Abstract

Neste estudo testamos a prevalência, distribuição histoanatomical e tumor significado biológico da proteína alvo e marcador de células-tronco do câncer LGR5 Wnt em tumores do tracto gastrointestinal humano. A expressão diferencial de LGR5 foi estudada em transcricional (real-time polymerase chain reaction) e o nível de translação (imunohistoquímica) em tecidos malignos e correspondente não-malignas de 127 pacientes que compreende seis locais de tumor primário diferentes, ou seja, esófago, estômago, fígado, pâncreas, cólon e reto. O significado clínico-patológico de expressão LGR5 foi estudada em 100 pacientes com carcinoma gástrico (CG). Não-neoplásica tecido normalmente abrigado muito poucas células

LGR5 espalhados +. Os carcinomas correspondentes do esófago, estômago, fígado, pâncreas, cólon e recto mostrou significativamente mais LGR5

+ células, bem como níveis significativamente mais elevados de ARNm-LGR5 em comparação com o correspondente tecido não neoplásico. experimentos de coloração dupla revelou uma co-expressão de LGR5 com os marcadores de células estaminais putativas CD44, Musashi-1 e ADAM17. Em seguida testamos a hipótese de que as mudanças sequenciais de carcinogênese gástrica, ou seja, gastrite atrófica crônica, metaplasia intestinal e carcinoma invasivo, estão associados a uma redistribuição do LGR5

+ células. Interessantemente, a distribuição espacial da LGR5 alterado: na mucosa do estômago não-neoplásicas, LGR5

+ células foram encontradas predominantemente na região do pescoço da mucosa; na metaplasia intestinal LGR5

+ células foram localizados na base da cripta, e no GC LGR5

+ células estavam presentes na superfície luminal, o centro de tumor e da frente da invasão. A expressão de LGR5 no centro do tumor e invasão frente de GC significativamente correlacionada com o crescimento local do tumor (T-categoria) e a propagação nodal (N-categoria). Além disso, os pacientes com LGR5

+ GCs tinham uma sobrevida média menor (28,0 ± 8,6 meses) do que pacientes com LGR5

– GCs (54,5 ± 6,3 meses). Nossos resultados mostram que LGR5 é diferencialmente expressos em câncer gastrointestinal e que a distribuição espacial da histoanatomical LGR5

+ células tem de ser considerada quando o seu significado tumor biológica é procurado

Citation:. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert, M. et al. (2012) a distribuição espacial da LGR5

Células + correlaciona-se com câncer gástrico progressão. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10.1371 /journal.pone.0035486

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2011; Aceito: 16 de março de 2012; Publicado: 18 de abril 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Simon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinomas gastrointestinais estão entre as neoplasias mais comuns e são uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo [1], [2]. As razões para os prognósticos pobres são complexos: muitos cânceres do trato gastrointestinal são diagnosticados em estágios avançados excluindo tratamento curativo, não há marcadores tumorais confiáveis ​​que podem permitir o diagnóstico precoce ou screening de populações de alto risco. As opções de tratamento são limitadas na doença localmente avançado e metastático, e um número significativo de tumores apesar de se repetir a resposta terapêutica inicial [3]. Uma explicação putativa de uma terapia ineficaz é a presença de células-tronco cancerosas (CSC). A hipótese CSC postula que um tumor é um conglomerado de populações de células heterogéneas. Apenas uma sub-população do presente conglomerado mantém a capacidade de formação de colónias, e, portanto, a recorrência e disseminação metastática. CSCs são mais resistentes à quimioterapia, levando a recorrência do tumor, progressão e em última análise, a morte do paciente [4], [5]. Enquanto o CSC-modelo é cada vez mais aceita, a identificação e confirmação dos chamados marcadores de células-tronco no tecido humano nativo é difícil e praticamente inexistente. Recentemente, a, G-proteína rica em leucina receptor acoplado (GPCR) e o gene alvo Wnt

LGR5

foi identificado como um marcador de células estaminais romance do intestino delgado, cólon e nos folículos de cabelo de murganhos [6] . Expressão de LGR5 em vários outros órgãos indica que esta pode representar um marcador global de células estaminais adultas. No entanto, pouco se sabe sobre a sua expressão no trato hepato-gastrointestinal dos seres humanos.

