Abstract
Recentemente descobrimos que
ATP5J
foi sobre-expresso em amostras de tecido de pacientes com câncer colorretal. No entanto, o significado clínico e função da sobre-expressão de
ATP5J
nestes pacientes permanece incerto. Investigamos essas questões no estudo atual. Os nossos resultados indicam que a expressão de
ATP5J
foi significativamente mais elevada em tecido de cancro colorrectal do que no tecido adjacente, e era também significativamente mais elevada em linfonodos metastáticos do que em tecido de cancro primário (
P
0,05). Observou-se uma correlação entre o
foi detectado ATP5J
expressão e tumor diferenciação, mas nenhuma correlação com o sexo, idade, estágio T, metástases em linfonodos, ou status de sobrevivência. A regulação negativa do
ATP5J
expressão atenuada a capacidade de migração de células e a sensibilidade aumentada para o 5-fluorouracilo (5-FU) em células da linha de células DLD1. Inversamente, a sobre-regulação de
ATP5J
migração celular expressão aumentada e diminuição da sensibilidade do 5-FU, sugerindo que a função de ATP5J em cancro colo-rectal pode envolver a migração de células e a sensibilidade do 5-FU.
Citation : H Zhu, Chen L, W Zhou, Huang Z, J, Hu, S Dai, et ai. (2013) sobre-expressão do
ATP5J
Gene correlaciona-se com a migração celular e 5-fluorouracil Sensibilidade no câncer colorretal. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10.1371 /journal.pone.0076846
editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China
Recebido: 18 de fevereiro de 2013; Aceito: 31 de agosto de 2013; Publicação: 04 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (30700970 e 81272681), os fundos de pesquisa fundamental para a Universidades Central e Programa para o Team Pesquisa inovativa na província de Zhejiang (2010R50046). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é o segundo câncer mais comum nos Estados Unidos e outros países desenvolvidos [1,2], e sua incidência está a aumentar de ano para ano nos países em desenvolvimento [3,4]. Como sabemos, carcinogênese e desenvolvimento do cancro colorectal compreende uma série de processos complicados aqueles envolver vários genes e passos. Apesar de um crescente corpo de genes têm sido relatados na literatura [5-7], a busca de novos genes que poderiam estar relacionados à carcinogênese, desenvolvimento, diagnóstico ou tratamento de câncer colorretal continua. Por isso, procurou o banco de dados do sábio e confirmou os candidatos gene de interesse por RT-PCR (RT-PCR). Em última análise, foi identificado um gene,
ATP5J
, que foi sobre-expresso no cancro colorectal.
Um componente do F
0, ATP5J é uma proteína localizada na mitocôndria, que é uma parte solúvel em lípido de ATP sintetase [8]. O precursor de ATP5J consiste de 108 aminoácidos e que vai ser despojada de 32 aminoácidos [9]. O produto contendo as residuais 76 aminoácidos é mantida na mitocôndria para transferência de energia [9]. Tradicionalmente, ATP5J foi pensado para recuperar o intercâmbio entre o fósforo inorgânico e o ATP, bem como a actividade de ATPase que é inibida por oligomicina [10]. Pesquisas recentes, no entanto, mostrou que ATP5J é amplamente distribuído na superfície de células endoteliais vasculares [11,12]. Portanto, também podem ser segregadas para o sangue e circulada para combinar com a subunidade β de ATP sintetase localizado na superfície de células endoteliais vasculares. Subsequentemente, a actividade de fosfolipase A2 pode ser inibida pela activação da via de sinalização relacionada, que será seguida pela inibição da síntese de prostaglandina que promove vasoconstrição [12]. Recenetly, algumas literaturas têm mostrado que
ATP5J
gene é sobre-expresso em uma série de cancros, incluindo carcinoma de células renais e carcinoma hepatocelular [13,14]. No entanto, a função de sobre-expresso
ATP5J
em cancros ainda não foi documentada.
