Abstract

O câncer colorretal é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A doença é curável quando detectado numa fase inicial. No entanto, a taxa de conformidade com as recomendações de triagem em vigor permanece pobre. Um exame de sangue precisa, minimamente invasivo que tem o potencial para uma maior adesão do paciente seria uma adição bem-vinda para os métodos atuais. Dados recentes têm mostrado que o perfil de expressão de genes de células de sangue periférico pode reflectir estados de doença e, portanto, têm valor diagnóstico. Neste estudo, de todo o genoma de perfis de células de sangue periférico a partir de 20 controlos saudáveis ​​e doentes com cancro colorectal 20 expressão de genes foram realizados utilizando tecnologia de microarrays PAXgene ™ e Affymetrix GeneChip®. Identificamos uma lista de 1.469 genes que foram diferencialmente expressos entre os controles saudáveis ​​e pacientes com câncer. anotação de genes e análise de enriquecimento funcional revelou que esses genes estão relacionados principalmente com funções imunológicas. Particularmente, um conjunto de genes pertencentes às vias Toll-like receptor foram regulados positivamente em pacientes com cancro colo-rectal. Estes resultados fornecem uma nova compreensão do perfil de expressão gênica no sangue em câncer colorretal. Nosso resultado pode servir como a base para o desenvolvimento de biomarcadores de sangue para o diagnóstico e tratamento do cancro colorectal

Citation:. Xu Y, Xu Q, Yang L, Liu F, Ye X, Wu F, et al . Análise Expression (2013) Gene de células do sangue periférico revela Receptor Toll-Like Pathway desregulamentação no câncer colorretal. PLoS ONE 8 (5): e62870. doi: 10.1371 /journal.pone.0062870

editor: Frank T. Kolligs, Universidade de Munique, Alemanha |

Recebido: 17 Setembro, 2012; Aceito: 29 de março de 2013; Publicado em: 01 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela empresa bioMérieux. Este estudo também foi apoiado por subsídios da disciplina chinesa National Clinical Key (2011-2012) eo Shanghai Ciência e Tecnologia da Comissão, de Xangai Município (número 10DJ1400500). Como QX, FW, FL, XY, BM e XM são os empregados da empresa bioMérieux e contribuíram para este trabalho, portanto, como um dos financiadores, empresa bioMérieux desempenhou um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Vários autores (QHX, FW, FL, XY e XM) são os empregados da bioMérieux (Shanghai) Co. Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE sobre os dados e materiais de partilha. Outros autores declaram não haver conflitos de interesse.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum em homens eo segundo tipo de câncer mais comum em mulheres em todo o mundo. Em 2008, mais de 1,234,000 casos foram recentemente diagnosticados, e mais de 608.000 pessoas morreram da doença [1]. Dada a sua lento desenvolvimento de lesões pré-cancerosas removíveis e das fases iniciais curáveis, a triagem para CRC tem o potencial para reduzir a incidência e mortalidade da doença [2]. As ferramentas de triagem disponíveis incluem o teste fecal de sangue oculto (FOBT), teste de DNA de fezes, sigmoidoscopia flexível, CT colonography e colonoscopia. Diferentes estratégias de triagem estão em vigor em vários países. No entanto, o cumprimento das atuais recomendações de triagem CRC continua pobre. A baixa taxa de participação no rastreio CRC é devido a uma série de fatores, incluindo a baixa acurácia dos métodos atuais de fezes base de triagem, o desconforto do paciente e má aceitação de métodos baseados endoscopia. Um exame de sangue precisa, minimamente invasivo que tem o potencial para uma maior adesão do paciente seria uma adição bem-vinda para os métodos atuais. Quando uma anormalidade foi detectada pelo exame de sangue, outros testes que envolvem o exame de colonoscopia e patológico seria recomendado para confirmar se a anomalia detectada é CRC.

