GFP em células SNU-638. C, Ensaio de migração celular realizada de galectina-3 ou PAR-1 em células MKN-28 silenciados. Os resultados estavam presentes como um histograma (*

P

0,001 vs. grupo Cont), e células de fotos ensaios de migração celular. D, Histograma estava presente que os ensaios de invasão de células de galectina-3 ou PAR-1 em células MKN-28 silenciados (*

p Art 0,001 vs. grupo Cont).

a galectina-3 aumenta a migração de células de cancro gástrico /invasão aumentando PAR-1 expressão

foi examinada a relação entre os aumentos induzidos por galectina-3 na migração celular e invasão por um lado e PAR-1 expressão na outra mão. Nós infectados SNU638 células com um lentivírus contendo a cassete de expressão de galectina-3 e examinou as expressões de galectina-3 e PAR-1, e a migração de células de medição. Verificou-se que a sobre-expressão de galectina-3 foi acompanhada por um aumento expressões PAR-1 mRNA e proteína (Figura 2A), bem como migração de células (

P

0,001) (Figura 2B) e a invasão de células (

p Art 0,001) atividades (Figura 2c). Estes aumentos foram reduzidos por PAR-1 silenciamento. Estes resultados sugeriram que a galectina-3 promove a migração e a invasão de células gástricas cancerosas através de sobre-regulação de PAR-1.

A, o ARNm e os níveis proteicos de galectina-3 e PAR-1 detectados por RT-PCR e análise de western blot em células SNU-638, infectadas com lenti-vírus contendo LacZ ou galectina-3, e, em seguida, transfectadas com ARNsi de PAR-1 ou pARNc para um controlo negativo. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. B e C, de Migração (B) e ensaios de invasão (C) foram conduzidos de SNU-638 células infectadas com vírus lenti-contendo LacZ ou galectina-3 de células, e, em seguida, transfectadas com ARNsi de PAR-1 ou pARNc para um controlo negativo. Resultados foi mostrado como histograma (*

p Art 0,001 vs. grupo Cont). D, modelo esquemático do PAR-1 promotor com AP-1 sítio de ligação, Primers utilizados para o ensaio ChIP estavam preparados para detectar sítio de ligação AP-1 (-463~-474) a partir de -666 a -307. E, A galectina-3 interage com c-Jun e fra-1 (tal como, um complexo AP-1 [20]) em células MKN-28. A imunoprecipi tacão foi realizada conforme descrito em “Materiais e Métodos”, e, em seguida, a galectina-3, c-Jun e fra-1 detectada por análise de Western blot. Os lisados ​​de células inteiras (WCLs) foram usados ​​como um controlo positivo. F, Análise do ensaio de imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpos para galectina-3, c-Jun e Fra-1 em MKN-28 células transfectadas com ARNsi pARNc e galectina-3. iniciador de PCR para o promotor do gene PAR-1 foi utilizado para detectar fragmento do promotor em imunoprecipitados. pista de entrada, ADN genómico total utilizada como controlo para a reacção de PCR. L, a actividade da luciferase de AP-1 em mais de lacZ e células que expressam galectina-3. ensaio de luciferase foi realizada usando AP-1 de expressão de luciferase vector de transfecção para lacZ e a galectina-3 que sobre-expressam as células (*

P

0,001 vs. Cont). β-galactósido foi utilizado como controle negativo.

galectina-3 promove PAR-1 transcrição através da interação com AP-1 | complexo

Em seguida, tentou elucidar como a galectina-3 regula PAR expressão -1. Uma vez que foi noticiado que o AP-1 a actividade de transcrição é regulada por galectina-3 [20], que incidiu sobre o papel deste factor de transcrição neste contexto (Figura 2D). Foram realizadas estudos de imunoprecipitação e determinado que a galectina-3 directamente interagiu com ambos Fra-1 e c-Jun no complexo AP-1, e que esta interacção foi associada com a regulação positiva de AP-1 a actividade de transcrição (Figura 2E). Em seguida, foi examinada a actividade de ligação de ADN de AP-1 com e sem a galectina-3 por ensaios de chip (Figura 2F). Descobrimos que a AP-1 complexo ligado o promotor de PAR-1 na presença de galectina-3, mas não na sua ausência. Também se avaliou a actividade transcricional de AP-1 pelo ensaio de luciferase após transfecção de um plasmídeo repórter contendo a sequência de ligação de AP-1 em frente de um promotor mínimo de condução de luciferase em LacZ ou de galectina-3 que sobre-expressam SNU-638 células (

P

0,001) (Figura 2G). A actividade transcricional de AP-1 aumentou significativamente em galectina-3 que sobre-expressam as células, mas não em LacZ sobre-expressando células. Estes resultados sugeriram que a galectina-3 facilitou a ligação do promotor de PAR-1, interagindo com um complexo AP-, aumentando assim a expressão de PAR-1 por regulação da transcrição.

