Abstract

Durante a progressão de mesotelioma peritoneal maligno (MPEM), nódulos tumorais propagar difusamente dentro do abdômen e os tumores são caracterizados por fenotípica distinta sub-tipos. Estudos recentes em cancros de órgãos sólidos têm demonstrado que as células estaminais do cancro (CSCs) desempenham um papel crucial na iniciação e progressão de tumores. No entanto, não se sabe se existem células estaminais tumorigénicas e se promover o crescimento do tumor em MPEM. No presente estudo, nós desenvolvemos um modelo e caracterizado por CSC MPEM utilizando células estaminais tumorigénicas estavelmente expansíveis derivadas de tumores de doentes. Encontrámos populações morfologicamente distintas de CSCs que dividem assimetricamente ou simetricamente em

in vitro cultura de células MPEM

. As células estaminais MPEM (MPeMSCs) marcadores de células estaminais expressa c-Myc, NES e VEGFR2 e na presença de componentes da matriz células formam esferas de colónias. MPeMSCs são multipotentes, diferenciar-se em neuronal, vascular e progênie adiposo após indução definido e as células expressam marcadores de diferenciação de linhagem específica, como TUBB3, um marcador neuronal precoce; vWF, VEGFA, VEGFC e IL-8, marcadores endoteliais; e PPARy e FABP4, marcadores adiposo. experimentos xenotransplante utilizando MPeMSCs demonstraram crescimento tumoral precoce em comparação com as células parentais. Limitando experiências de diluição utilizando MPeMSCs e células endoteliais induzida por linhagem derivada de uma única MPeMSC resultou no crescimento do tumor no início do último grupo, indicando que a diferenciação endotelial de MPeMSCs é importante para a iniciação do tumor MPEM. A nossa observação de que os tumores MPEM contêm células com potencial tumorigénico-tronco tem implicações importantes para a compreensão das células de origem e progressão do tumor em MPEM e, portanto, CSCs segmentação pode ser uma estratégia útil para inibir a progressão maligna

Citation:. Varghese S , Whipple R, Martin SS, Alexander HR (2012) células-tronco cancerosas Multipotentes Derivado do maligno humano peritoneal mesotelioma Promover Tumorigênese. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10.1371 /journal.pone.0052825

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 23 de novembro de 2012; Publicação: 28 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Varghese et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro de haste (como) -cells com a auto potencial de iniciar -renewal e tumor foram identificados em diferentes tipos de tumores [1] – [3] e a evidência recente sugere que estas células desempenham um papel central na progressão de tumores malignos. O modelo de CSC descreve a existência de uma pequena subpopulação de células de plástico com potencial transdiferenciação em tumores. No entanto, estudos recentes sugerem que uma grande proporção de células dentro de tumores manter as propriedades das células estaminais e células ainda mais diferenciado pode ser transformado em células estaminais do tipo [4], [5]. Se este for o caso, a eliminação de CSCs pode não ser uma estratégia útil para a redução do crescimento do tumor. Portanto, é importante para o desenvolvimento de modelos para compreender a biologia CSC e identificar novas estratégias para prevenir a progressão do tumor maligno. Os mecanismos que regulam a auto-renovação de ambos os CSCs e de células estaminais normais são pensados ​​para ser semelhante [6]. Presentemente, a identificação e isolamento de CSCs têm sido em grande parte dependente de marcadores específicos da superfície celular [7], [8], embora a expressão de tais marcadores é dependente de vários factores tais como o estado de diferenciação das células e factores de nicho. CD133 foi utilizado como um marcador de células estaminais putativo no glioblastoma [9] e o cancro do cólon [10], CD34 expressando células epiteliais tumorais como CSCs em cancro cutâneo [11], CD44 células no cancro da mama que expressa [12], células positivas para CD26 são envolvida no processo de metástase, invasão e quimiorresistência em cancro do cólon [13], as células positivas CD271 iniciar progressão do melanoma e metástase [14] e as propriedades de CSCs foram identificados em células CD24 mesotelioma pleural positiva [15]. No entanto, não houve qualquer evidência para a existência de células-tronco assim iniciar o crescimento do tumor em MPEM. Por isso, foi investigada a presença de células tumorigénicas com mesotelioma propriedades de CSCs em linhas celulares estáveis ​​derivadas de tumores de doentes MPEM