De acordo com a introdução do ATLAS proteína humana (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /normal), proteína ATP5J pode ser expresso em vários tecidos normais e órgãos incluindo os do cólon e do recto. Nossos dados preliminares também confirmou este fenómeno. Mais importante, os nossos dados demonstram que
ATP5J
foi sobre-expresso no cancro colo-rectal em comparação com o tecido normal. O objetivo do estudo foi investigar o significado clínico e função da sobre-expressão de
ATP5J
em células de cancro colorrectal. Nossos resultados mostraram que
ATP5J
foi sobre-expresso em amostras de tecido de pacientes com câncer colorretal e que havia uma correlação entre o
ATP5J
expressão e tumor diferenciação. Além disso, a sobre-expressão de
ATP5J
migração celular melhorada e resistência induzida a 5-fluorouracil (5-FU) nas células do câncer colorretal.
Material e Métodos
Collection de amostras de tecidos frescos
Este estudo foi aprovado pelo hospital Sir Run Run Shaw e Comissão de Ética Zhejiang University (NO.20100823). amostras de tecidos cancerosos frescas foram obtidos diretamente dos espécimes de operação de 72 pacientes consecutivos que se submeteram a ressecção cirúrgica para adenocarcinomas colorretais esporádicos primários no Departamento de Cirurgia Colorretal, Sir Run Run Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, China, entre setembro de 2010 e março de 2011 . consentimento informado por escrito para a coleta de tecido foi obtido de todos os pacientes antes de seus procedimentos cirúrgicos. Nenhum destes pacientes tinha tido qualquer quimioterapia pré-operatória ou radioterapia. Os tecidos adjacentes foram coletados de mais de 5 cm de distância do tecido canceroso.
Pacientes e dados clínicos coleção
As secções de parafina de amostras de um total de 79 pacientes com dados clínicos intactas que foram diagnosticadas com câncer colorretal entre julho de 2006 e junho de 2007 no nosso hospital foram coletadas para coloração imuno-histoquímica. O tempo médio de seguimento dos pacientes foi de 52,6 meses, ea taxa de sobrevida global foi de 73,4% no último follow-up. Entre estes 79 casos, o tecido canceroso e de tecido normalmente pares adjacentes relativas foram estudados em 51 casos, e amostras de tecido de linfonodos metastáticos foram estudados em 26 casos. Todas as secções foram preparados para imunohistoquímica em lâminas que foram utilizados para a comparação
expressão ATP5J
entre diferentes tecidos.
Células e cultura de células
linhas celulares de cancro do cólon humano DLD1, RKO, SW620, SW480 e Colo320 foram adquiridos pelo Instituto de Cell Research, em Xangai, China. A linha de células de fibroblasto humano normal (NHFB) foi obtido a partir do tipo de colecção global Bioresource Centro-Cultura Americana (Manassas, VA, EUA). As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v /v) de soro inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS), 1% de glutamina, e de um antibiótico-antimicótico mistura 1 × (Invitrogen, Pequim Office, Pequim , China). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO
2 e seria usado para a análise de RT-PCR. Além disso, DLD1, bem como células SW620 que ser subsequentemente utilizado para uma série de outros ensaios.
A transcrição reversa PCR
As amostras de tecido de 100 g foram homogeneizados usando um moinho com azoto líquido seguido por lise com reagente TRIZOL (Invitrogen Pequim Office, Beijing, China). As células cultivadas como acima mencionados foram lisadas directamente utilizando o reagente TRIZOL após o tratamento. Extraiu-se ARN seguindo as instruções do fabricante. Um micrograma de ARN de cada amostra foi transcritos de modo inverso em ADNc utilizando hexâmeros aleatórios como iniciadores de transcrição inversa (Applied Biosystems Xangai Office, Xangai, China). Em seguida, a reacção em cadeia da polimerase típico (PCR) para a
ATP5J
gene foi realizada. O ser humano
gene GAPDH
foi usado como um controlo interno para normalizar a quantidade de mRNA. As sequências dos iniciadores eram as seguintes: 5′-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 ‘e 5′-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3’ para
ATP5J
; 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘e 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ para
GAPDH
.
