Sumário

células iniciadoras de tumores são uma subpopulação em cancros agressivos que exibem traços compartilhados com células-tronco, incluindo a capacidade de se auto-renovar e diferenciar, comumente referido como stemness. Além disso, estas células são resistentes à quimioterapia e terapia de radiação que levanta um desafio terapêutico. Para descobrir funções associadas ao stemness em células iniciadoras de glioma (GICs), perfis de transcriptoma foram comparadas com células neuronais estaminais (NCCC) e análise de ontologia gene identificado um enriquecimento de Ca

2 + sinalização genes no NSC e quanto mais stem-like (NSC-proximal) GICs. análise funcional em um conjunto de diferentes linhas GIC quanto à sensibilidade à homeostase perturbado com A23187 e Thapsigargin, revelou que GICs NSC-proximais foram mais sensíveis, corroborando os dados de transcriptoma. Além disso, Ca

2 + sensibilidade de drogas foi reduzida em GICs após a diferenciação, com maior efeito potente no GIC NSC-proximal, suportando uma Ca-associados stemness

2 + sensibilidade. NSC ea linha GIC NSC-proximal expressa um maior número de canais de iões permeável ao potássio, sódio e Ca

2 +. Por outro lado, um maior número de níveis de expressão elevados e de Ca

2+ genes de ligação que pode tampão CA.

2+, foram expressos em GIC NSC-distal. Em particular, a expressão do receptor de AMPA glutamato subunidade GRIA1, foi encontrado a associar com Ca

2+ GIC NSC-proximais sensíveis, e diminuiu como GIC diferenciadas juntamente com reduzida Ca

2+ sensibilidade ao fármaco. A correlação entre a expressão elevada de Ca

2 + canais (como GRIA1) e sensibilidade para Ca

2 + drogas foi confirmada em um de nove novas linhas GIC adicionais. Cálcio sensibilidade droga também correlacionada com a expressão do NSC marcadores nestin (NES) e FABP7 (BLBP, cérebro proteína de ligação de lípidos) nesta análise estendida. NES Em resumo, NSC-associados

+ /FABP7

+ /GRIA1

+ GICs foram seletivamente sensíveis a distúrbios em Ca

2 + homeostase, proporcionando um potencial mecanismo de alvo para erradicação de uma população imatura células malignas

Citation:. Wee S, Niklasson M, Marinescu VD, Segerman A, Schmidt L, Hermansson A, et al. (2014) Sensibilidade cálcio seletiva em células-tronco imaturas do cancro glioma. PLoS ONE 9 (12): e115698. doi: 10.1371 /journal.pone.0115698

editor: Alfredo Quinones Hinojosa-, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Julho, 2014; Aceito: 26 de novembro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Swedish Childhood Cancer Foundation PR2013-0084 (www.barncancerfonden.se), Câncer Sueco Fundação CAN 2011/783 (www.cancerfonden.se), Conselho Sueco de Investigação 2011-4567 (vr.se), Karolinska Institutet (www.ki.se), centro de Linnaeus em Biologia do desenvolvimento de Medicina regenerativa (www.dbrm.se). SW foi parcialmente financiado pelo programa de bolsas Karolinska Institutet PhD. MN foi financiado por uma bolsa de pós-doc da Fundação do Câncer sueco. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Glioblastoma multiforme (GBM) é uma forma altamente maligno de câncer cerebral com mau prognóstico para os indivíduos afectados. Apesar de a combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia, mais de 90% dos pacientes apresentam recorrência [1], e a sobrevivência mediana permanece tão baixo quanto 14-16 meses [2]. Embora os tumores de glioma maligno são altamente heterogénea, uma subpopulação de células imaturas, denominado glioma iniciar células (GIC) [2] – [6] coexistir com populações de células mais diferenciadas. GIC foram mostrados para ser resistente a radio- e quimioterapia e se crê ser responsável pela reincidência do tumor [7]. Reflectindo a imaturidade do GIC e a sua capacidade para diferenciar [8], estas células têm sido mostrados para partilhar uma célula estaminal (stemness) a expressão do gene -associated com populações de células estaminais, como células estaminais embrionárias normais de formação de teratoma [9] – [ ,,,0],11], e propõe-se que GICs reabastecer continuamente as células tumorais a granel através de auto-renovação e diferenciação [11], [12]. Grande parte da pesquisa de desenvolvimento de medicamentos para o tratamento GBM tem-se centrado na segmentação células a granel, a maioria dos quais não têm capacidade de iniciação tumor. Um grande desafio que permanece é aumentar a eficácia do tratamento do câncer de segmentação GICs como essas células apresentam resistência à quimioterapia e radioterapia utilizando estratégias atuais.