A galectina-3 aumenta a expressão de MMP-1 e a activação de PAR-1 sinalização

MMP-1 foi relatada para regular a activação de PAR-1 por meio de clivagem de PAR-1 sinalização intracelular presa, e para influenciar a invasão de células [21]. Como apresentado na Figura S1, que mostrou que a galectina-3 regulada MMP-1. Portanto, confirmamos as inter-relações da galectina-3, MMP-1 e PAR-1. Analisou-se os níveis de MMP-9, que é um alvo a jusante de [8] PAR-1, de expressão de ARNm após o silenciamento de galectina-3, MMP-1 e PAR-1 individualmente (Figura 3A). Enquanto a galectina-3 silenciamento reduzida a expressão de todas as três moléculas (MMP-1, PAR-1 e MMP-9), MMP-1 silenciamento reduzido apenas de MMP-9 expressão e não as de galectina-3 ou PAR-1. Curiosamente, PAR-1 silenciamento produziu os mesmos efeitos que a MMP-1 silenciamento. Nós também detectada a fosforilação da proteína do citoesqueleto paxilina (pY181), uma marca de PAR-1 activação [22], [23]. Depois de silenciamento de galectina-3, MMP-1 e PAR-1 individualmente, o phosphorylaion de paxilina foi diminuída, o que sugeriu a galectina-3 também regulada PAR-1 actividade. Verificou-se ainda a redução de actividade de MMP-9 após o silenciamento da galectina-3, MMP-1 e PAR-1 individualmente (Figura 3A).

A, a galectina-3, PAR-1, MMP-1 e MMP-9 ARNm e galectina-3, PAR-1, MMP-1, os níveis de fosfo-Paxillin (pY181) e proteína paxilina após transfecção com pARNc ou cada ARNsi de galectina-3, PAR-1, MMP-1 em MKN-28 células. O ARN total e a proteína obtida após a transfecção durante 48 horas e as células foram colhidas e analisadas por RT-PCR e Western blot. MMP-9, a actividade foi ensaiada por zimografia em gelatina, utilizando o meio das células MKN-28. B, os níveis de expressão de galectina-3 ARNm, PAR-1 e MMP-1 por RT-PCR; níveis de galectina-3 de expressão de proteínas, PAR-1, MMP-1, fosfo-paxilina (pY181) e paxilina por análise de Western blot em células SNU-638, que foram infectadas com-LENTIVIRUS contendo LacZ ou galectina-3 e, em seguida transfectadas com ARNsi de MMP-1 ou pARNc para um controlo negativo. C, Ensaio de Invasão de SNU-638 células infectadas com vírus contendo lenti-LacZ ou células de galectina-3, e, em seguida, transfectadas com ARNsi de MMP-1 ou pARNc para um controlo negativo. Os dados são apresentados como um histograma (*

P

0,001 vs. grupo Cont).

galectina-3 que sobre-expressam SNU638 células apresentaram níveis aumentados de expressão de MMP-1 e proteína PAR-1, bem como seus mRNAs, além de paxilina fosforilada (pY181). Nestas células, a MMP-1 silenciamento reduziu a fosforilação de paxilina sem alterar a expressão da galectina-3 ou PAR-1 (Figura 3B). Além disso, a MMP-1 silenciamento reduzida a invasão de células, que é desencadeada por galectina-3 sobre-expressão (

P

0,001) (Figura 3C), o que implica que a galectina-3 aumentada de MMP-1 que conduz a expressão ativação de PAR-1 de sinalização.

sobre-expressão de MMP-1 em células de câncer aumenta invasão celular através da ativação de PAR-1 sinalização