maligno mesotelioma peritoneal origina difusamente dentro do revestimento serosa do peritoneu.; é um câncer agressivo com uma marcada tendência para metástases regionais. No momento do diagnóstico, este cancro é geralmente encontrado numa fase de progressão maligna difusa com um grande número de nódulos de tumor de tamanho variável. Em geral, os tumores têm um núcleo interno de espessura pouco vascularizado rodeado por uma área exterior neovascular. As opções de tratamento, como a citorredução cirúrgica e quimioterapia sistêmica pode controlar a progressão do tumor em alguns pacientes, mas a morte do paciente é predominantemente devido à reincidência do tumor progressivo. Recentemente, relataram que a activação de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e o alvo de mamífero de rapamicina na sinalização MPEM está associada com a sobrevivência do paciente encurtado [16]; estas vias estão envolvidos na activação de células-tronco e a proliferação de [17], [18]. sinalização PI3K também é importante para a manutenção da polaridade celular em células cancerosas [19].

Embora as linhas celulares derivadas MPEM sobreviver indefinidamente durante Passaging, no presente estudo, utilizou-se células-precoce de passagem derivadas de tumores de doentes para evitar a selecção de um subconjunto particular de células iniciar tumor agressivo preservados durante passaging prolongado. Aqui nós identificamos que uma grande proporção de células MPEM estáveis ​​prospectivamente gerados na cultura gerar células flutuante com propriedades de células-tronco embrionárias, como a divisão celular assimétrica, auto-renovação e multipotency. Os MPeMSCs individuais selecionados aleatoriamente mostrou progressão clonal, a diversidade fenotípica sob condições definidas e potenciais transdiferenciação. Portanto, a plasticidade considerável de MPeMSCs podem contribuir para a formação de a população de células desenvolvente diversificada encontrados em tumores e agressividade de tumores durante a progressão patológica. Colectivamente, o nosso estudo revela que MPEM porto CSCs e progressão do tumor é devido à auto-renovação e diferenciação de CSCs.

Resultados

morfologicamente distintas populações de MPeMSCs que dividem assimetricamente ou simetricamente e expresso Stem marcadores de células

Entre as linhas de células estáveis ​​MPEM gerado, Meso-CL1 foi PTEN negativo

(neg), enquanto Meso-CL2 e Meso-CL3 foram PTEN expressar linhas celulares (Fig. S1). Embora todas as três linhas celulares MPEM gerado células estaminais com auto-renovação que se desprendem e flutuam na cultura antes do crescimento aderente, meso-CL1 tem a propensão para gerar xenoenxertos de tumores após a implantação subcutânea ou intraperitoneal em ratinhos imunocomprometidos e foi utilizada para gerar um modelo MPEM CSC . Geralmente, CSCs mamíferos formar vários agregados de colônias esferóides na cultura [20]; a formação de colónias foi limitado quando MPeMSCs foram cultivadas sob condições padrão de cultura de células aderentes. No entanto, a formação de esfera clonal foi activado quando as células foram cultivadas numa placa de Matrigel. Estudos de microscopia de luz identificaram duas populações morfologicamente distintas de CSCs na cultura MPEM; as células com ou sem um revestimento de encapsulagem exterior, ambos exibindo divisão assimétrica ou simétrica. Para demonstrar que as células isoladas manter as propriedades de células-tronco, foi realizada a primeira estudos de lapso de tempo em células vivas em cultura e imunofluorescência estudos em células fixadas em formol e descobriram que as células divididas tanto de forma assimétrica e simétrica (Fig. 1A, B). Em uma divisão assimétrica, células dividido desigualmente gerando uma grande pilha de haste e uma pequena célula geralmente denominado como a célula progenitora. experimentos pulse-chase BrdU utilizando o análogo de timidina demonstraram que durante a divisão celular assimétrica do ADN molde marcado com BrdU, depois de um tempo de pulso, exclusivamente segregados dentro da nova célula haste, ao passo que o ADN sintetizado de novo condensado no interior da célula de diferenciação. Além disso, também descobrimos que durante a divisão celular simétrica ambas as células filhas compartilharam o DNA modelo (Fig. 1C). Outra população morfologicamente distinta das CSCs foi identificado em cultura MPEM com um revestimento externo de encapsulamento que formado a partir das células parentais bolha semelhante como saliências escuras. As células recentemente formadas isoladas a partir da célula parental e flutuavam em cultura e as células ‘hatched’-fora a partir do revestimento externo para iniciar o crescimento. Devido à natureza flutuante dessas células, estudos de lapso de tempo foram infrutíferas; No entanto, as evidências microscopia de luz e fluorescentes sugerem que as células também divididos assimetricamente ou simetricamente (Fig. 2A). Conforme encontrado em outras linhas de células de cancro, também identificaram células aderentes multi-nucleadas grandes em cultura de células que produzem uma ou mais células estaminais tipicamente originadas a partir do núcleo, sem citocinese completa da célula parental (Fig. 2B).