Nós e outros autores mostraram previamente o uso potencial de criação de perfis de expressão gênica amostras de sangue completo para a detecção e diagnóstico de cancro [3] – [9]. Antes da manifestação clínica da CRC, que normalmente demora vários anos, o hospedeiro reage sobre a implantação das células cancerosas através do sistema imune activado [10]. A activação do sistema imunitário é reflectida em alterações nos perfis de células sanguíneas imunocompetentes a expressão genética, e estas alterações são detectáveis ​​no sangue periférico [11], [12]. Neste estudo, foi realizada de perfis de células do sangue periférico usando tecnologia PAXgene ™ e microarrays Affymetrix GeneChip® a expressão do gene. Um grande número de genes diferencialmente expressos entre os controlos e os pacientes com CCR foram identificados. Particularmente, relatamos os perfis superexpressão de Receptor Toll-Like (TLR) vias de sinalização genes relacionados no CRC para pavimentar o caminho para estudos mais funcionais.

Materiais e Métodos

Pacientes e Sample Collection

Este estudo foi realizado na Universidade Fudan Shanghai Cancer Center (FDUSCC), Shanghai, China. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da FDUSCC para a investigação clínica. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Vinte pacientes com CCR foram recrutados no Departamento de Cirurgia Colorretal, FDUSCC. Nenhum paciente recebeu radioterapia pré-operatória ou quimioterapia. Os pacientes que sofrem de CRC hereditária ou doenças inflamatórias do intestino (doença de Crohn ou colite ulcerosa) foram excluídos deste estudo. Vinte voluntários saudáveis, sem quaisquer sintomas gastrointestinais (diarreia e dor abdominal) foram recrutados através de FDUSCC. Todos os participantes tiveram a coleta de sangue, pelo menos, sete dias após o exame de colonoscopia. Para cada recolha, 2,5 ml de sangue periférico foi tirado para um tubo de ARN de sangue PAXgene ™ (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, CH) e armazenado a -80 ° C.

Extração de RNA e Microarray Experiências

o ARN total foi extraído com o ARN ™ sistema sanguíneo PAXgene (PreAnalytiX GmbH). A quantidade de RNA total foi medida com um espectrofotómetro a 260 nanómetros, e a integridade de ARN foi avaliada usando um RNA 6000 Nano LabChip® Kit em um Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, E.U.A.). Todas as amostras satisfazem os critérios de qualidade: RNA Número Integridade 7.0 [13]. Cinquenta nanogramas de ARN total foram reversamente transcritos e amplificado linearmente como cDNA de cadeia simples utilizando tecnologia de Ribo-SPIA ™ com o ARN ™ Sistema de Amplificação de WT-Ovation (NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, EUA), e os produtos foram purificados utilizando o kit de purificação PCR QIAquick ™ (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). Dois microgramas de ADNc amplificados e purificados foram subsequentemente fragmentado com ADNase RQ1 isenta de RNase (Promega Corp., Fitchburg, WI, EUA) e marcadas com trifosfatos de desoxinucleósidos biotinilados usando transferase terminal (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, EUA) e o GeneChip® Reagente de marcação de DNA (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, EUA). O ADNc marcado hibridado foi para a matriz 2.0 GeneChip® HG U133 Plus em um forno de hibridação 640 (Agilent Technologies) em 60 rotações por minuto a 50 ° C durante 18 horas. Após a hibridação, as matrizes foram lavadas e coradas de acordo com o protocolo Affymetrix EukGE-WS2v4 usando um Fluídica Estação GeneChip® 450 (Affymetrix). As matrizes foram digitalizados com o Scanner GeneChip® 3000 (Affymetrix). Os dados de microarranjos foram depositados no repositório público ArrayExpress [14] com o número de acesso E-MEXP-3756.

Análise Estatística

análises de dados de expressão gênica foram realizadas utilizando o software R e pacotes do projecto Bioconductor [15] – [17]. Os dados brutos foram coletados a partir de arquivos CEL e pré-processados ​​usando o algoritmo robusto multi-chip Média (RMA) para correção de fundo, normalização quantil e sumarização polonês mediana [18], [19]. Os dados de nível de set-sonda foram transformados em log2. Além disso, foi aplicado um método de filtragem baseada em bioinformática utilizando as informações no banco de dados Entrez Gene [20]. conjuntos de sonda sem Entrez Gene ID anotação foram removidos. Para sonda vários conjuntos de mapeamento para o mesmo Entrez Gene ID, testar apenas conjuntos que mostram a maior gama quantil entre foram mantidos, e os outros foram excluídos.