Neste estudo teve como objetivo preencher essa lacuna de informações e testou a hipótese de que o LGR5 marcador de células-tronco do câncer tem prognóstico e tumor biológica importância.

Materiais e Métodos

assuntos

fixado em formalina e maligno e correspondente tecido não-malignas de 127 pacientes que compreende seis localizações anatômicas do parafinado hepato-gastrointestinal aparelho (ou seja, esôfago, estômago, fígado, pâncreas, cólon e reto) foram recuperados dos arquivos dos Institutos de Patologia da Christian-Albrechts-Universidade de Kiel e da Universidade Charité Hospital Berlim (ambos da Alemanha). Todos os pacientes foram operados em qualquer University Hospital Schleswig-Holstein (1997-2009) ou Universidade Charité Hospital Berlin (1995-2008; Tabela 1). tecido congelado não fixado, fresco foi disponível a partir de 105 destes pacientes com oito tipos diferentes de tumor, isto é, de adenocarcinoma de Barrett (9 casos) e carcinoma de células escamosas (7), do esófago, do intestino (19) e difusa (21) tipo de cancro gástrico, adenocarcinoma do cólon (19) e do recto (20), carcinoma hepatocelular (HCC; 4), e colangiocarcinoma (CC; 6). As características dos pacientes estão resumidos na Tabela 1.

Uma série independente de 487 pacientes com câncer gástrico foi recuperado a partir do arquivo do Instituto de Patologia das Christian-Albrechts-Universidade (Tabela 2 e Tabela 3) . Estes doentes tinham sido submetidos a gastrectomia total ou parcial para adenocarcinomas do estômago ou junção oesophago-gástrica. Cada espécime ressecção tinham sido submetidos a exame histológico por patologistas cirúrgicos formados. O momento da morte paciente foi obtido a partir do

Registro de Câncer Epidemiológica

do estado de Schleswig-Holstein, Alemanha. dados de acompanhamento de pacientes ainda vivos foram recuperados de registros hospitalares e entrando em contato com os médicos de clínica geral.

Declaração de Ética

Todas as amostras de tecido foram obtidos como parte de um diagnóstico ou cirurgia terapêutica realizada depois que o paciente deu consentimento informado por escrito. Pacientes que oferecem amostras para o estudo foram apresentados sob pseudónimo e analisados ​​anonimamente, por isso, não há dados individuais relacionadas com estão contidas no banco de dados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do Hospital Universitário, em Kiel, Alemanha (ref número. D 453/10).

em tempo real reverse transcriptase polimerase reação em cadeia

O RNA total foi isolado a partir de células cultivadas e tecidos crioconservadas utilizando o kit de isolamento Ambion miRvana miARN (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha), seguido por um tratamento com DNase Turbo kit DNA-free (Ambion). a qualidade do RNA foi avaliada num gel de agarose a 1,5%. Para a síntese de cDNA, 2 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). iniciadores específicos para o gene foram sintetizados por Biomers.net (Ulm, Alemanha) (Tabela S1). Em tempo real reacção em cadeia da polimerase transcriptase reversa (em tempo real de RT-PCR) foi realizada usando o LightCyler® 480 Sondas mestre (Roche) e o Sistema LightCycler® 480 (Roche). Os valores comparativos Ct foram normalizados para a de três genes de limpeza:

Homo sapiens succinato complexo desidrogenase, subunidade A, FLAVOPROTEÍNA (Fp) (SdhA), Homo sapiens calpaína 2 (CAPN2) Comprar e

ciclofilina C ( CYCC)

. Sem controles de modelo (não cDNA em PCR) foram executados para cada gene para detectar a amplificação inespecífica ou genômica e dimerização primer. Todas as experiências foram realizadas em duplicado.