imuno coloração
A imunocoloração foi realizada utilizando um kit MaxVision (Maixin Biol, Fuzhou , China). Resumidamente, secções de 4 um de espessura foram cortadas de blocos de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina, montadas em lâminas revestidas de polilisina, desparafinados em xileno e re-hidratadas através de uma série graduada de soluções de etanol. Após desparafinização, as lâminas foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% em solução de metanol durante 10 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena, em seguida, tratamento do antigénio de recuperação foi realizado a 121 ° C (autoclave), durante 5 minutos em tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 7,4) . ligações não específicas foram bloqueadas por tratamento de lâminas com soro de cabra normal a 10% durante 10 minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo ATP5J (Aplicações celular, San Diego, CA, diluição 1: 8000) durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as lâminas foram incubadas com uma gota de reagente MaxVision durante 30 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi realizada utilizando 0,05% de diaminobenzidina e 0,03% de peróxido de hidrogénio em Tris-HCl a 50, pH 7,6, durante 5 minutos. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Meyer 1%. Como controlo negativo, as secções de tecido foram tratadas com soro normal em vez de anticorpo ATP5J.
Avaliação da coloração
Todas as secções foram marcados cegamente sob um microscópio de luz. As células com estrutura clara e grânulos marrom-amarelos que foram mais elevadas do que o fundo foram consideradas positivas; caso contrário, as células foram consideradas negativas. Para cada lâmina, foram examinados 5-10 campos de elevada ampliação (× 400). Em seguida, as lâminas foram pontuados de acordo com a percentagem de células positivas: 0 ( 5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), ou 4 (76- 100%). Simultaneamente, as lâminas foram pontuados de acordo com a intensidade da coloração: 1 (amarelado), 2 (castanho-amarelado), ou 3 (Brown) [15]. O resultado final foi calculada como a soma destas duas contagens.
análise Western blot
As células foram lavadas com PBS frio e submetidas a lise em tampão de lise de Laemmli. Quantidades iguais de lisado foram separadas utilizando 10% de electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) e em seguida, transferido para Hybond quimioluminescência aumentada (ECL) membranas (Amersham Bioscience, Inglaterra). As membranas foram então bloqueados com tampão de PBS contendo 5% de leite com baixo teor de gordura e 0,05% de Tween-20 durante 1 hora ou durante a noite a 4 ° C, lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBST), e incubadas com anticorpo ATP5J durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente. Depois de ser lavada novamente com PBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase e desenvolvidos com um kit de detecção de quimioluminescência (kit ECL, Amersham Bioscience, Inglaterra). Anticorpo de coelho anti-humano ATP5J foi adquirido a partir de aplicações celular. β-actina foi usado como um controle de carga.
Construção do plasmídeo expressando
ATP5J
Um plasmídeo pOTB7 contendo o
ATP5J
sequência foi comprado de Invitrogen (clone ID 3357779). O
ATP5J
sequência foi clonada em um p △ plasmídeo E1sp1A usando EcoRI /XhoI enzimas. Em seguida, foi ainda digerido e clonado num plasmídeo pcDNA3.1 (+), utilizando as enzimas BamHI /HindⅢ para se obter um novo plasmídeo denominado pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Após a expressão de
ATP5J
foi confirmada, este novo plasmídeo foi usado para a próxima parte do estudo.
transfecção celular e colônia estável selecção
Para a transfecção, as células foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1×10
5 células por cavidade e deixadas a crescer durante a noite a 90-95% de confluência. No dia seguinte, as células foram transfectadas com a mistura de 0,8 ^ g de plasmídeo ATP5J shRNA (Origene, EUA), pcDNA3.1 plasmídeo (+) /ATP5J, ou plasmídeo de controlo negativo (Origene, EUA) mais 2 ul de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) em 100 de meio isento de soro uL de acordo com as instruções do fabricante. Para produzir células estávelmente transf ectadas após a transfecção com o plasmídeo correspondente, 10 ug /ml de puromicina (Roche, Mannheim, Alemanha) foi adicionado às 48 horas para o meio (DMEM + 15% FBS). As células foram deixadas em meio selectivo durante 2 semanas; Após este tempo, foram tripsinizadas e recultivadas em meio selectivo durante a propagação.