Apesar de várias vias de sinalização como Notch, ouriço-Gli, RTK-Akt, BMP /TGF-β, Wnt-β-catenina e STAT3 foram mostrados para suporte de auto-renovação das células estaminais e células cancerosas imaturas [13], os potenciais alvos terapêuticos que podem erradicar selectivamente GIC são poucos [14]. Uma estratégia alternativa para tornar menos agressivas GIC foi demonstrada por terapia de diferenciação induzida por BMP [8]. Também os antagonistas dos receptores D2 da dopamina têm sido identificados para dirigir a diferenciação de células leucémicas e de tumores da mama de início de diferenciação relativamente resistentes [15].

canais de iões têm sido atribuída a função de regular processos celulares básicos além de excitabilidade eléctrica e, por exemplo potássio e Ca

2 + canal de sinalização de controle de diversas funções como a proliferação e migração de células-tronco e linhas celulares de cancro [16], [17]. Ca

2+ também tem sido implicada na sobrevivência de células de cancro [18]. Recentemente, foi também demonstrado que a interferência com um Ca

2 + subunidade canal foi capaz de conduzir células iniciadoras de tumores hepáticos em apoptose [19].

Neste estudo, partimos para investigar os mecanismos únicos para as funções associadas ao stemness em células de glioma e concluir que as células-tronco-like são mais sensíveis a Ca

2 + distúrbios em comparação com tipos de células mais maduras.

cultura celular Materiais e Métodos

GliNS1, G179NS e G166NS GIC linhas foram crescidas em cultura como anteriormente descrito [6], [11]. Resumidamente, as células foram primeiro cultivados como esferas na primeira semana antes de transferir para placas revestidas com laminina, onde foram cultivadas como monocamadas aderentes em Neurocult NS-Um meio basal humano isento de soro (StemCell Technologies) suplementado com Glutamax, Hepes, N2 , B27 (Invitrogen), EGF (10 ng /ml) e de bFGF (10 ng /mL) (R D Systems). GIC foram cultivadas até à subconfluência, dissociado utilizando TrypLExpress (Invitrogen), e depois dividir 01:02 – 01:04. 2/3 do meio foi substituído com meio fresco cada 3-4 dias. Para a diferenciação, as células foram cultivadas em meio DMEM /F12 suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Gibco, Life Technologies)) durante duas semanas

Novel culturas de células de glioblastoma humano maligno iniciar (CIV) (U3NNN-MG série de linhas GIC) utilizadas neste estudo são parte da colecção Universidade de Uppsala Cultura de células de glioma humano (HGCC), que compreende culturas bem caracterizadas GBM derivadas de cancro iniciar celulares (Xie et al 2014, manuscrito em preparação). Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética Uppsala (2007/353). Todas as linhas GIC foram utilizadas entre as passagens 15 e 30.

ensaios celulares

GliNS1, G179NS e G166NS GIC linhas, tanto diferenciadas e indiferenciadas, foram semeadas no dia 1 com uma densidade de 20% em laminin- revestido 96 ou 384 poços preto, fundo plano microplacas (Corning). Os compostos foram adicionados às placas No dia 2, seguido de incubação durante 48 horas. FBS células diferenciadas meios recebido isento de soro (50% Neurocult NS-Um meio basal humana, 50% de meio Neurobasal (Gibco, Life Technologies), suplementado com Glutamax, Hepes, B27, ¼ de N2, não há factores de crescimento) durante o tratamento com compostos químicos. DMSO foi usado como controlo negativo. ensaio de viabilidade foi realizada utilizando o ensaio de CellTiterGlo (Promega, Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, tampão de reacção de ensaio foi adicionada aos poços utilizando uma multipipette automatizado, seguido por agitação a microplaca durante 30 segundos e 7 minutos de incubação no escuro. leitura da intensidade da luciferase foi então feita usando Victor2 (Perkin Elmer) com uma configuração de leitura de luminescência de 1 s por poço. Z-fator foi calculado para cada experiência. Para cada linha de células (GliNS1, G179NS, G166NS e hf5205NS), foram analisados ​​pelo menos 3 repetições. Os cálculos estatísticos foram realizados com GraphPadPrism (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, EUA). dados de dose-resposta foram processadas utilizando uma interpolação log-linear para obter login IC