Geração e purificação de um anticorpo anti-anticorpo-LGR5

anti-soros policlonais foram gerados contra a cauda do terminal carboxilo do receptor LGR5 humano. Os coelhos foram imunizados com três diferentes péptidos da identidade de SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (chamado Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (chamado 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (denominado 12) por Pineda-abservice (Berlim, Alemanha). Monoespecífico IgG foi purificado por cromatografia líquida rápida de proteína com sistema ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) utilizando uma coluna de proteína A-(GE Healthcare). Para todas as análises posteriores, isto é, imunofluorescência, imunohistoquímica, western blot e imunohistoquímica, a IgG-fração monoespecífico foi purificado por afinidade contra os péptidos imunizantes pelo Pineda-abservice. Na análise dot blot e investigações imuno-histoquímica, o anticorpo IgG monoespecífico anti-LGR5-11b apresentam alta afinidade, juntamente com imunocoloração forte e específica. Por isso, foi utilizado este anticorpo ao longo deste estudo. A reactividade e especificidade do anticorpo monoespecífico foi caracterizado por Western Blot; imunofluorescência e ensaios imunocitoquímicos.

plasmídeo construir

Expression construir para LGR5 foi gerado por amplificação da sequência que codifica toda a humana

LGR5

(NM_003667.2) por PCR (Tabela S1 ). Para facilitar a subclonagem do fragmento amplificado num vector de expressão do pcDNA3.1 (-), o iniciador directo continha um local de restrição NheI adaptador e o iniciador inverso continha um local de BamHI e um marcador c-Myc para verificar a transfecção bem sucedida. Os fragmentos de PCR e do pcDNA3.1 (-) vector de expressão foram digeridos separadamente com NheI e BamHI antes da ligação com ligase de T4 (Roche). O plasmídeo foi verificada através de digestão com Nhel e BamHI e sequenciação de ADN utilizando ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing pronto kits reagentes, Versão 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Alemanha).

Cultura de células e transfecção

a linha celular de cancro gástrico humano MKN74 foi obtida a partir da pesquisa da ciência Saúde Banco de Recursos japonesa (Osaka, Japão), e MKN45 a partir da Colecção alemã de Microorganismos e culturas Celulares (Braunschweig, Alemanha). células HEK293 EBNA foram comprados pela Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (MKN74, MKN45) ou Modified Eagle Médium da Dulbecco (HEK293) suplementado com 10% (MKN74, HEK293) ou 20% (MKN45) de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL estreptomicina (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). transfecção de ADN de HEK293 EBNA, MKN74 e MKN45 células foi realizada utilizando o reagente Lipofectamina LTX (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de seis poços. Transfecção estável de MKN74 e MKN45 com plasmídeos de expressão foi realizada como previamente descrito [7]. Para a transfecção transiente de células HEK293 1 ug de ADN do plasmídeo e 5 uL do reagente Lipofectamina LTX foram diluídos em 500 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium, sem soro, respectivamente. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, a mistura foi adicionada a células HEK293. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células transfectadas foram colhidas e o RNA ou proteínas foram isoladas. As células transfectadas com o vector pcDNA3.1 (-) sozinho e untransfected células serviram como controlos negativos

Imunofluorescência

Vinte e quatro horas após a semeadura em CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica),. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, fixo em 07:03 acetone:methanol (20 minutos, -20 ° C) e, subsequentemente, permeabilizadas com 0,1% de Triton-X (5 minutos, temperatura ambiente). As lâminas foram então incubadas com anticorpo monoclonal de rato c-Myc (Clontech, Mountain View, CA, EUA) durante a noite a 5 ° C numa câmara húmida, seguido de um anticorpo secundário anti-ratinho conjugada com Alexa Fluor 555 (Invitrogen). Para detectar a transfecção bem sucedida de LGR5, as células foram incubadas com o anti-anticorpo-LGR5 seguido por um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) cada um durante uma hora à temperatura ambiente. Omissão de anticorpos primários em LGR5 transfectadas HEK293 EBNA serviu como controle negativo. Montagem e contracoloração foi feito com Vectashield Hard-Set incluindo DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA).