A viabilidade celular ensaio
A viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de MTT (brometo de 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -2 , 5 difeniltetrazólio; Sangon, Xangai, China). Resumidamente, as células (5×10
3 por poço) foram semeadas em placas de 96 cavidades para observação de uma série de pontos de tempo. Em seguida 100 ul de solução MTT (10 mg /ml) foi adicionada a cada poço, e a incubação foi continuada durante 4 horas antes de o meio foi removido. Em seguida, 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi aplicada a cada poço por mais 10 minutos. Finalmente, o valor de OD
570 nm foi determinada; Este valor representa a viabilidade das células. Cada experiência foi realizada em quadruplicado e foram repetidas pelo menos duas vezes.
celular ensaio clonogénico
1000 células foram cultivadas em placas de 10 cm com meio de cultura normal numa incubadora contendo 5% de CO
2 a 37 ° C durante 14 dias. colónias individuais ( 50 células por colónia) foram fixadas e coradas com uma solução contendo 0,25% de corante de violeta de cristal e 20% de etanol durante 20 minutos. As colónias foram contadas utilizando o software Óptimas (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, EUA). Cada experiência foi efectuada em triplicado e foi repetido duas vezes.
A citometria de fluxo de ensaio
As células foram tratadas com tripsina e lavadas uma vez com PBS frio. Em seguida, as células foram fixadas com etanol frio durante a noite a 70% a 4 ° C. Trinta minutos antes de serem ensaiados, iodeto de propídio (PI) a coloração foi realizada como descrito anteriormente [16-18]. A citometria de fluxo ensaios foram realizados no Laboratório Principal de Sir Run Run Shaw Hospital.
-cicatrização de feridas ensaio
A migração celular foi estudada usando um ensaio de cicatrização zero. As células (5×10
5 por po) foram semeadas em placas de seis poços e deixou-se aderir durante 24 horas. As células foram tratadas com 10 ug /ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 3 horas, lavada com PBS, em seguida, simplesmente feridos com uma ponta de pipeta. meio completo fresco foi adicionado, e as células foram deixadas a fechar a ferida durante 48 horas ou menos. As fotografias da mesma posição da ferida foram tomadas em pontos de tempo correspondentes. A experiência foi realizada em triplicado.
A migração celular ensaio
As células foram tripsinizadas e ressuspensas em DMEM contendo 1% de FBS a uma densidade de 1×10
6 células /ml. No total, 100 ul da suspensão de células foi plaqueada em um de 24 poços Transwell (Costar, Corning, Nova Iorque). DMEM (600 uL) contendo 10% de FBS foi colocada na câmara inferior. Após incubação durante 24 horas, as células restantes na câmara superior foram removidas cuidadosamente usando uma mecha de algodão, e a membrana foi cortada utilizando uma faca de operações. O lado virado para a câmara inferior foram corados com corante de violeta de cristal a 0,05%, e as células fixadas foram contadas sob um microscópio de luz. O experimento foi repetido três vezes.
A análise estatística
Correlação entre
ATP5J
expressão e características clínicas foi avaliada utilizando análise de correlação, e as diferenças entre os grupos foram avaliados usando o Wilcoxon -par correspondente de teste ou por ANOVA utilizando o software SPSS15.0 (SPSS, Inc., Chicago, EUA).