50 valores.

ensaios de medicamentos em novas linhas GIC (série U3NNN-MG) foram semeadas em microplacas de 384 poços (BD Falcon Optilux Cat. # 353962), 24 horas antes do tratamento, utilizando um dispensador de liquido Multidrop 384 (ThermoScientific, Suécia). Para assegurar a fase de crescimento no final do ensaio de células (~ 70% de confluência) foram semeadas a uma densidade que varia entre 2000-4000 células /poço. Drogas foram transferidos usando o não-contato distribuidor de líquido ECHO550 (Labcyte, EUA) para uma placa de polipropileno de fundo 384 V-. Os fármacos foram então diluídas em meio e transferidas usando a cabeça MDT 384 numa estação de trabalho automatizada de Janus (Perkin Elmer, EUA) para as placas de células. Os fármacos foram testados em série de diluições de 11 pontos de dose e analisadas para a viabilidade após 72 horas de tratamento com um leitor EnVision Multilabel (Perkin Elmer, EUA) utilizando resazurina (R7017, Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suécia), a excitação /emissão de comprimentos de onda de 560 /590 nm [20]. Como controlo positivo, a doxorrubicina droga foi rastreada com o mesmo ajuste da curva dose-resposta, e cavidades que continham controlos DMSO negativos em 4 concentrações diferentes foram ensaiadas bem. O efeito sobre a viabilidade de cada dose da droga foi calculado como um rácio de viabilidade W = Ytreated /Ycontrol, onde Y representa o sinal médio de fluorescência.

extração de RNA, transcriptoma e análise de dados

Duas repetições foram analisada para as linhas de células indiferenciadas e diferenciadas GliNS1, G166NS e G179NS, enquanto três repetições foram analisados ​​por DMSO, A23187 e tapsigargina tratada GliNS1 e G166NS. O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas para subconfluency utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. Quantificação fluorométrica da concentração de ARN e a qualidade foi realizado usando o kit de ensaio de ARN Qubit (Invitrogen). Utilizou-se 300 ng de RNA total na preparação da biblioteca TruSeq, para o qual foi utilizado o Illumina Baixa-Vazão TruSeq RNA protocolo Kit Preparação de Amostras resultando em cDNA com código de barras. 50 ng de produtos TruSeq código de barras foram usados ​​para Illumina RNA sequenciamento. As amostras foram sequenciados em um sequenciador 2000 Illumina HiSeq como single-end 51-nucleotide lê acordo com o protocolo fabrica. Bruto leituras foram mapeados para o genoma humano de referência e de dados normalizada foi gerado para cada recurso genómico utilizando o software STRT [21]. Resumidamente, cru lê foram alinhadas usando Bowtie [22]. Mapeados lê foram normalizados utilizando leituras por KB por milhão lê método (RPKM) normalização [23] enquanto não mapeada leituras foram removidos. análise de expressão gênica diferencial foi feito no R-studio usando o pacote DESeq [24] e um script adotado de um trabalho anterior [25]. p-valores ajustados Benjamini foram usadas para análise de dados. A análise dos dados foi feita usando Qlucore omics Explorer 2.0 (Qlucore AB), PRISM 6 (GraphPad Software), DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov) e GeneVenn (https://genevenn.sourceforge.net).

As linhas celulares Uppsala U3NNN-MG não foram analisados ​​em repetições. Para cada linha celular de ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen) e foi marcado e hibridado em matrizes Affymetrix GeneChip Exão Humana 1,0 ST, seguindo as instruções do fabricante. Os valores de expressão foram RMAnormalized usando o software Affymetrix Expressão consola.

imunofluorescente coloração

células cultivadas em anexo tampa de vidro foram fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 15 min à temperatura ambiente (TA) seguido por incubação do anticorpo, a 4 ° C durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: fibrilar glial de coelho anti-proteína ácida (GFAP) (Dako Cytomation) e de ratinho anti-beta-tubulina III (TUJ1) (Millipore). As células foram, então, incubadas com anticorpos secundários marcados com fluorescência de anti-coelho Alexa Fluor 555 e Alexa Fluor 488 (Invitrogen) durante 1 h à TA. Os núcleos foram contrastadas com DAPI e montados utilizando Immumount (DAKO). Imagens de células marcadas foram adquiridas com um microscópio confocal Olympus FV1000 e processados ​​com o software Adobe Photoshop CS5.1.