Nós confirmou que up-regulação da MMP-1 por galectina-3 é importante para a activação de PAR-1 aumentou de sinalização e invasão de células de cancro gástrico. Um lentivírus (pLECE3 vector) contendo a MMP-1 cassete de expressão regulada pelo promotor de CMV foi preparada e infectado em células de cancro gástrico AGS (Figura 4A-B). Como esperado, a MMP-1 sobre-expressão aumentada a capacidade de invasão de células de cancro gástrico, e PAR-1 silenciamento inverteu significativamente este aumento (

P

0,001) (Figura 4B). Isto também foi confirmado pelo facto de que a sobre-expressão de MMP-1 aumentou a fosforilação de paxilina, e que o silenciamento adicional de PAR-1 bloqueada tal fosforilação (Figura 4A). Em MMP-1 de células que sobre-expressam, a galectina-3 silenciamento reduzida a expressão de PAR-1, mas não a de MMP-1, e também a fosforilação de paxilina e potencial invasivo de células (Figura 4A-B). Estas observações sugerem que a sobre-expressão de MMP-1 aumentou invasividade de células de cancro através da activação de PAR-1 sinalização. Tomados em conjunto, estes resultados sugeriram que a galectina-3 aumentaram a expressão de ambos PAR-1 e MMP-1, e que o aumento da expressão de MMP-1 activado PAR-1 de sinalização, o qual, por sua vez, facilitar a invasão de células do cancro. Estes eventos são, esquematicamente representada na Figura 4C.

A, a expressão da proteína de galectina-3, PAR-1, MMP-1, os níveis de fosfo-Paxillin (pY181) e paxilina foram medidos por análise de Western Blot, após a infecção constructo com lenti-viral contendo pLECE3 (apenas vetor) e pLECE3-MMP-1 em células transfectadas com AGS, a galectina-3 ou PAR-1 ARNsi. B, invasão celular realizada pelas células acima presente como um histograma (*

P

0,001 vs. grupo Cont). C, Galecitn-3 aumenta a expressão de PAR-1 através da ligação com o factor de transcrição AP-1, também, a galectina-3 regulação da expressão de MMP-1. MMP-1 aumento provoca efeitos duais na invasão câncer gástrico; 1) a clivagem de PAR-1 ligando tethered e PAR-1 ativação 2) A degradação de matrizes extracelulares (ECM).

O silenciamento de galecin-3, PAR-1 ou MMP-1 blocos de células de câncer gástrico migração

in vivo

em um modelo de peixe-zebra

peixes-zebra transgénicos,

Tg (kdrl: EGFP)

s843

[24], expressar EGFP especificamente em sua vascularização. Os embriões de peixe-zebra correspondentes são transparentes com vasos verdes fluorescentes. Nós empregamos estes peixes para conduzir

in vivo

estudos de migração de células de câncer gástrico humano (Figura 5A). Quando o vermelho fluorescente marcado células AGS foram injectados no saco vitelino de embriões de peixe-zebra a 48 HPF (horas após a fertilização), a maioria das células AGS transplantadas estavam localizadas no centro do saco vitelino de embriões de 4 horas após o transplante ( HPT). Após 26 HPT, tanto as células transfectadas normais e pARNc migraram para região do tronco, e residiu no vaso do tronco e /ou cauda dos embriões a 50 hpt. No entanto, o número de células migradas AGS, em que cada um da galectina-3, PAR-1 ou MMP-1 são silenciados, diminuiu significativamente (Figura 5B). Nós também contado o número de embriões de peixe-zebra que apresentam células que migram e os resultados são apresentados (Figura S2). Oitenta por 4-93 por cento dos embriões de peixe-zebra, que foram transplantados com células de controlo ou pARNc trataram células células exibidas migram para os seus vasos do tronco e da cauda a 50 hpt. No entanto, apenas 7 a 11% dos embriões que foram transplantados com células em que a galectina-3, PAR-1 ou MMP-1 foram silenciados, exibida células migrantes. Estes resultados sugerem, que, primeiro, o modelo de embriões de peixe-zebra pode ser usado para monitorar a migração de células de cancro gástrico como um animal vivo, e segundo, que o silenciamento de cada um de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 provocou uma redução significativa na migração de células de câncer gástrico

in vivo

.

a, At 53 horas após a fertilização (HPF), as células transplantadas AGS que transfectadas galectina-3, PAR-1, MMP-1 siRNA e pARNc (vermelho) foram localizados no centro do saco vitelino de vida peixes-zebra transgénicos em que os vasos embrionárias são visualizados com fluorescência verde às 4 horas após o transplante (HPT); até 50 HPT foram claramente detectadas apenas células cancerosas. B, o número de células que migraram por embrião foram contadas, e mostrado como um histograma. Estes dados foram obtidos a partir de três experiências replicadas.