Análise Importância do método de Microarrays (SAM) [21] foi usado para identificar genes diferencialmente expressos entre os grupos Controle e CRC. Para estudos de expressão gênica envolvendo microarrays, tornou-se prática comum para se concentrar no controle da taxa de descoberta de falsas (FDR), que estima a proporção esperada de rejeições incorretas entre as hipóteses rejeitadas [22], [23]. Para minimizar falsos positivos, vamos definir o limite de FDR a 0,01 para todas as comparações. Gene Ontology (https://www.geneontology.org) [24] e análise de caminho Panther (https://www.pantherdb.org/pathway) [25] foram realizadas utilizando a ferramenta bioinformática GeneCodis [26] e software MetaCore ™ (GeneGo Inc., EUA).

Gene Expression Análise quantitativa por PCR em tempo real

Para cada amostra, a 200 ng de RNA total foi transcrito em sentido inverso, ADNc, utilizando primeiro Script ™ transcriptase reversa (Takara, Dalian, China). Quantitative PCR em tempo real foi realizada pelo sistema LightCyclerH 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) em placas de 96 poços utilizando SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara, Dalian, China). As sequências dos iniciadores de genes alvo foram fornecidos na Tabela S1.

CSNK1G2 (caseína-quinase 1, gama 2) tinha sido anteriormente demonstrado que a expresso de forma estável em sangue total humano [27], e, assim, foi utilizada como um controlo interno. A quantificação relativa da expressão de ARNm foi calculada usando o método descrito por Vandesompele

et al [28]. Comparações de perfis de expressão gênica entre duas amostras foram avaliadas usando o teste t de Welch. Os testes de significância foram bilaterais e um

P valor

inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Nosso estudo incluiu 20 pacientes com CCR e 20 controles saudáveis. Todos os participantes eram chineses, incluindo 18 homens e 22 mulheres, com uma idade mediana de 58 anos (variação, 42-69 anos). As distribuições de idade e sexo foram equilibradas entre os grupos de controle e CRC. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase (TNM). Dois dos pacientes com CCR foram estádio I, 7 eram estágio II, 6 foram estádio III, e 5 eram estágio IV. Especificações detalhadas dos pacientes estão descritos na Tabela 1 e Tabela S2.

O recente lançamento do microarray HG-U133plus2 oferece 54.000 conjuntos de sondas para o rastreio de 38.500 genes humanos. Confrontado com tal quantidade enorme de informações, foi necessário reduzir o número total de genes analisados ​​para um número gerenciável de genes com esquemas de anotação e visualização uso biológicos verificados para facilitar o reconhecimento de padrões nos dados [29]. Nós, portanto, realizou um procedimento de filtragem baseada em bioinformática para resumir os conjuntos de sondas no nível do gene e excluir esses conjuntos de sondas com anotações biológicos de baixo grau. Após a filtragem, os perfis de 9.529 genes únicos em 20 pacientes com CCR e 20 controles de expressão foram retidas para análise a jusante.

diferenciais genes expressos (degs) entre os grupos Controle e CRC foram identificados com a análise SAM (FDR = 0,01; Type = “Two classe não pareado”; teste estatístico = “estatística t”; número de permutações = 1,000). No total, 881 e 588 genes foram encontrados para ser para cima e para baixo-regulado nos pacientes de CRC. a análise funcional de enriquecimento Gene ontologia e da via Panther foram realizadas com um limite de significância de 0,05 para o ajustada