análise de Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA e concentração de proteína foi quantificada usando o ácido bicinconínico Kit (BCA) Protein Assay (Sigma-Aldrich; Pierce, Rockford, EUA). Quantidades iguais de amostras de proteína foram separados por electroforese usando géis de 10% de Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad) ou gel de gradiente de poliacrilamida de Bis-Tris a 4-12% (NuPAGE, Invitrogen) sob condições redutoras e transferidos para uma membrana de PVDF (Bio Rad) ou membrana de nitrocelulose (Hybond-ECL, GE Healthcare, Suécia). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite, durante 1 hora e incubada durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários seguintes: anticorpo de coelho anti-GRIA1 (Abcam), de coelho anti S100-alfa 6 de anticorpo (Abcam), anticorpo anti-BLBP rato (Millipore ) e anticorpo de ratinho anti-beta-actina (Abcam). As membranas foram então incubadas com o anticorpo marcado com peroxidase de rábano apropriado secundário (Sigma-Aldrich; GE Healthcare), antes de ser revelado por quimioluminescência (ECL Substrato Clareza Ocidental, Bio-Rad; SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, EUA)). As intensidades da banda foram quantificados utilizando ImageJ (NIH, EUA).

Resultados

transcriptoma profiling identifica relacionadas stemness-Ca

2 + expressão gênica em GICs

Para determinar a relação entre as linhas GIC humanos e de células neurais fetais humanos estaminais (NSC), nós re-analisados ​​os dados de microarranjos de um estudo anterior por Pollard

et al

[11]. Enquanto o primeiro componente principal cerebral normal segregados dos NSCs e GICs (ver [11]), a Segunda principais componentes GICs classificados em relação à sua semelhança com NSCs, potencialmente refletem aspectos de stemness (Fig. 1A). O SOX2 associada-stemness gene, o marcador de BLBP NSC (proteína lipídica de ligação ao cérebro, codificada pelo gene FABP7), bem como o TUBB3 marcador neuronal (tubulina beta III), o que pode reflectir o elevado potencial de diferenciação neuronal concomitante, foram expressos a mais elevada em NSC, e os níveis de expressão diminuída na ordem do grupo GliNS1 G179NS G166NS (Fig. 1B). Enquanto a linha GliNS1 foi transcricionalmente relacionadas com as NSC (NSC-proximais), a linha G166NS, constituído a extremidade distal da relação de classificação para as NSC (NSC-distal), expressando marcadores partilhados com microglia e astrócitos reactivos e associadas a inflamação, por exemplo IL-6, CXCL2 (MIP-2), e CCL20 (Fig. 1B).

linhas (a) GIC classificam ordenadas em relação a linhas de NSC (segundo componente de uma análise de componentes principais de expressão de ARNm de microarray baseado dados de Pollard et ai [11], em que o primeiro componente e segrega NSC CIVs a partir de tecido cerebral normal). GliNS1 é derivado a partir da linha G144ED no estudo Pollard et ai. (B) Re-análise de perfis de transcriptoma em Pollard et al comparando GICs para NSCs indicando um cluster NSC-proximal do GIC-tronco, como com alta similaridade com NSCs, compartilhando por exemplo SOX2 e expressão BLBP. NSC-distais linhas GIC em contraste expressa marcadores microgliais, como CXCL2, CXCL5 e CCL20. (C) de novo de análise de sequenciação de ARN e comparações de pares de NSC e três linhas individuais GIC (GliNS1, G179NS e G166NS) mostrou que as NSC expressa um número maior de genes com 10 dobra-expressão do gene mais elevada em comparação com todas as linhas de GIC. (D) Comparações pareadas de NSCs para as linhas GIC GliNS1, G179NS e G166NS, individualmente. enriquecimento de genes e análise de ontologia gênica de perfis transcriptoma de sequenciação com base, identificado um enriquecimento de Ca