Barras de escala

, 200 mm e 50 mm nas últimas painéis. C e D, A expressão aumentada de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 em doentes com cancro gástrico. C, Expressão e localização da galectina-3, PAR-1 e MMP-1 em tecidos malignos de doentes com cancro gástrico utilizando staing imuno-histoquímica (castanho) com H E por microscopia de fluorescência. Ampliação: (painel superior) × 200; (Painel inferior) × 400. D, o mRNA de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 níveis em tecidos de doentes com cancro gástrico detectados por RT-PCR (Figura S3). tecidos malignos e normais foram obtidas de 20 pacientes submetidos a gástricas de RT-PCR, quantificado e analisado por análise de imagem de NIH. maiores níveis de expressão de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 em tecidos malignos são mostrados como aumentos percentuais sobre os seus níveis em tecidos normais.

expressões de galectina-3, PAR-1 e MMP -1 são elevados, em paralelo, nos tecidos malignos de doentes com cancro gástrico

determinou-se os níveis de mRNA e da expressão da proteína de galectina-3, PAR-1 e MMP-1 em tecidos normais e malignas de 20 gástrica pacientes com câncer, então utilizado RT-PCR usando uma imagem analisador J. Como mostrado na Figura 5C e Figura S3, 73,7% dos pacientes com cancro mostraram níveis mais elevados de expressão de galectina-3 e 70% deles apresentaram maiores níveis de PAR-1 e MMP-1 nos seus tecidos malignos do que nos seus equivalentes normais. Além disso, entre a galectina-3 doentes positivos, 71,4% também eram PAR-1 positivo, enquanto 64,3% foram também MMP-1 positivo (Figura 5D). Estes dados indicam que há um aumento paralelo na expressão de galectina-3, bem como PAR-1 e MMP-1, nos tecidos gástricos malignas. Nós também descobrimos que estas proteínas co-localizada nas áreas malignas dos tecidos, e não nas áreas não-maligna (Figura 5C). A galectina-3 estava presente em ambos o núcleo e citosol, enquanto PAR-1 e MMP-1 foram geralmente vistos no citosol e membrana dentro da mesma área (Figura 5C). Estes achados sugerem que ambas as expressões PAR-1 e MMP-1 significativamente correlacionada com a expressão galctin-3 em pacientes com câncer gástrico.

Discussão

Este estudo demonstrou que a galectina-3 aperfeiçoada migração de células de câncer gástrico e invasão. Mecanisticamente, esta ligada a galectina-3 para a sobre-regulação do receptor de superfície celular PAR-1, e a actividade MMP-1 protease. Isto está de acordo com relatórios que demonstra uma correlação entre a expressão de PAR-1 e invasão de tumores e metástases em gástricas e vários outros tipos de cancro [25], [26], [27]. Este estudo é o primeiro a demonstrar uma interacção directa da galectina-3 e AP-1 componentes complexos, c-Jun e Fra-1, e regulação do PAR-1 expressão pela AP-1 fator de transcrição. Uma vez que já foi demonstrado por outros, que a sobre-expressão de Fra-1 promove a invasão de células de cancro e metástase [28], a sobre-regulação de PAR-1 por c-jun e Fra-1 parece ser um mecanismo possível explicar a ligação de galectina-3 induzida por sobre-regulação do receptor de superfície da célula de PAR-1, e a actividade MMP-1 protease. Esta possibilidade é apoiada por nossa descoberta de expressões paralelas e co-localizada de galectina-3 e PAR-1 em tecidos malignos de pacientes com câncer gástrico.

É um romance observação de que galectina-3 aumenta MMP-1 expressão . Claramente, a sobre-expressão da MMP-1 pode aumentar a actividade de invasão de células de cancro gástrico, bloqueando célula para célula e célula para interagir com a matriz por degradação de ECM. Por conseguinte, um aumento da expressão de MMP-1 promovida pela galectina-3 pode ter efeitos duais, ou seja, PAR-1 activação e da degradação de ECM, e ambos são críticos para a metástase do cancro gástrico. No entanto, como a galectina-3 regula a MMP-1 expressão é ainda pouco claro, porque a expressão de MMP-1 é regulada por uma série de acontecimentos complexos incluindo a diafonia entre vários factores de transcrição, tais como AP-1, o transdutor de sinal e activador de transcrição-3, MAP quinase, e hipóxia-inducible factor-1 em hipoxia [29], [30], [31].