Imunocitoqu�ica

coloração imunocitoquímica foi realizada em fixado em formol e incluídas em parafina incorporado MKN45 células cancerosas gástricas. Para este fim, as células MKN45 foram embebidos em pequenas esferas de agarose como descrito anteriormente [8]. O processamento adicional e imunomarcação com anti-LGR5-anticorpo (diluição 1:1000) foi realizada de acordo com a imuno-histoquímica de secções de tecido humano (ver abaixo). A omissão do anticorpo primário em LGR5 transfectadas células MKN45 serviu como controlo negativo, enquanto que a especificidade da coloração anti-LGR5-anticorpo foi confirmada por incubação do anticorpo com o péptido imunizante bloqueio.

Western blotting

lisados ​​proteicos foram obtidos por incubação de tecido gástrico humano e células gástricas cultivadas com ProteoJET ™ Mammalian Cell Reagente de lise (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) e cocktail de inibidor de protease (completo isento de EDTA, Roche). As amostras de proteína foram desnaturadas em tampão de Laemmli (Tris-HCl a 60 pH 6,8, 2% de sulfato de dodecilo e sódio, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol e 0,01% de azul de bromofenol) por aquecimento a 95 ° C durante dez minutos e foram subsequentemente carregado em 4% a 16,5% de gel de poliacrilamida-SDS e visualizadas por coloração com azul de Coomassie. Após separação, as proteínas em geles de poliacrilamida não coradas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham, Freiburg, Alemanha), Immunoblot com o anticorpo anti-LGR5-anticorpo (diluição 1:20,000) e um-actina-anticorpo anti-β (1:10,000; clone AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para assegurar quantidades iguais de carga. HRP ligada à membrana anticorpos secundários marcados (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) foram detectados por quimioluminescência melhorada usando o sistema ECL (Amersham). A omissão do anticorpo primário serviram como controlo negativo, enquanto que a especificidade da coloração anti-LGR5-anticorpo foi confirmada por incubação do anticorpo com o péptido imunizante bloqueio.

Histologia

Para a análise histológica, tecidos As amostras foram fixadas em formalina a 10% neutralizado e embebido em parafina. seções desparafinados foram coradas com hematoxilina e eosina (H E). carcinoma gástrico foi classificada de acordo com a classificação da OMS [9]. O estágio pTNM foi determinada de acordo com o 7

th edição do Internacional Cancer Union Against [10].

Tissue micro matriz construção

-fixados em formalina e amostras de tecido embebidos em parafina foram utilizado para gerar matrizes micro tecido, tal como descrito anteriormente [11]. Quatro secções micrométricas do tecido tumoral bloco micro matriz resultante foram cortadas para análise posterior. transferência bem sucedida do tecido tumoral foi confirmada microscopicamente usando H . seções

Imunohistoquímica

Para imunohistoquímica E-manchado, foram utilizados em formol fixa e secções embebidas em parafina. A imunocoloração foi realizada com o anti-LGR5-anticorpo (diluição 1:1000), um anticorpo monoclonal dirigido contra CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) e anticorpos policlonais dirigidos contra LGR5 comerciais (LGR5

COM , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, EUA), ADAM17 (diluição 1:50; Sigma-Aldrich) e Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, EUA). Após 20 minutos de bloqueio com bloco de peróxido de hidrogénio (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), o tratamento de 5 minutos com o Ultra Bloco V (Thermo Scientific) e a incubação com o anticorpo primário foi realizada numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 30 minutos. As lâminas foram lavadas entre os passos com solução salina tamponada com Tris (TBS). Reacções imunológicas foram visualizados com o N-Histofine simples mancha Sistema MAX PO (Nichirei Bioscience, Tóquio, Japão) e o substrato DAB (Linaris, Wertheim-Bettingen, Alemanha). Para a coloração de dupla LGR5 com CD44, e ADAM17 Musashi-1, os locais de ligação livres foram bloqueados com IgG de ratinho e de coelho de controlo-IgG (Abcam) diluído em diluente de anticorpo (ZYTOMED Systems, Berlim, Alemanha) após DAB-tratamento. Os espécimes foram contrastadas com hematoxilina. A omissão do anticorpo primário serviram como controlos negativos. estômago humano não-neoplásica (CD44) e tecido cerebral (LGR5

com, LGR5 e Musashi-1) serviram como controlos positivos.