2 + genes de sinalização em NSC, que aumentaram com distal ordem de classificação para NSC em comparações de pares. (E) comparações par a par do NSC-proximal (GliNS1) e NSC-distais GICs (G166NS). enriquecimento de genes e análise de ontologia gênica sugeriu uma mudança no Ca

2 + canais permeáveis ​​para Ca

2 + genes na linha GIC NSC-distal (caixas superiores) vinculativo. Na trama vulcão, nomes genéticas em genes relacionados denote canal iônico /bomba /transporter verde, enquanto nomes de genes em roxo denotam Ca genes proteínas

2 + ligação. A trama vulcão da comparação de NSC-proximal e GICs NSC-distais revelou um maior número de canais iônicos expressos no NSC-proximal GIC (GliNS1).

A de novo seqüenciamento RNA profunda de três das linhas GIC utilizados no Pollard

et al

estudo (GliNS1, G179NS e G166NS) e uma linha de NSC (hf5205NS) mostrou que mais genes foram expressos em NSCs que linhas GIC (Fig 1C;. S1), potencialmente reflectindo a sua plasticidade e capacidade de se diferenciar. análise Pairwise NSC-GIC enriquecimento gene e anotação funcional (ontologia gênica) inesperadamente mostrou que Ca

2 + ion ligação foi a categoria mais significativamente alterada em todas as três linhas de células – uma diferença que aumentou em mais linhas GIC NSC-distais (Fig . 1D).

a expressão diferencial de Ca

2 + provocadores e tampões refere-se a stemness

Ca citosólico

2 + de sinalização é equilibrado por vários jogadores, como o Ca

2 + canais iônicos permeáveis ​​que aumentam intracelular Ca

2 + (por exemplo, tensão fechado Ca

2 + canais e receptores de glutamato, aqui denominado Ca

2 + provocadores) por um lado, e Ca

2 + ligantes que reduzem livre Ca intracelular

2 + do outro (aqui denominado Ca

2 + buffers) [26]. comparações de pares directas entre diferentes linhas GIC mostrou que a linha GIC NSC-proximal (GliNS1) expressa um número maior de genes de canais iónicos que incluem Ca

2+ provocadores em comparação com a linha de GIC NSC-distai (G166NS). Estes variou de Ca

2 + canais iônicos permeáveis ​​(por exemplo, receptores de glutamato: GRIA1, GRIA2, GRIK3 e subunidades reguladoras GRIN2B e GRIN2D), Ca voltagem-

2 + canais de íon (CACNA1C /-E /H) e Ca

2 + -activated canais de potássio (por exemplo KCNN3) (Fig. 1e). Em contraste, a linha NSC-distal GIC (G166NS) expressaram níveis mais elevados de sensores de Ca intracelular

2 + buffers (por genes familiares exemplo S100 e CALB1).

Para delinear mais diferenças de Ca

2+ expressão do gene entre as linhas e as NSC GIC testados, a expressão de Ca

2+ provocadores e tampões foi analisado em mais detalhe em todas as três linhas GIC (S1 Fig.). Como sugerido nas comparações emparelhadas anteriores, a expressão de receptores de glutamato diminuída em linhas GIC NSC-distais (Fig. 2a). O GRIA1 receptor AMPA (Ca

2 + permeável receptor ionotrópicos de glutamato), que apresentou a maior expressão entre os receptores de glutamato, classificou as linhas GIC idêntica à ordem GliNS1 G179NS G166NS observada na análise PCA (Fig. 1A) com base na comparação com a expressão do gene NSC. Em contraste, a expressão de Ca

2 + buffers /efetores aumentou com uma ordem de classificação inversa do GliNS1 G179NS G166NS (Fig 2B.). Isto foi particularmente notável para o gene S100A6 que foi mais abundantemente expressa em G166NS. Similar aos dados de mRNA, análise de transferência de Western de GRIA1 revelou uma expressão de 70% e mais de 95% inferior em G179NS e G166NS respectivamente, quando comparado com a linha de GliNS1 NSC-proximal (Fig. 2B e 2E). A análise por Western blot de S100A6 mostrou uma expressão de 45% e 90% inferior em G179NS e GliNS1, respectivamente, quando comparado com a linha de G166NS NSC-distai (Fig. 2C, 2D e 2E).