P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
ATP5J
foi sobre-expresso em tecidos de câncer colorretal clínicos
No banco de dados Sage (http: //. cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer), temos procurado por uma série de genes candidatos aqueles foram diferencialmente expressos em câncer colorretal. Foram identificados vários genes interessantes, incluindo tetraspanina TM4-C, oligophrenin 1, ATP5J, glicoproteína transmembrana A33 precursor, DHRS9, citidina desaminase, uroguanilina, e fosfatase de dupla especificidade 1. No entanto, os nossos principais resultados de RT-PCR indicaram que apenas uroguanilina foi reduzido e que
ATP5J
foi sobre-expresso em cancro colo-rectal (Figura 1A). Os outros genes estavam inalteradas ou indetectáveis na nossa experiência (dados não mostrados). Porque expressão de uroguanilina e sua função no câncer de cólon foi esclarecido em um relatório anterior [19], mas não para o
ATP5J
gene, este último foi escolhido como o único objetivo de nosso estudo.
resultados da RT-PCR (a) para a
ATP5J
e
uroguanilina
genes. (b) os resultados coloração imuno-histoquímica para tecidos adjacentes e tecido canceroso. (C) resultados coloração imuno-histoquímica para tecidos adjacentes, tecido canceroso e do tecido linfonodo metastático.
Para confirmar a expressão de
ATP5J
no cancro colorectal, analisamos ainda mais a expressão de
ATP5J
ARNm por RT-PCR em tecidos tumorais frescas e tecidos normais adjacentes a partir de 72 pacientes consecutivos (Tabela 1). Os resultados indicaram que as porcentagens positivas de RT-PCR para
ATP5J
em tecidos de pacientes com câncer colorretal atingiu cerca de 54,17%, o que foi semelhante entre o câncer de cólon e câncer retal. No entanto, a expressão de
ATP5J
foi significativamente mais elevada em tecido de cancro colorrectal do que no tecido normal entre os pacientes de PCR-positivas (Tabela 1,
P
0,01). Nossos imuno-histoquímica resultados de coloração das secções de parafina de outros 51 pacientes mencionados no
seção Pacientes e dados clínicos coleção
indicava um resultado semelhante, mas com uma maior proporção positiva (Figura 1B e Tabela 1,
P
0,05). resultados ainda mais imunocoloração também demonstrou que
ATP5J
expressão foi significativamente maior nos gânglios linfáticos metastáticos do que em tecido de cancro primário (Figura 1C e Tabela 2,
P Art 0,05). condição ATP5J
processo n.
casos positivos
a distribuição dos casos positivos por expressão ATP5J no tumor vs. tecido adjacente
P
valor
T
* A
*
T = A
T A
mRNA por PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2,6%) 0.01Protein por IM
* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) 0.05Table 1. Condição de expressão ATP5J no tumor colorectal e do tecido adjacente
* T:. tumor; A: adjacente; . IM: coloração imuno-histoquímica CSV Baixar CSV ATP5J no MLN
*
caso NO
MLN T
MLN = T
MLN T
P
valor
Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) 0.05Negative1 (3,8%) – 1 (3,8%) Tabela 2. Condições de expressão ATP5J no tumor colo-rectal e da linfa metastático nós
* MLN:. linfáticos metastáticos gânglios CSV Baixar CSV
Correlação entre a sobre-expressão de
ATP5J Comprar e características clínicas de pacientes com câncer colorretal
Para analisar a relação entre mais de -expression de ATP5J e características patológicas clínicas de pacientes com câncer colorretal, secções de parafina de 79 pacientes, conforme mencionado na seção de
pacientes e coleta de dados clínicos
, foram coletadas. coloração imuno-histoquímica foi realizada sobre estas lâminas e as pontuações foram calculados como mencionado acima. De acordo com essas pontuações,
ATP5J
expressão pode ainda ser dividido em duas fileiras: fraco (≤4) e forte ( 4). Em seguida, a análise de correlação foi feita utilizando software SPSS; os resultados são apresentados na Tabela 3. Entre as características clínicas referidas, único grau de diferenciação tiveram uma correlação com a expressão
ATP5J
. Sexo, idade, estágio T, metástase ganglionar, bem como o status de sobrevivência não mostrou correlação com a expressão
ATP5J
. Estes resultados indicaram que
expressão ATP5J
em tumores bem diferenciados foi mais fraca do que em tumores pouco ou moderadamente diferenciados (
P Art 0,05).