Estabelecer o peixe-zebra (

Danio rerio

) modelo embrião estudar a migração e a invasão de células de cancro gástrico é uma realização particular deste estudo por modelos animais adequados não estavam disponíveis para o estudo humano metástase do cancro gástrico até agora. O modelo de peixe-zebra para estudar cancros geneticamente modificados e /ou xenotransplantes tumorais, tem muitas vantagens, incluindo a viabilidade de frente e verso, análises genéticas, a transparência dos embriões [32], e adequação para a rotulagem GFP de navios [32], [33], [34]. Este estudo mostrou que RFP marcado células cancerosas gástricas invadiram vasos sanguíneos, enquanto a galectina-3, MMP-1 ou PAR-1 silenciado células cancerosas gástricas não podia. Assim, o embrião de peixe-zebra parece ser um modelo promissor para o estudo de invasão e metástase das células cancerosas, embora mais estudos são claramente necessários para confirmar esta conclusão.

Em conclusão, os estudos demonstraram que a galectina-3 acelerado câncer gástrico motilidade celular por up-regulação do PAR-1 e MMP-1. Estudos adicionais são claramente necessários para estabelecer o papel da galectina-3 em metástase do câncer e sua adequação como um alvo terapêutico para cancros selecionados.

Materiais e Métodos

Tecidos

Pairs de 2 mm biópsia porte foram obtidos a partir de tecidos de adenocarcinoma gástrico de 20 pacientes submetidos à endoscopia diagnóstica e dissecção submucosa endoscópica, do centro de câncer nacional na Coréia, depois de obter seus consentimentos informados por escrito. As amostras de tecidos foram congeladas em azoto líquido a -70 ° C imediatamente após a biópsia até à sua utilização. Algumas das amostras de tecido foram paraffindized para estudos imuno-histoquímicos, conforme necessário. Esses estudos foram aprovados pelo Institutional Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024).

Cultura de Células e siRNA Transfec�es

linhas de células adenocarcinoma gástrico humano moderadamente diferenciado, AGS, MKN- 28 e SNU-638 foram obtidas a partir da linha celular Coreia do Banco e mantida como descrito previamente [35]. siRNAs utilizado em transfecções, foram todos fornecidos por Invitrogen (Carlsbad, CA). As suas sequências são galectina-3 (LGAL3) siRNA; 5′-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ‘, PAR-1 siRNA; 5’-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ‘, e MMP-1 siRNA; 5’-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 ‘. As transfecções foram realizadas utilizando o reagente Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Indução de transiente de galectina-3 sobre-expressão em células SNU-638 foi obtido utilizando pcDNA3.1 /NT-galectina-3 com pcDNA3.1 /NT-GFP. Para o tratamento de controlo de normalização, as linhas celulares de cancro gástrico foram tratados com 1 ug por reagentes LTX (Invitrogen).

Isolamento de ARN e análise de RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir de células humanas de cancro gástrico e amostras de tecido do doente, utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. A transcriptase reversa PCR foi realizada utilizando um sistema de transcrição inversa (Promega Corp. EUA), seguindo as instruções do fabricante. Foram utilizados os iniciadores: 5′-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 ‘(sentido) e 5′-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3′ (anti-sentido) para LGAL3 gene humano (galectina-3); 5’-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 ‘(sentido) e 5′-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3′ (anti-sentido) para F2R gene humano (PAR-1); 5’-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 ‘(sentido) e 5′-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3′ (anti-sentido) para o gene de MMP-1 humana; 5’-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 ‘(sentido) e 5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′ (anti-sentido) para o gene de MMP-9 humana; 5’-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘(sentido) e 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′ (anti-sentido) para o gene β-actina humana; 5’-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 ‘(sentido) e 5′-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3’ (anti-sentido) para gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase humana (GAPDH). A PCR foi realizada num volume de 20 ul usando uma polimerase Taq Ex (Takara). O ciclo de amplificação (desnaturação 95 ° C durante 1 min, emparelhamento a 60 ° C durante 1 min e extensão passo de 72 ° C durante 2 min), foi repetido 32 vezes, seguido de extensão final de 10 min a 72 ° C.