Análise de expressão de Ca

2+ provocadores tal como uma das subunidades do receptor de glutamato permeável GRIA1 (a) ou Ca

2+ tampão S100A6 (B), classificou-se as 3 linhas GIC (GliNS1 e G166NS, N = 5 cada. G179NS , n = 2.) de acordo com Ca

2+ sensibilidade ao fármaco, com canais de glutamato, tais como GRIA1, prevendo maior sensibilidade e tampão expressão predição menor sensibilidade (*** p 0,001; desemparelhado de duas caudas teste-t) . (C) análise de transferência de Western mostrou a expressão da proteína GRIA1 e S100A6, com β-actina como controlo de carga. (D) os níveis de expressão da proteína GRIA1 foram expressos como alteração percentual dobra quando comparado contra a GliNS1 (n = 3) e os níveis de expressão de proteína (E) S100A6 foram expressos como alteração percentual dobra quando comparado contra G166NS (n = 3) (** * p 0,001; ** p 0,01, * p . 0,05 One-way ANOVA)

GIC Ca

2 + sensibilidade droga se correlaciona com transcriptoma proximidade com NSCs

Além Ca

2 + provocadores e buffers, membrana plasmática localizada Ca

2 + transportadores, tais como trocadores de sódio-cálcio (NCX) pertencentes à família SLC8 eo SERCA (Sarco /retículo endoplasmático Ca

2 + ATPase) da bomba localizada na membrana do retículo endoplasmático (ER), remover activamente citosólica de Ca

2+ para manter a homeostase [27] – [30]. Para explorar as potenciais implicações funcionais de uma expressão diferencial de Ca

2 + canais iônicos e Ca

2 + genes ligação, temos próxima realizados um desafio mediada por droga de Ca

2 + homeostase e sinalização, no GIC linhas. As células foram expostas quer para o catião independente alvo (Ca

2+) ionóforo A23187 ou do inibidor da bomba de SERCA tapsigargina (Fig. 3), o que aumenta citosólica de Ca

2+ níveis por dois mecanismos diferentes: A23187, permitindo Ca

2 + para atravessar a membrana celular normalmente impermeável e Thapsigargin bloqueando importação de Ca

2 + para o ER. As linhas GIC mostrou diferenças na sensibilidade tanto para A23187 e Thapsigargin (Fig. 3A e 3B, respectivamente), notavelmente com uma ordem de classificação entre as linhas idênticas à do fim transcriptoma classificação NSC-enraizado, com o NSC-proximal GliNS1 sendo mais sensível do que G179NS, enquanto os G166NS NSC-distais foi menos sensível a ambas as drogas. Funcional análises, assim, mostrar que GICs NSC-proximais com uma expressão mais elevada de Ca

2 + provocadores, são mais sensíveis a distúrbios no Ca citosólico

2 + regulação de GICs com um fenótipo NSC-distal que expressam níveis mais elevados de Ca

2 + buffers.

(a) dose análise da resposta (0,01-40 mM) do Ca

2 + ionóforo A23187 e (B) o SERCA Ca

2 + inibidor da bomba de Thapsigargin mostrou que Ca

2 + classificação de sensibilidade às drogas encomendado com transcriptoma semelhança com NSCs, com maior sensibilidade nas GICs NSC-proximais. NSC proximal GIC foi mais sensível a (C) 40 uM A23187 e (D) 0,156 uM tapsigargina tratamentos em comparação com as linhas distais NSC (* P 0,05; desemparelhado de duas caudas t-teste). GICs NSC-proximais n = 3 e NSC-distais GICs n = 4.

Redução de Ca

2 + sensibilidade às drogas em cima GIC diferenciação

Como a sensibilidade à Ca

2+ drogas foi associada com uma expressão NSC-como o perfil da questão de saber se a diferenciação de GICs afetaria Ca

2 + sensibilidade foi investigada. Para este fim, três linhas de GIC foram submetidas a um protocolo de diferenciação utilizando soro fetal de bovino (FBS). Validação de diferenciação foi feita por análise de transcriptoma das linhas GIC e sua progênie diferenciada utilizando sequenciamento RNA (S1 Tabela). Análise de componentes principais do conjunto global de dados mostrou que as mudanças no transcriptoma eram distintos e separados de forma significativa entre GICs indiferenciadas e GICs diferenciadas (diffGICs) (fig. 4a). Curiosamente, a expressão GRIA1 que se correlacionou com Ca