Caso Variável NO
fraco
Strong
P Vaule
GenderFemale358270.281Male441529Age 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic LNM
* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Correlação entre expressão ATP5J e características patients’clinical
* LNM:. linfáticos metástases CSV Baixar CSV
Detecção de
expressão ATP5J
em linhas celulares de cancro do cólon
foi difícil para esclarecer o função subjacente de ATP5J no cancro colorectal dependendo apenas das análises clínicas. foram necessários estudos de biologia molecular mais para esta finalidade. Portanto, a nossa atenção foi deslocada de pacientes com câncer colorretal para linhas celulares. Para compreender a expressão de
ATP5J
em linhas celulares de cancro colorrectal, cinco linhas celulares de cancro colorrectal foram recolhidos (DLD1, RKO, SW620, SW480, Colo320 e), e fibroblastos humanos normais (NHFB) foi utilizado como normal controlo de células. Em primeiro lugar, que o produto recolhido a partir de ARNm de células e estas linhas realizada RT-PCR como descrito anteriormente. Estes resultados mostraram que ATP5J ARNm foi sobre-expresso em todas as linhas celulares de cancro do cólon, mas não no NHFB (Figura 2A). Em seguida, realizada transferência Western nas amostras de proteína destas linhas celulares. Os resultados demonstraram um fenómeno semelhante. proteína ATP5J foi sobre-expresso em quatro linhas celulares de cancro do cólon (exceto RKO), em comparação com NHFB (Figura 2B). Com base nestes resultados, principalmente escolheu células DLD1 para a próxima parte do nosso estudo; DLD1 mostrou um grau moderado de
ATP5J
expressão, que foi conveniente para observar a diminuição da regulação, bem como o aumento da regulação da expressão do gene na mesma linha celular, utilizando técnicas moleculares.
rESULTADOS (a) RT-PCR para mRNA de ATP5J. (B) os resultados de transferência Western para a proteína ATP5J.
Down-regulação da
ATP5J
migração celular expressão atenuada e aumento de 5-FU sensibilidade em células DLD1
Primeiras , nós regulada
expressão ATP5J
em células DLD1 através de transfecção estável com um plasmídeo expressando shRNA ATP5J alvo. Após selecção de colónias, Western blotting foi realizado (Figura 3A). A expressão de ATP5J foi regulada para baixo drasticamente no clone 4 e marginalmente no clone 9. Nós escolhemos clone 4 para um estudo mais aprofundado e definiu-o como ATP5J shRNA /4. Enquanto isso, o clone 2 do shRNA controlo foi utilizado como controlo do vector (vector), e do tipo selvagem DLD1 (WT) foi usada como um controlo simulado.
(A) sequência de Western blot de proteínas ATP5J em diferentes clones de DLD1 célula após transfecção estável com o mesmo plasmídeo ATP5J shRNA. (B) ensaio de cicatrização de feridas para WT, Vector e ATP5J shRNA /4 células DLD1. Os dados representam uma das três experiências semelhantes (ampliação original: x100). (C) A migração de WT, Vector e ATP5J shRNA /4 DLD1 células foi testada usando um sistema de 24-Transwell. As imagens de células que migraram foram tomadas 24 horas após a semeadura (ampliação original: x100). Os dados representam uma de três experiências semelhantes. (D) As análises quantitativas dos três ensaios de migração celular. Os valores representam médias ± DP. *
P Art 0,05; rácios de (E) apoptótica de WT, vetor, e ATP5J shRNA /4 DLD1 células após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias. Os dados representam uma das duas experiências semelhantes. Os valores representam médias ± DP. *
P
. 0,05
Os resultados do ensaio de MTT, ciclo celular por citometria de fluxo, ou formação de clones por ensaio clonogênica não revelou diferenças na sobrevivência de células entre WT, Vector , e ATP5J shRNA /4 grupos (dados não apresentados). No entanto, os dados do ensaio de cicatrização da ferida indicaram que as células no grupo ATP5J shRNA /4 levou 48 horas para fechar uma ferida zero, enquanto que as células nos grupos WT e Vector levou 48 horas para curar uma ferida de dimensão semelhante (Figura 3B). Este resultado sugeriu que a sub-regulação de
ATP5J
atenuada a capacidade de migração celular em células DLD1. Para quantificar o efeito de
ATP5J
infra-regulação sobre a migração celular, um ensaio ainda mais a migração foi realizada. Os resultados deste ensaio adicional mostrou que o número de células que migraram no grupo ATP5J shRNA /4 foi significativamente reduzido em comparação com ambos os grupos de WT e do vetor (Figura 3C e 3D,
P
0,05).