Construção de galectina-3 que expressa vector e infecção viral lenti-

a de comprimento completo humana de galectina-3 que expressa a construção pcDNA3.1-NT-GFP-GAL3, o vector pcDNA3.1-NT-GFP e o vector viral lenti-a sobre-expresso de LacZ, a galectina-3 (1-250) em pLL3.7 foram previamente descritos [2]. F2R humano foi clonado no pLECE3 em locais de enzimas de restrição BamH1 e Not1, criando o pLECE3-F2R (PAR-1) construir. cDNAs completos de F2R, MMP-1, e o controlo MRFP foram usadas para a amplificação de PCR, juntamente com os iniciadores listados na dados S1, e resultantes fragmentos de PCR foram clonados no vector pLECE3 utilizando locais de enzimas de restrição de PAC1 e Hpa1, criando o pLECE3 -MMP-1 construto. Além disso, o local MRFP do vector pGEM-T-Easy foi transferido para o vector pLL3.7 substituindo a região de GFP usando AGE1 e locais de enzimas de restrição EcoR1, para fazer pLL3.7-MRFP. produção de vector Lenti-viral tem sido previamente descrito [2]

análise Western blot

extracções de lisado celular foram preparadas com tampão RIPA (1% de NP-40;. 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio; 0,5 % desoxicolato; NaCl 150 mM; Tris 50 mM, pH 7,5) e protease inibidor de coquetel. 20 ug de proteína total de cada lisado foi resolvida em geles de 8-12% de SDS-PAGE e electro-transferidas para membrana de PVDF, e em seguida, bloqueadas em leite desnatado a 5% em 0,05% de Tween-20 com 1 x PBS (PBST). anticorpos primários policlonais anti-galectina-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 e anti-β-actina (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxilina e paxilina anti-fosfo (pY181) (Epitomics) foram incubadas com borrões em 1:1000 diluição em volumes mínimos de 5% de BSA (albumina de soro bovina) em tampão PBST durante 1 hora temperatura ambiente ou durante a noite em 4 ° C. Anti-ratinho ou anti-coelho de cabra-anticorpos secundários, conjugado com HRP (GE Healthcare UK Limited) foram incubadas a 1:5000 diluição de 5% de BSA em tampão PBST durante 1,5 h à temperatura ambiente. As proteínas de interesse foram detectados por quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, EUA).

A imunoprecipitação

extractos lisado celular foram preparadas com tampão IP + (20 mM de Hepes, 1 % de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, PMSF mM 0,2, 10 ug /ml de cocktail de inibidor de protease) em gelo durante 30 min. Após a remoção de detritos por centrifugação (13200 rpm a 4 ° C durante 20 minutos), os sobrenadantes foram sujeitos a um passo com preclearing /G agarose de proteína A, a 4 ° C durante 30 min no rotor. Os sobrenadantes obtidos após uma breve centrifugação (2000 rpm, a 4 ° C durante 4 min) foram sujeitas a imunoprecipi tacão utilizando um anticorpo anti-IgG de ratinho e galectin3 normal (controlo negativo). Os imunoprecipitados foram lavados duas vezes em tampão IP (tampão Hepes 20 mM, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM). Depois de 30 uL 2 x de amostra SDS adição de tampão, seguido de ebulição a 95 ° C durante 5 min. Após sobrenadantes obtidos após uma breve centrifugação, seus níveis de expressão de proteína foram determinadas através da análise western blot realizada.

Imunohistoquímica

Para a galectina-3 e PAR-1 imuno-histoquímica, desparafinados cortes de tecidos doentes com cancro gástrico foram deixados em um forno de microondas durante 15 min em tampão de citrato (Vector Laboratories), e, em seguida, incubadas com 3% H

2O

2 durante 15 minutos para bloquear a peroxidase endógena, seguindo-se incubação com 10% de soro de cabra normal (Vector laboratórios) em 1 × PBS durante 10 min. Os anticorpos primários foram utilizados anti-galectina-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) e anti-PAR-1 (1:200) anticorpos (Santa Cruz), e passo seguinte foi feito de acordo com as instruções de Vectastain®ABC