2+ sensibilidade ao fármaco, diminuiu em todas as linhas durante a diferenciação GIC (Fig. 4B), o que sugere que o estado de diferenciação pode afectar Ca

2+ sensibilidade. Funcional Ca

2 + sensibilidade foi, portanto, testada usando A23187 (10 uM, 48 horas) em GICs diferenciados e comparados com GICs indiferenciadas revelando um efeito claramente reduzida na viabilidade celular em todas as linhas GIC sobre diferenciação e com o efeito mais forte da droga sensíveis NSC-proximal GIC line (GliNS1) (Fig. 4C). Estes resultados suportam ainda mais os dados que Ca

2 + sensibilidade está associada com GICs NSC-como imaturos.

(A) mapeamento transcriptoma RNA sequenciamento seguido por análise de componentes principais segregação entre GICs diferenciadas e indiferenciadas (verificado GliNS1 , G179NS e G166NS). painel direito mostra colorações de imunofluorescência da diferenciação marcadores GFAP (vermelho) e TuJ1 (verde) após tratamento FBS. (B) A comparação dos níveis de expressão em GRIA1 GIC indiferenciadas e diferenciadas (n = 6) revelou uma redução na mudança vezes na expressão GRIA1 na diferenciação induzida por soro em todas as linhas de GIC. (*** P 0,001; desemparelhado de duas caudas t-teste). (C) análise de viabilidade celular de sensibilidade relativa para o Ca

2+ ionóforo A23187 após a diferenciação mostrou aumento da viabilidade na diferenciação da linha GIC NSC-proximal GliNS1 (* p 0,05; desemparelhado de duas caudas teste-t).

a expressão gênica correlacionando-se com Ca

2 + sensibilidade de drogas

Para explorar potenciais genes adicionais que correlacionam com Ca

2 + sensibilidade, os dados de transcriptoma de nove novas linhas GIC (derivado em um laboratório independente) foi comparado ao Ca

2 + dados de sensibilidade da exposição a Thapsigargin (72 h de exposição) (Fig. 5A e S2 tabela). 7 dos 9 linhas foram mostrados para recapitular o tumor progenitor (S3 Tabela). Análise de correlação (Pearson) entre NSC-marcadores e sensibilidade a tapsigargina (1 uM) revelou uma correlação significativa para nestina (NES) (Fig. 5B, outlier marcado a vermelho foi excluído da análise) e proteína de lípido-bindig cérebro (BLBP /FABP7) (Fig. 5C) a expressão do mRNA, ao passo que não foi observada correlação para SOX2 (dados não mostrados). A análise Western blot ainda verificado que as linhas de cálcio sensíveis a drogas (U3017-MG e U3084-MG) expressaram mais do que proteína BLBP linhas menos sensíveis (U3013-MG e U3035-MG) (Fig. 5D). A análise de correlação também confirmou uma correlação entre a sensibilidade a tapsigargina e expressão GRIA1 (Fig. 5E), o que foi confirmado por meio de análise dos níveis de proteína por Western blot, como a expressão da proteína GRIA1 foi detectada apenas nas GIC sensíveis (Fig. 5F). O enriquecimento de genes e ontologia gene análises genes envolvidos na regulação do ciclo celular, o oxigênio, o metabolismo do RNA e da macromolécula implícita, e não inesperadamente Ca

2 + de sinalização mediada como correlacionando-se com Ca

2 + sensibilidade às drogas (Fig. 6A) .

(a) Nove novos GIC linhas foram submetidos a Thapsigargin análise da resposta dose (0,1-100? M), mostrando resposta diferente a doses moderadas de drogas. (B, C) Lote de correlação entre a viabilidade celular após Ca

2 + exposição à droga (Thapsigargin, 1 uM) e NES (B) e /expressão (C) FABP7 mRNA BLBP. U3047-MG foi considerado um outlier no gráfico NES (marcado em vermelho) e forma excluídos da análise. (D) Análise de Western blot mostrando BLBP expressão da proteína (FABP7) em selecionado Thapsigargin sensíveis (U3017-MG e U3084-MG) e menos sensível (U3013-MG e U3035-MG) linhas celulares, com β-actina como controlo de carga. (E) Lote de correlação entre a viabilidade celular após expressão Ca

2 + exposição à droga (Thapsigargin, 1 uM) e mRNA GRIA1. expressão (F) Western Blot análise mostrando proteína GRIA1 no selecionado Thapsigargin sensíveis (U3017-MG e U3084-MG) e menos sensível (U3013-MG e U3035-MG) linhas celulares. β-actina foi utilizada como controle de carga.