(A) imagens de lapso de tempo de divisão celular assimétrica e simétrica em MPeMSCs. divisão celular assimétrica (setas) gera duas células desiguais (painel superior); divisão celular simétrico (setas) gera duas células idênticas (painel inferior). Tamanho da célula mostrada na uM. Hora (hora: minuto) anotada no canto inferior esquerdo. Barras de escala: 20 pm. (B) As imagens fluorescentes de assimétrica (painel superior) e simétrico (painel inferior) a divisão celular em MPeMSCs. coloração nuclear Hoechst mostra divisão assimétrica e simétrica de células. (C) o ADN é segregado durante a divisão celular de forma assimétrica (painel superior). As células são cultivadas em BrdU durante várias passagens (o período de impulsos) e depois de um tempo de pulso de BrdU é removido da cultura de células (a perseguição); retenção de BrdU nas células em divisão foi estudada utilizando o anticorpo anti-BrdU. Em uma divisão celular assimétrica, o molde de ADN marcado com BrdU segregados dentro da nova célula filha haste ao passo que o ADN recém-sintetizado sem rótulo BrdU condensada no interior da célula de diferenciação. Durante BrdU divisão celular simétrico ADN marcado aleatoriamente segregados dentro das células filhas (painel inferior).

(a) Formação de MPeMSCs com capsular cobertura e possível divisão de células estaminais assimétrica e simétrica. a, b, CSCs originam a partir das células parentais bolha semelhante como escuras saliências (setas). Células desanexar e flutuar na cultura e MPeMSCs ‘escotilha-out’ da cápsula (setas). C, a divisão celular em células estaminais assimétrica capsulares. Assimetricamente dividindo células originam a partir da cápsula (painel superior, setas) ou as células se dividem de forma desigual, juntamente com a cápsula gerando duas células não idênticas (painel inferior). d, divisão celular de forma simétrica, uma célula-tronco capsular. Barras de escala: 100 px. E, F, imagens fluorescentes de assimétrica (e), e a divisão celular (f) simétricas de células encapsuladas. As setas indicam a cobertura da cápsula externa da célula (B) uma, MPeMSCs originam a partir do núcleo de uma célula multinucleadas; a célula recém-formada move através do citoplasma e é libertado a partir da célula parental. b, origem de múltiplos CSCs de uma célula multinucleada. c, imagens fluorescentes de uma célula multinucleada.

Em seguida, determinar se os MPeMSCs isolados foram realmente derivada de células mesoteliais malignos parentais. Foi avaliada a expressão de um marcador conhecido mesotelioma, MSLN, e encontrada uma expressão forte do gene em ambas as células e MPeMSCs MPEM parental (Fig. 3A). As propriedades das células estaminais dos MPeMSCs isolados foram ainda determinado pela expressão de marcadores de células estaminais conhecidos, incluindo NANOG, SOX2, OCT4, c-myc e KLF4 (Fig. 3B). Curiosamente, o padrão de expressão de marcadores de células estaminais cedo foi semelhante em ambas as células progenitoras e MPeMSCs passo que c-myc foi significativamente maior em comparação com MPeMSCs células parentais. Por outro lado, o marcador de células estaminais pluripotentes, CD133 e marcadores de células estaminais endoteliais, CD31 e CD144, foram indetectáveis ​​em MPeMSCs (Fig. 3C).