Avaliação da imuno

A imunocoloração do epitélio não-neoplásica e células tumorais foi marcado por aplicação de um sistema de pontuação imunorreactividade (IRS). Resumidamente, a categoria A documentada a intensidade da imunocoloração como 0 (nenhuma imunocoloração), 1 (fraca), 2 (moderada), e 3 (forte). Categoria B documentada a percentagem de células imunorreactivas como 0, 1 (células espalhadas positivos; ≤1%) (negativo), 2 (células positivas 2-10%), 3 (11-50%), 4 (51-80%) e 5 ( 80%). A adição de categoria A e B resultaram em um IRS que varia de 0 a 8, para cada caso individual. As mudanças distributivas de LGR5

+ células inteiras 100 seções de montagem de câncer gástrico tipo intestinal foi pontuada da seguinte forma: o número de células imunorreactivas foi categorizado como 0 (negativo), 1 ( 10 células positivas), 2 (10 -50 células positivas) e 3 ( 50 células positivas) separadamente para, centro de tumor na superfície luminal e da frente da invasão

análises estatísticas

as análises estatísticas foram realizadas utilizando o PASW Statistics 18. pacote estatístico (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). As comparações entre os grupos foram testadas pelo uso do teste exato de Fisher. Correlação de expressão LGR5 dentro de um grupo foi criado pela correlação tau ordem de classificação de Kendall. As curvas de sobrevida foram equipados com o método de Kaplan-Meier e as diferenças na sobrevivência avaliadas pelo teste de log rank. O significado de correlações de expressão LGR5 em tumores primários e de tecido não maligno correspondente foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Dados em tempo real RT-PCR, que foram avaliados com um t-teste bilateral emparelhado, ficou logarithmized para obter dados de aproximadamente distribuídos normalmente. P-valores. 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos

Resultados

LGR5-mRNA é diferencialmente expressos em carcinomas hepato-gastrointestinal

LGR5 teria sido expressos em células-tronco de murino de as criptas intestinais [12] e foi frequentemente sobre-expresso em linhas celulares de cancro do cólon [13]. Para investigar a sua expressão em tecido humano não-neoplásicas e neoplásicas, avaliou-se a expressão transcricional de LGR5 em espécimes clínicos humanos compostas de uma ampla gama de carcinoma hepato-gastrointestinal. Análise em tempo real de RT-PCR foi levada a cabo numa série de 105 pacientes que compreendem tecidos não-malignas malignas e correspondente, obtido a partir dos mesmos pacientes, de oito tipos de tumores diferentes: esófago [adenocarcinomas de Barrett (9 pacientes) e carcinomas de células escamosas ( 7)], estômago [intestinal (19) e do tipo difuso (21) carcinomas gástricos], fígado [HCC (4), o CCS (6)], dois pontos (19) e do recto (20; Tabela 1)

LGR5-ARNm foi significativamente expresso diferencialmente em adenocarcinomas do esófago (p = 0,007), estômago [tipo intestinal (p = 0,006) e do tipo difuso (p = 0,013)], fígado [CCs (p = 0,022)], cólon (p 0,001), bem como do recto (p = 0,002), em comparação com o tecido não neoplásico combinados. No entanto, nenhuma expressão diferencial foi encontrada em carcinomas de células escamosas do esôfago (p = 0,503) e HCC comparados com os correspondentes tecidos não neoplásicas (p = 0,545; Figura 1).

Boxplots que descrevem a distribuição global de LGR5 comparando maligna contra o tecido não maligno adjacente no (a) adenocarcinoma de Barrett e (B) carcinoma de células escamosas do esôfago, (C) câncer gástrico tipo intestinal, (D) câncer gástrico tipo difuso, (e) carcinoma hepatocelular, (F) cholangiocarcinoma, (G) cólon e (H) carcinoma retal.