Além disso, queríamos avaliar a resposta das células cancerosas à terapia anti-câncer após a expressão ATP5J foi alterado. Para este efeito, nós escolhemos 5-fluorouracilo (5-FU) para o próximo estudo, uma vez que é frequentemente utilizado um fármaco quimioterapêutico anti-metabolito para o cancro colorectal. Os nossos resultados indicam que a proporção de apoptose ATP5J grupo shRNA /4 foi maior do que a de ambos os grupos de WT e o vector após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias (Figura 3E, P 0,05). Este resultado sugeriu que a regulação negativa do
ATP5J
aumentou a sensibilidade das células DLD1 de 5-FU.
Para confirmar ainda mais a função de ATP5J na outra linha de células, que derrubou o
expressão ATP5J
em células SW620, usando o mesmo plasmídeo como mencionado acima. Após a seleção colônia, que identificou um clone no qual
ATP5J
expressão foi dramaticamente regulada para baixo; que nomeou-ATP5J shRNA /3 (Figura 4A). Os resultados de ambas a detecção de apoptose e ensaios de viabilidade celular sugeriu que grupo a ATP5J shRNA /3 derivado de células SW620 foi mais sensível a 5-FU em comparação com os grupos de WT e o vector após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias (Figura 4B e 4C,
P
0,05). Este resultado é consistente com os nossos dados anteriores a partir de células DLD1 e confirma ainda mais a função de ATP5J em células cancerígenas do cólon
.
(A) sequência de Western blot de proteínas ATP5J em diferentes clones de células SW620 após transfecção estável com a mesma plasmídeo ATP5J shRNA. (B) Proporção apoptótica de WT, vetor, e ATP5J shRNA /3 SW620 células após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias. Os ensaios (C) a viabilidade celular de WT, vetor, e ATP5J shRNA /3 SW620 células após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias. Os dados representam uma das duas experiências semelhantes. Os valores representam médias ± DP. *
P
. 0,05
Up-regulação da
ATP5J
migração celular expressão aumentada e diminuiu 5-Fu sensibilidade em células DLD1
em seguida, queríamos para confirmar nosso resultado usando uma condição oposta em que
ATP5J
expressão foi ainda mais up-regulada. Para atingir este objectivo, o pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmídeo foi transfectado estavelmente em células DLD1. Após selecção de colónias, Western blotting foi realizado (Figura 5A). A expressão ATP5J foi regulada dramaticamente nos clones 2, 3 e 4. Nós aleatoriamente escolheu clones 2 e 4 para um estudo mais aprofundado e os definiu como ATP5J /A2 e ATP5J /A4, respectivamente. Enquanto isso, o clone 7 do plasmídeo controle foi usado como controle vetorial (Vector) e as células do tipo selvagem DLD1 (WT) foram utilizados como controle simulada.