valor de P

. A análise de caminho Panther revelou uma lista de 22 vias canônicas que foram significativamente enriquecidos na lista DEG. Como esperado, as vias associadas com as funções imunológicas específicas foram bem representados e altamente significativas, incluindo a activação de células B, activação de células T, via de sinalização de interferão-gama e interleucina via de sinalização. Em paralelo, várias vias relacionadas com angiogénese, incluindo a FGF vias de sinalização de PDGF, VEGF e também foram significativamente sobre-representados. O top ten vias moleculares associadas e genes relevantes são apresentados na Tabela 2. Além de identificar as vias canônicas significativas, nós também verificado genes associados a categorias funcionais. A análise do gene ontologia revelou um total de 74 categorias de processos biológicos que foram significativamente sobre-representados, incluindo a resposta imune inata, transdução de sinal, o transporte de proteínas, processo apoptótico, a fosforilação da proteína e da reprodução virai. Os dez principais categorias de processos biológicos associados estão listados na Tabela 3.

Notavelmente, as vias de sinalização TLR foram os itens mais significativamente enriquecida tanto na via Panther e GO análise (GO0002224: toll- como via de sinalização do receptor,

P =

1.7e-8; GO0002755: caminho de sinalização do receptor toll-like MyD88-dependente,

P =

1.1E-7; GO0034142: receptor toll-like 4 via de sinalização,

P =

1.1E-7 e Panther00054: via de sinalização de receptor Toll,

P =

1.1E-06). O TLR caminhos do software MetaCore ™ sinalização são representados graficamente na Figura 1. Como se pode observar no gráfico, múltiplos TLRs (

TLR1, TLR2, TLR4, TLR6

e

TLR8

), bem como os seus alvos a jusante, foram significativamente up-regulada nos pacientes com CCR. Além disso, também foram identificados ligantes endógenos para TLRs, incluindo

HSP70

e

HMGB1

, que foram mostrados para regular

TLR2

e

TLR4

na superfície das células tumorais e induzir progressão tumoral e metástase [30], [31]. Os TLRs ativados em seguida, recrutar

MyD88

, levando à activação subsequente de alvos a jusante, incluindo

fatores regulatórios NF-kB

, proteína associada ao mitógeno (MAP) quinase e interferon [32].

a ilustração a via foi gerado e vinculado com dados experimentais disponíveis na suíte MetaCore ™. Doze genes (

TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR8, MyD88, MD-2, beclin 1, TAB2, TAK1, IRAKM

e

IkB)

que up-regulada nos pacientes com CCR estão ligados a Toll-like receptor vias de sinalização e podem ser visualizados no mapa como figuras termómetro semelhante. Up-ala termômetros têm uma cor vermelha e indicam níveis up-regulamentados da expressão do gene nos pacientes com CCR.

Quantitative PCR em tempo real é geralmente considerado como o ensaio “padrão-ouro” para medir gene expressão e é muitas vezes usado para confirmar os achados de estudos microarray [33]. Nós, portanto, selecionados seis vias de sinalização TLR genes relacionados (

IRAK3, MD2

,

TLR1, TLR2, TLR4

e

TLR8

) para validação quantitativa PCR em tempo real. Os resultados, como mostrado na Tabela 4, indicam que os perfis de expressão de gene determinados por hibridação microarray e análise quantitativa em tempo real foram altamente comparável. Os perfis superexpressão de genes nos pacientes com CCR foram confirmados em dados de PCR em tempo real.

Discussão

A detecção precoce do CRC é crucial para o sucesso do tratamento e sobrevida do paciente. No entanto, a falta de cumprimento continua a ser o maior desafio atualmente limitando a eficácia de triagem CRC. O rico conteúdo de diversos elementos celulares e moleculares no sangue, que fornecem informações sobre o estado de saúde de um indivíduo, torná-lo um compartimento ideal para desenvolver testes não-invasivos para a detecção CRC [34]. Neste estudo, foi realizada perfil de expressão do gene global das amostras de sangue periférico recolhidas de 20 controles e 20 pacientes de CRC. Identificamos uma lista de 1.469 genes de consenso que diferencialmente expressos entre os controles e CRCs. Os nossos resultados são consistentes com estudos anteriores [3], [5], [9] e mostram que a maioria degs estão envolvidos em respostas imunitárias, assim como a apoptose celular, transdução de sinal, o transporte de proteínas e regulação da expressão do gene.