Um anti-LGR5-anticorpo policlonal detecta LGR5 humano transfectado em células HEK293 e MKN45

Para explorar ainda mais a distribuição histoanatomical de LGR5 em tecidos humanos e investigar o seu significado clínico-patológico, um anticorpo específico-LGR5 foi levantada, uma vez que os anticorpos disponíveis comercialmente não cumprir as nossas exigências (Figura 2A). Para excluir reactividade cruzada do anticorpo recém-gerado com as LGRs mais estruturalmente semelhantes, LGR4 e LGR6, foi realizado um alinhamento de sequências com o

National Center for Biotechnology Information

ferramenta de alinhamento com antecedência (dados não mostrados). Nenhuma homologia de sequência foi encontrada com LGR4 ou LGR6 na região do péptido LGR5 foi utilizado para a imunização. Para a selecção de um anticorpo altamente específico contra LGR5, ADNc de comprimento completo clonado foi transfectado em células HEK293 EBNA e utilizado como um alvo realizando imunofluorescência positiva. O ADNc foi LGR5 directamente marcado com um epitopo myc, que permitiu a avaliação da transfecção com um anticorpo anti-myc tag. Usando imunofluorescência, a ligação do anticorpo tag anti-myc foi encontrado após a incubação com células LGR5 /HEK293, mas não em células vazias transfectadas com vector (vector /HEK293), células HEK293 não transf ectadas, ou no controlo negativo de células LGR5 /HEK293 incubadas com diluente de anticorpo, em vez do anticorpo primário. O mesmo resultado foi obtido quando se o anti-LGR5-anticorpo (Figura 3), demonstrando rotulagem específica de LGR5.

Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica para LGR5

com (A) e LGR5 (B) numa amostra de cancro gástrico. Após coloração separada para ADAM17 (C) e LGR5 (D), bem como a coloração dupla para ADAM17 (cor vermelha) e LGR5 (cor castanha; E) numa secção em série da mucosa gástrica normal. Comparando mucosa do estômago saudável (F, G) e tecido gástrico neoplásica (H), MSH-1

+ /LGR5

– (cor vermelha), MSH-1

– /LGR5

+ (marrom cor; F), bem como MSH-1

+ /LGR5

+ células (G) estão presentes. Predominantemente CD44

+ /LGR5

+ células em experimentos de coloração duplos para CD44 (cor vermelha) e LGR5 (cor marrom) em saudável (I) e (J) mucosa gástrica neoplásica. células positivas duplas são indicadas por setas, pontas de seta marcar células coradas individuais dispersos. ampliações originais × 400 (A-J); × 600 (E).

imunofluorescência de células HEK293 EBNA com anticorpo LGR5 específica (verde) e anticorpo tag anti-myc (vermelho). As células foram contrastadas com DAPI para mostrar o núcleo da célula (azul). As células transfectadas com o ADNc LGR5 marcado com myc (primeiro painel) em comparação com células de controlo, transfectada com o vector vazio (controlo de vector vazio); deixando não transfectadas (controlo não transfectadas); ou incubadas sem os anticorpos primários, respectivamente. ampliações originais × 400.

A especificidade do LGR5-imunomarcação foi ainda validado usando MKN45 células cancerosas gástricas embebidos em parafina fixadas em formalina e. As células foram preparadas e coradas de um modo que se assemelha ao processamento de amostras de tecidos humanos clínicos. Imunocitoquímica análises sobre secções de parafina revelou uma coloração positiva de anticorpos anti-anticorpo-LGR5 em células MKN45 estavelmente transfectadas com ADNc LGR5 (LGR5 /MKN45). Em vez disso, as células vazias transfectadas com vector MKN45 (vector /MKN45), bem como o controlo negativo (omissão do anticorpo primário) e o controlo de péptido (pré-incubação do anticorpo com o seu péptido de bloqueio imunizante) de células LGR5 /MKN45 mostrou não ligação do anticorpo (Figura S1).