(A) A análise de correlação de genoma expressão ampla mRNA (análise de microarray) e sensibilidade à Thapsigargin (1 uM) em 9 linhas GIC adicionais, recuperados 785 genes correlacionando-se com Ca

2 + sensibilidade de drogas. enriquecimento Gene e ontologia analisa o envolvimento identificado de genes que afetam a proliferação, oxigênio e metabolismo de RNA, catabolismo e Ca

2 + de sinalização mediada. (B) 385 genes correlacionando-se positivamente com alta sensibilidade foram filtrados primeiro para genes também expresso mais elevado na linha GIC NSC-GliNS1 proximal e, depois, também ser regulada negativamente nesta linha na diferenciação, que foi encontrada para reduzir Ca

2+ sensibilidade droga , recuperar um conjunto de nove genes, incluindo o GRIA1 codificação receptor AMPA.

para identificar genes neste conjunto de dados que também associada a uma assinatura stemness NSC-proximal em GICs, o conjunto foi posteriormente filtrada para genes, que também (1) ter uma expressão mais elevada em comparação com GliNS1 G166NS e (2) foram regulados negativamente na diferenciação (Fig. 6B). Este pegou uma pequena lista de nove genes, dos quais dois codificam para canais iônicos que podem aumentar citosólica Ca

2 + (Ca

2 + provocadores), ou seja, GRIA1 e o retificador para dentro K

+ canal KCNJ4 , que pode participar na manutenção de um potencial de membrana despolarizada necessária para ativar Ca voltagem-

2 + canais e Ca

2 + receptores de glutamato permeáveis. Em resumo, a correlação entre Ca funcional

2 + droga sensibilidade e expressão gênica sugere a participação no sentido de sensibilidade ao Ca

2 + sobrecarga, por uma rede de genes envolvidos na manutenção Ca

2 + homeostase e provocou-droga potencial de membrana.

análise Reactome drogas identifica Ca

2 + expressão genética induzida no transcriptoma mundial

para identificar as respostas intracelulares para Ca

2 + subjacente ao nível diferencial de Ca

2+ sensibilidade no GIC, os GliNS1 NSC-proximais e distais NSC-G166NS foram expostas a A23187 durante 7 horas, seguido por análise de transcriptoma por sequenciação de ARN ( “mapeamento Reactome droga”) (S4 Tabela). Na maioria Ca

2+ droga sensível linha GIC GliNS1, genes com expressão alterada de modo significativo (Benjamini ajustado p-valor 0,05) foram analisados ​​através de um enriquecimento do gene e ontologia gene, que mostrou que os genes relacionados com o ciclo celular foram alteradas (Fig . 7B e S2 Fig.), sugerindo que a paragem do ciclo celular antes da morte celular. Não inesperadamente, genes envolvidos na resposta ER o stress foram também enriquecido, assim como genes em processos metabólicos de ARN. Curiosamente genes, processo metabólico ARN envolvidas também foram correlacionando-se com sensibilidade tapsigargina na experiência anterior (Fig. 6A).

resposta transcricional ao aumento citosólica de Ca

2+ (A23187), foi investigada por sequenciação de ARN depois 7 horas de exposição à droga no NSC-proximal GIC linha GliiNS1 ea linha NSC-distal G166NS. parcelas vulcão de forma significativa (p 0,05) alterou a expressão gênica em GliNS1 (A) e G166NS (C) com genes induzidos compartilhados marcados em vermelho e verde (Ca

2 + factor de transcrição activado NFATC2). Observe as diferenças no eixo x indicando maior todos indução mundial da expressão do gene em GliNS1. (B) O enriquecimento do gene e gene ontologia análise de genes com uma mudança significativa na expressão (p 0,05) em GliNS1, genes identificados envolvidos na progressão do ciclo celular, bem como funções de Golgi associada /ER e resposta ao stress celular. (D) Análise de enriquecimento de Gene de genes reprimidos pelo menos 3 vezes na GliNS1 e regulada pelo menos 1,5 vezes na G166NS.

Os genes com expressão alterada após exposição à droga foram plotados contra o valor da expressão média (antes