(A) resultado Western blot para a proteína ATP5J em DLD1 células após a transfecção estável com plasmídeo pcDNA3.1 (+) /ATP5J. (B) ensaio de cicatrização de feridas para WT, Vector, ATP5J /A2, e as células ATP5J /A4. Os dados representam uma das três experiências semelhantes (ampliação original: x100). (C) Migrações de WT, Vector, ATP5J /A2, e as células ATP5J /A4 foram analisadas usando um sistema de 24 Transwell. As imagens de células que migraram foram tomadas 24 horas após a semeadura (ampliação original: x100). Os dados representam uma de três experiências semelhantes. (D) A análise quantitativa de três ensaios de células-migração. Os valores representam médias ± DP. *
P Art 0,05. ratios (E) apoptótica de células WT, Vector, ATP5J /A2 e ATP5J /A4 após o tratamento com 50 nmol /L 5-Fu, durante 3 dias. Os dados representam uma das duas experiências semelhantes. Os valores representam médias ± SD e *
P
. 0,05
Os dados sobre a sobrevivência celular, ciclo celular e formação de clones produziram resultados semelhantes aos apresentados acima. Não foi observada diferença entre os grupos WT, Vector, ATP5J /A2 e ATP5J /A4 (dados não mostrados). O ensaio de cicatrização mostraram que as células nos grupos ATP5J /A2 e ATP5J /A4 levou 44 horas para fechar uma ferida zero, enquanto que as células nos grupos WT e Vector tomou 44 horas para curar uma ferida de tamanho similar ( Figura 5B). Este resultado sugeriu que up-regulação da
ATP5J
migração celular reforçada em células DLD1. Um ensaio ainda mais a migração celular demonstraram que o número de células que migraram nos grupos ATP5J /A2 e ATP5J /A4 foi significativamente aumentada em comparação com os grupos da WT e do vetor (Figura 5C e 5D,
P
0,05). Enquanto isso, após o tratamento com 50 nmol /L de 5-FU durante 3 dias, os rácios apoptóticas dos grupos ATP5J /A2 e ATP5J /A4 foi significativamente menor do que os dos grupos de WT e do vetor (Figura 5E, P 0,05), indicando que up-regulação da
ATP5J
células DLD1 induzidas para resistir a 5-FU.
Discussão
Nosso estudo investigou o estado de
expressão ATP5J
em doentes com cancro colorectal, e os nossos resultados demonstraram que
ATP5J
foi sobre-expressos nestes pacientes. Este resultado foi oposto ao que na base de dados prudente. Pode ser devido à diferença de tamanho da amostra, bem como a selecção das amostras de polarização. De acordo com nossos dados, houve várias condições diferentes de expressão ATP5J no cancro colorectal, um deles foi reduzida. Além disso, o tamanho da amostra utilizada pela base de dados foi muito pequena. Assim, poderia ser entendido que tivemos uma conclusão diferente sobre a expressão ATP5J no cancro colorectal. Além disso, os nossos resultados foram obtidos em ambos os níveis de proteína e deve, portanto, ser convincente e ARNm.
Resultados adicionais mostraram que o grau de diferenciação foi correlacionada com
expressão ATP5J
. De acordo com a literatura publicada, a diferenciação do tumor era um factor de prognóstico para os doentes com cancros colorrectais [20,21]. Com base nisso,
ATP5J
expressão pode ser correlacionado com o status de sobrevivência, porém nossos dados não mostraram essa correlação. Adicional, nossos resultados também indicaram que
ATP5J
expressão foi maior nos gânglios linfáticos metastáticos em comparação com o tecido câncer primário correspondente, mas não teve correlação com metástase axilar. Esta discrepância pode ser causada por muitos factores incontroláveis clinicamente, em vez de pelas condições nos estudos biológicos moleculares, que foram controladas exactamente. Pode ser também causado pelo tamanho pequeno de pacientes incluídos e precisam de uma investigação com grandes amostras. Independentemente dessa discordância, os nossos novos resultados perspicuously indicaram que a regulação negativa do
ATP5J
expressão atenuada migração celular e aumentou 5-Fu sensibilidade em células DLD1.