(A), a expressão de ARNm relativa de mesotelina (MSLN) e (B) os genes marcadores de células-tronco em células MPEM parentais e em MPeMSCs. expressão de c-MYC foi significativamente maior (*

p Art 0,05) em MPeMSCs enquanto outros marcadores de células-tronco apresentaram padrão comparativamente similar de expressão em ambos os grupos. (C) A citometria de fluxo de avaliação de CD133 humano, CD31 e CD144 demonstrou que as proteínas não são expressos em MPeMSCs. diagramas de barras são expressos como média ± SEM.

Multiple Indução Lineage no MPeMSCs

multipotency é a marca registrada de células-tronco. No entanto, não foi conclusivamente demonstrado que os CSCs pode atingir vários destinos no momento da indução da linhagem. Para demonstrar a capacidade de MPeMSCs para atingir múltiplos destinos, CSCs foram cultivadas nas condições neuronais, vasculares e diferenciação adiposo. Quando MPeMSCs aderentes sub-confluentes foram tratadas com ácido trans-retinóico, seguido pela adição do meio de diferenciação neural, células diferenciadas em células neuronais semelhante e com a morfologia típica neuronal. e estudos de imagiologia de qPCR fluorescentes de expressão de ARNm mostraram que as células induzidas por linhagem neuronal expressa NES marcador de células estaminais neurais e uma TUBB3 marcador neuronal precoce; No entanto, BEX1 não mostrou nenhuma diferença significativa entre células diferenciadas e MPeMSCs neurais (Fig. 4A). As células estaminais neurais flutuantes derivadas das células neuronais diferenciadas foram recolhidas e cultivadas durante várias gerações para demonstrar a auto-renovação e muitas destas células exibido morfologias típicas neuronais.

(A) A diferenciação de células neuronais em MPeMSCs semelhante no meio de diferenciação neuronal (seta). A imunofluorescência e os estudos de expressão de ARNm relativa mostra que as células neuronais diferenciadas expressam a nestina marcador de células estaminais neurais e um marcador neuronal precoce βIII-tubulina (*

P

0,01). (B) a diferenciação endotelial de MPeMSCs em um formulário superfície Matrigel redes tubulares (setas). imagem fluorescente mostra que as células expressam o marcador endotelial de células-tronco, VEGFR2 e absorção de Dil-AcLDL por células endoteliais diferenciadas. Estudos de expressão de ARNm relativos demonstra que durante a diferenciação endotelial expressão VEGFR2 e VEGFR3 diminuiu significativamente (*

P

0,05) ao passo que as expressões de marcadores de células endoteliais, do vWF, VEGFA, VEGFC e IL-8 aumentou significativamente (*

p Art 0,001). (C) Um único MPeMSC formar uma esfera de colónias sobre uma superfície de Matrigel seguido por extensa proliferação de MPeMSCs. Escala de barras 100 px. (D) MPeMSCs diferenciadas em adipócitos (Red Oil) e (f) expressam marcadores adipócitos PPAR e FABP4 (*

p Art 0,01) em células adiposas diferenciado em relação aos controles. diagramas de barras estão expressos como média ± SEM; ND, não detectável.

A seguir, avaliou a capacidade dos MPeMSCs para formar células endoteliais. MPeMSCs expressar VEGFR2, um marcador de células progenitoras endoteliais. As células estaminais embrionárias positivos para formar VEGFR2 progenitores vasculares e transformar-se em vasos sanguíneos maduros [21]. Para estudar a diferenciação de MPeMSCs em linhagem endotelial, as células foram cultivadas em placas de cultura revestidas com componentes da matriz do porão-membrana (Matrigel). Em Matrigel, células induzida a diferenciação de células endoteliais e redes tubulares formados. estudos de expressão de genes em células endoteliais induzida por linhagem comparação com MPeMSCs revelou que VEGFR2 e expressão VEGFR3 foram significativamente reduzidos nas células durante a diferenciação endotelial ao passo que a expressão de vWF, e VEGFA VEGFC foram regulados positivamente em células de diferenciação. De igual modo, o factor pró-angiogénico, a IL-8 mostrou um aumento de 10 vezes durante a diferenciação de células endoteliais comparado com MPeMSCs. Para validar ainda a diferenciação endotelial, as células foram incubadas com a lipoproteína de baixa densidade, Dil-AcLDL, e encontrou captação de lipoproteínas pelas células endoteliais diferenciadas (Fig. 4B). No Matrigel MPeMSCs também formar esferas de colónias seguido pela proliferação extensiva de células (Fig. 4C). As células em proliferação gerar múltiplas esferas clonais em

in vitro de cultura de células

facilitar a rápida proliferação de células progenitoras endoteliais.