LGR5 proteína é especificamente detectado pelo anti-LGR5-anticorpo humano transfectado em células MKN74

as linhas celulares de cancro gástrico humano MKN74, conhecido por possuir um expressão moderada LGR5-ARNm (dados não mostrados) e de estômago não-neoplásica humana, exibindo uma expressão muito baixa LGR5 (Figura 1) foram escolhidos para caracterizar a reactividade e especificidade do anticorpo anti-anticorpo-LGR5 no nível da proteína.

Em análise de western blot, LGR5 proteína foi reconhecido especificamente pelo anticorpo anti-anticorpo-LGR5 monoespecífico numa diluição de 1:20,000. Ele identificou uma banda com um peso molecular aparente de 100 kDa, em lisados ​​de células MKN74 (Figura 4), que coincide com a massa molecular calculada para proteína LGR5. Em contraste, nenhuma banda foi detectada em lisados ​​de tecido de estômago não-neoplásica humana, o que exclui uma reactividade cruzada de anti-LGR5-anticorpo com proteínas celulares. Em linha com os dados de expressão de ARNm, foi observada expressão forte de proteínas LGR5 MKN74 em células transfectadas estavelmente com ADNc de LGR5, em comparação com células MKN74 de controlo transfectadas com o vector vazio. a expressão da proteína LGR5 na mucosa do estômago não-neoplásica humana foi além do limite de detecção de western blotting, exibindo nenhuma banda. A omissão da incubação anti-LGR5-anticorpo ou anterior do anticorpo imunizante com o seu bloqueio de péptidos não apresenta quaisquer bandas de proteína, respectivamente. Detecção de proteína β-actina (cerca de 43 kDa; Figura 4) serviu como um controlo de carga e confirmados uniformemente carregado quantidades de proteína em todas as pistas

com azul de Coomassie (Coomassie) descreve a qualidade de lisados ​​de proteína total carregada.. Na análise western blot o anti-LGR5 de anticorpos (1:20,000) detecta uma única banda em lisados ​​de proteína das células MKN74 transfectadas de forma estável, superexpressão LGR5 (MKN74 + LGR5), uma banda mais fraca de células transfectadas com o vector vazio de controlo (MKN74 + vector vazio), e nenhuma banda em lisados ​​de mucosa de estômago não-neoplásica humana, respectivamente. Em um blot paralelo há bandas alvo são visíveis quando o anti-LGR5-anticorpo foi pré-incubada com o seu imunizante bloqueando peptídeo (bloqueio peptídeo). As bandas superiores (100 kDa, seta) exibir a proteína LGR5, enquanto que as bandas de fundo (~43 kDa, seta) descrevem β-actina, utilizada como um controlo de carga.

LGR5 não é expressa em -neoplastic tecido neoplásico e do tracto hepato-

gastrointestinal

a distribuição de LGR5 expressão e histoanatomical foi posteriormente estudado por imuno-histoquímica de uma série de 127 lâminas de tecido obtidas a partir dos correspondentes tecidos não-neoplásicas e neoplásicas da hepato-gastrintestinal trato, compreendendo o esófago (14 pacientes), do estômago (32), do fígado (24), pâncreas (17), do cólon (20), e do recto (20; Tabela 1). Fora desta coorte neoplásica e correspondentes amostras de tecido não-neoplásicas de 105 pacientes foram também estudados no nível transcricional (ver acima).