Talvez o resultado mais impressionante a surgir a partir dos dados é a sobre-expressão do TLR sinalização genes relacionados Caminho na pacientes com CCR. TLR, os homólogos de mamíferos da proteína portagem Drosophila, a família são melhor caracterizado de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) [35]. Até à data, TLRs 1-10 foram identificados em seres humanos [36]. TLRs desempenhar um papel crucial na resposta imune inata e a subsequente indução de respostas imunitárias adaptativas contra a infecção microbiana ou lesão tecidual [37], [38]. Estudos recentes mostram que TLRs funcionais não são expressos apenas em células do sistema imunológico, mas também em células cancerosas, implicando, assim, um papel de TLRs em biologia tumoral [39], [40]. Uma crescente corpos corpo de evidências têm sugerido que TLRs agir como uma espada de dois gumes em células de câncer [41]. Por um lado, TLRs têm um papel central na activação de respostas imunitárias anti-tumor, de modo a inibir a progressão do tumor. Por outro lado, desregulado de sinalização dos TLR pode proporcionar um microambiente que é necessária para as células tumorais para proliferar e evadir a resposta imune [42].

Em particular, tem havido várias publicações relataram uma associação entre TLRs e colorrectal neoplasia. Fukata

et al.

Mostrou que TLR4 foi sobre-expressos em neoplasias colorretais rato inflamação associados. Os ratinhos deficientes em TLR4 foram significativamente protegidos da carcinogénese do cólon [43]. Wang

et al.

Relataram níveis elevados de expressão de TLR4 e MyD88 associados com metástase hepática e mau prognóstico em pacientes com CCR [44]. Além disso, a expressão de RST4 e IL-6 no microambiente tumoral foram associadas com a presença de um adenocarcinoma, e níveis mais elevados de expressão de TLR4 no estroma do tumor foram observados com a progressão da doença [45].

como a primeira linha de defesa imunológica, as células do sangue periférico foram mostrados para expressar todos os TLR e exibem níveis mais elevados de ARNm de TLR em comparação com outros tecidos [46]. Postulamos que a sobre-regulação de genes relacionados com a sinalização de TLR no sangue periférico é provavelmente devido a tanto a infiltração de células inflamatórias TLR-expressam e o aumento da regulação da expressão do receptor nestas células que ocorre em resposta a estímulos de crescimento do tumor. Mais pesquisas serão necessárias para entender a relação mecanicista e os significados biológicos da superexpressão de vias TLR genes relacionados em pacientes com CCR. Dado o uso terapêutico de agonistas TLR tem sido investigada em vários modelos de cancro [41], o estudo sistémico de funções ‘TLRs podem contribuir substancialmente para o desenvolvimento de novos alvos para o diagnóstico e tratamento da CRC.

Em conclusão , que mostram que o controlo de expressão do gene no sangue resulta em perfis de transcrição distintos entre os controlos e os pacientes de CRC. Assim, à base de microarray perfil de expressão gênica de sangue é uma grande promessa para o desenvolvimento de novos biomarcadores para a detecção CRC. Estudos futuros deverão incluir mais amostras para identificação de biomarcadores e de validação. Além disso, dado que a CRC é considerada como sendo uma doença genética e epigeneticamente heterogénea [47], também seria interessante investigar o perfil de expressão do gene de sangue de diferentes subtipos, o que pode proporcionar uma nova compreensão da CRC.

Informações de Apoio

Tabela S1.

As sequências dos iniciadores de genes relacionados com TLR e

CSNK1G2

gene de referência

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s001

(DOCX)

Tabela S2.

informações clínicas detalhado de controles e CRC pacientes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s002

(DOCX)

Reconhecimentos

Queremos agradecer a todos dos participantes neste estudo por suas contribuições. Agradecemos imensamente os esforços de Wencui Huang e seus colegas no Departamento de Cirurgia Colorretal, Fudan University Shanghai Cancer Center, e seu excelente trabalho na coleta de amostras.