Para determinar se os MPeMSCs diferenciam em adipócitos, células foram expostas a ácido trans-retinóico seguido por meio de diferenciação adiposo e testado para a acumulação de lípidos neutros intracelular. depósitos de lípidos foram identificados em células diferenciadas adiposo. As células de controlo e diferenciadas foram ainda analisados ​​por marcadores adipócitos conhecidos usando qPCR e encontrou uma regulação positiva significativa de PPAR e FABP4 (Fig. 4D, F).

formação de tumores de MPeMSCs única célula

Nosso inicial estudos utilizando MPEM células parentais têm mostrado que a injecção de 3 × 10

6 células Meso-CL1 foram capazes de gerar ambos os tumores subcutâneos e intraperitoniais em murganhos imunocomprometidos Considerando Meso-CL2 e CL3 Meso-se não tumorigénicos. Nos ratos injectados por via subcutânea, células Meso-CL1 consistentemente gerado tumor primeira palpável no dia 30 após o transplante de células tumorais enquanto injeções semelhantes de MPeMSCs levou apenas 15 dias para desenvolver o primeiro tumor palpável. Por outro lado, o transplante de células induzida por linhagem neural mostrou palpação do tumor no dia 35, demonstrando que ambas as células progenitoras e células diferenciadas neurais tinha potencial tumorigénico semelhante. Estudos têm mostrado que a injecção de células tumorais suspensas em Matrigel têm frequências mais elevadas de formação de tumor [22]. Nosso

in vitro

estudos demonstraram que Matrigel promoveu a diferenciação endotelial e ativação de fatores angiogênicos em células endoteliais diferenciadas. Portanto, é possível que um pequeno número de MPeMSCs poderia gerar tumores dentro de um nicho endotelial. Para testar a significância da diferenciação de células endoteliais de MPeMSCs sobre o crescimento do tumor, foi realizada experiências de diluição limitante. Quinhentos células derivadas de uma única MPeMSC não seleccionada injectados com Matrigel gerados tumores palpáveis ​​em murganhos no dia 59 após o transplante de células tumorais ao passo que os ratinhos receberam um número igual de células suspensas em PBS não crescer os tumores durante um período de tempo de dois meses (Fig. 5A) indicando que a diferenciação endotelial de CSCs é fundamental para o crescimento do tumor. Para testar

In vivo

transdiferenciação de células endoteliais derivadas de MPeMSCs, tumores precoces derivados a partir de células endoteliais da linhagem dirigida-co-injectados com Matrigel foram analisados ​​para a expressão de NES e TUBB3 e descobriram que as células expressam ambas as proteínas neuronais ( a Fig. 5B).

(a) as células parentais a partir dos quais MPeMSCs derivados foram injectados por via subcutânea (n = 8) no flanco direito de ratinhos nus atímicos (nu /nu). Primeiro tumor apareceu palpáveis ​​no dia 30 após a injecção das células tumorais. injeções semelhantes de MPeMSCs (n = 8) gerado tumores palpáveis ​​no dia 15 (tumores em estágio final são mostrados). Em experiências de diluição limitante, as células derivadas de uma única MPeMSC foram divididos e produzidas quer numa placa de Matrigel para induzir a diferenciação endotelial ou em uma placa normal de cultura de células com meio contendo LIF. Quinhentos células dissociadas a partir do primeiro grupo foram novamente suspensas em Matrigel e injectado por via subcutânea (n = 8). Os tumores foram encontrados pela primeira vez por palpação no dia 59 (murganhos com 60 dias de crescimento do tumor após a palpação do tumor são mostradas), enquanto que as injecções semelhantes de MPeMSCs (n = 10) foram ressuspensas em PBS não gerar tumores. (B) hematoxilina e eosina (H E) A coloração por imunofluorescência e de tecidos tumorais. Os primeiros tumores gerados a partir de células endoteliais induzida por linhagem expressam marcadores neuronais; NES e TUBB3.