LGR5 expressão da coorte total foi positiva em 65 casos (51%) de todos tecidos não malignos e 103 casos (81%) de todos os tecidos de cancro. Localização de expressão LGR5 foi observado principalmente citoplasmático, enquanto também uma membrana ou núcleo membrana expressão acentuada esporádica ocorreu. Um LGR5-imunorreactividade foi encontrada em todas as componentes do tecido, isto é, as células do estroma, células endoteliais, células do epitélio não neoplásico e em células de cancro (Figura 5). LGR5-imunorreactividade em células do estroma foi observada em 49 (39%) de todos os tecidos não-malignas e em 80 casos (63%) de todos os tecidos de cancro. Um imunorreactividade endotelial de LGR5 foi observada em 42 casos (33%) de todos os tecidos.

expressão LGR5 na mucosa normal do cólon (A), membranosa (B) e (C) coloração citoplásmica nas células de cancro do cólon correspondente. Setas marca espalhadas células imunorreactivas dentro da base da cripta. Asterisco (*) marca o local luminal. Variável LGR5-imunorreactividade de células endoteliais foi encontrada em tecido de cancro: A presença de células endoteliais LGR5-immunonegative (D) foi confirmada por CD34 (E) utilizando secções em série. Nota forte LGR5-imuno endotelial em outro caso de câncer de cólon (F). (L) Expressão em células de LGR5 estroma desmoplástico. ampliações originais x 200 (A); × 400 (B-G).

No epitélio não-maligno, LGR5 foi geralmente encontrada em algumas células dispersas perto da membrana basal da unidade da mucosa gástrica, duetos pancreáticos, e as criptas colorrectais . LGR5 não foi encontrado no epitélio escamoso do esôfago, vias biliares e hepatócitos (Figura 6). Para todos os tipos de tecidos para além de tecido esofágico o valor médio de IRS foi significativamente maior para o tecido do tumor em relação ao tecido não maligno combinado, o que confirma os nossos resultados sobre o nível de transcrição (Tabela 1).

Expressão de LGR5 em esofágico mucosa normal (a), em comparação com um adenocarcinoma (B) e um carcinoma de células escamosas (C). LGR5 expressão no fígado normal (D), em comparação com o carcinoma hepatocelular (E), normal (F) e maligno (L) epitélio do ducto biliar, bem como não-neoplásicas (H) e neoplásicas (I) de tecido pancreático. ampliações originais × 400.

LGR5 está presente em células espalhadas da mucosa gástrica normal,

A existência de células-tronco multipotentes dentro do estômago murino foi demonstrado por estudos de marcação clonais. A identificação definitiva dessas células falhou até agora, devido a indisponibilidade de marcadores endógenos específicos [14]. Usando cortes seriados obtidos a partir de uma amostra de manga de ressecção, que é geralmente obtida para o tratamento do excesso de peso, e não mostraram evidência histológica de câncer gástrico ou gastrite crônica, que procurou LGR5

+ células epiteliais. LGR5

células Curiosamente, espalhados + foram encontradas na região do pescoço mucosa entre a foveolae e glândulas (Figura 7).

padrões de distribuição de LGR5

+ células na mucosa gástrica saudável (A, E) , uma metaplasia intestinal (B, F), e um adenocarcinoma gástrico (C, G), com a sua frente invasiva (D). O painel superior mostra coloração imuno-histoquímica representante com um anti-LGR5-anticorpo em seções inteiras de montagem de cânceres gástrico tipo intestinal. O painel inferior mostra o modelo esquemático correspondente das alterações de distribuição em diferentes fases de tumorigénese gástrico. Setas marcam

+ células LGR5. Asterisco (*) marca o local luminal. A linha preta destaca a interface host tumor (frente de invasão). ampliações originais × 200.

LGR5 é co-expressos com outros potenciais marcadores de células de células-tronco ou progenitoras gástrica

As células-tronco de tecido não-neoplásica e CSCs são normalmente identificados e validados pela expressão de mais de um marcador de células estaminais simples [15]. Utilizando imunohistoquímica, nós próxima analisada a co-expressão de LGR5 com outros marcadores CSC putativas, isto é ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] – [21]. ADAM17 foi seleccionado, uma vez que estudos anteriores identificaram ADAM17 como um marcador de células estaminais putativo do estômago [8]. A imunocoloração (ou coloração dupla ou de coloração de secções em série) foi realizada numa amostra de cancro gástrico e na mucosa gástrica uninflammed saudável obtido por gastrectomia. Em geral, só algumas células dispersas apresentaram imunocoloração positiva para um e /ou outro marcador de células estaminais putativo. [26].