Discussão

O achado importante deste estudo é a identificação dos CSCs com divisão de células-tronco assimétrica característica e tumorigenicidade em tumores MPEM humanos. Até à data CSC marcadores têm sido amplamente utilizados para identificar e isolar células estaminais a partir de tumores. No entanto, nenhum marcador de células-tronco tem sido provado ser um marcador universal para CSCs. cultura definida de MPeMSCs derivadas de tumores de pacientes promovido auto-renovação, a formação de colónias e diferenciação multilinhagens confirmando um fenótipo de células-tronco. A característica distintiva da MPeMSCs mais outra CSCs é que as células clonais raramente formam esferas na cultura celular aderente regular e, por conseguinte, o padrão de divisão de célula individual pode ser visualizado por microscopia, que ajuda a identificar e isolar os CSCs. divisão celular assimétrica é característico das células estaminais embrionárias e os nossos estudos de intervalo de tempo mostraram que MPeMSCs dividir assimetricamente e as células filhas herdar componentes citoplasmáticos distintas [23] para formar células estaminais e células de diferenciação. Esta observação foi mais suportada pelo procedimento de marcação com BrdU de pulso-chase e descobriram que o DNA modelo retém dentro da célula filha haste. Além disso, encontramos a divisão celular simétrica em MPeMSCs gerando células com tamanhos aproximadamente iguais. Para além destas características divisões de células estaminais, MPeMSCs mostram um mecanismo diferente para proliferação de células estaminais através da geração de células encapsuladas dentro de uma cobertura exterior membranoso. Estas células normalmente flutuar na cultura, e exibir tanto divisão assimétrica e simétrica. A importância da formação de células-tronco capsular precisa ser mais investigada. É possível que a formação de tais células encapsuladas é nicho homeostase dependente e que permite que os CSCs a proliferar rapidamente e sobreviver em condições adversas de nicho. As características morfológicas únicas destas células também podem ser utilizados para identificar os CSCs

In vitro

. Os MPeMSCs derivados mostrar expressão significativa do MSLN, um marcador de destaque para o mesotelioma [24] indicando que CSCs originado das células de mesotelioma parentais. Os marcadores de células estaminais testadas em ambas as células progenitoras e MPeMSCs mostrar semelhanças na sua expressão, excepto para o oncogene MYC, e esta consistência na expressão genética indica que as células parentais também têm potencial para a desdiferenciação [5]. A oncoproteína MYC que é activado em vários tipos de tumores [25] é significativamente regulada positivamente em MPeMSCs; MYC gene é importante para a proliferação de células estaminais e pela manutenção de propriedades pluripotentes de células estaminais [26], [27].

relatórios recentes sobre células estaminais semelhantes derivadas de glioblastoma sugerem que CSCs diferenciar-se em células endoteliais durante crescimento do tumor [28], [29]. Para confirmar ainda mais a presença do fenótipo de células-tronco em MPEM, testamos multipotency de MPeMSCs crescente por eles em várias condições de diferenciação. As células foram primeiro cultivadas em condições de diferenciação neuronal minimizado de soro e descobriram que MPeMSCs diferenciadas em células com morfologia neuronal típico e expressa marcadores neuronais. Foram identificados NES como um importante marcador de células estaminais neuronais em MPeMSCs e a sua expressão foi também encontrada em tumores de xenoenxerto, indicando que a diferenciação neuronal de células endoteliais é possível, durante o crescimento do tumor. Do mesmo modo, a célula estaminal expressão do marcador de VEGFR2 endotelial também foi marcadamente elevada em MPeMSCs; em uma matriz de células de nicho diferenciadas em células endoteliais [9] com as redes tubulares típicos sugerindo MPeMSCs são intrinsecamente programado para diferenciação endotelial. Esta contribuição directa de MPeMSCs para a vasculatura do tumor pode ser importante para o crescimento do tumor e rápida difusa encontrada em pacientes MPEM. As células estaminais neurais são ectodérmica de origem enquanto que as células endoteliais são originários da mesoderme. No entanto, as células endoteliais como pode ser derivado a partir de células estaminais neurais [30]. Nos nossos estudos (dados não publicados) quando as células neurais diferenciadas foram semeadas numa placa de Matrigel, células diferenciadas em células endoteliais com redes tubulares típicos, indicando a transdiferenciação de células de linhagem comprometida-. Tem sido relatado que células endoteliais transdiferenciam em células mesenquimatosas para induzir propriedades estaminais semelhante [31]. Os estudos clínicos demonstraram que os benefícios de terapia anti-angiogénica para o cancro são limitados e em muitos casos, as terapias anti-angiogénicas resultar numa resposta inicial seguida de recidiva tumoral [32]. Neste contexto de diferenciação vascular CSCs que residem dentro dos tumores podem ter um papel central na reposição de células endoteliais rapidamente.

Nenhum estudo até agora tem destinatários que um tipo particular de célula inicia o crescimento de tumores em pacientes. Nossos estudos iniciais utilizando xenotransplante de leucemia fator inibidor (LIF) MPeMSCs indiferenciadas tratados mostraram uma indução do tumor no início de ratos que provam que MPeMSCs são tumorigénico. Embora MPeMSCs não formam esferas de colónias em cultura de células aderentes, a cultura de células isoladas de uma placa de matriz de esferas de colónias gerada mostrando o fenótipo de células estaminais derivadas das células. No presente estudo, nós geramos um modelo de tumor de CSC usando um número limitado de células proliferaram de um único MPeMSC. Os dados deste estudo, quando visto em conjunto com

in vitro

evidências suportam um modelo onde MPeMSCs novamente suspensas em Matrigel promover o crescimento do tumor agressivo, principalmente, devido à diferenciação endotelial de CSCs porque todos os camundongos injetados desenvolvido tumores palpáveis ​​aproximadamente 60 dias de tumor injecção das células. Por outro lado, a palpação do tumor não era evidente em ratos injectados com MPeMSCs indiferenciadas ressuspensas em PBS. Embora as células com potencial tumorigénico são igualmente distribuídos em dois grupos, os componentes da matriz promoveu a formação de colónias ea rápida indução da linhagem endotelial. Em tumores de células endoteliais ou dedifferentiate transdifferentiate para formar mais células-tronco como ou outros tipos de células distintos que podem contribuir para um crescimento do tumor mais cedo. Tem sido mostrado que o microambiente circundante a neovasculatura de tumores é altamente proliferativo e CSCs foram encontradas em estreita proximidade com as células endoteliais [33]. Juntos, os nossos dados sugerem que multipotência e plasticidade de MPeMSCs pode ser um factor que contribui para o crescimento do tumor em pacientes MPEM. Uma análise mais aprofundada dos fatores associados à proliferação CSC e diferenciação da linhagem pode fornecer importantes insights sobre o desenvolvimento da MPEM e pode fornecer uma base para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas mais eficazes.

Materiais e Métodos

celular linhas, cultura de células e Isolamento de MPeMSCs

MPEM linhas celulares (Meso-CL1, Meso-CL2 e Meso-CL3) foram derivadas de tumores MPEM humanos recolhidos no conselho de revisão instituição aprovou protocolos do Instituto Nacional do Câncer e informado obteve-se o consentimento de todos os pacientes para a utilização de amostras de tumores, incluindo a geração de linhas de células [15]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (RPMI; Gibco) suplementado com 10% v /v de FBS (Atlanta Biologicals), sob condições padrão de cultura de células numa atmosfera humidificada de 5% incubadora de CO2 a 37 ° C. As células foram confirmados como mesotelioma por imuno-histoquímica de marcadores de mesotelioma conhecidos e por microscopia eletrônica e foram caracterizados por

in vitro

características de crescimento e

in vivo

crescimento xenotransplante. Embora todas as três linhas celulares MPEM gerado células estaminais flutuantes, meso-CL1, PTEN

A linha de células (neg) com potencial para gerar tumores tanto subcutânea e intraperitoneal em ratinhos atímicos nus (nu /nu) foi utilizado para o estudo. Nós activado geração de células estaminais em células MPEM semeando-os a uma densidade sub-confluente para minimizar ancoragem célula-a-célula em 5% v /v de FBS-RPMI (meio de soro reduzido). Sob estas condições os MPeMSCs presentes na população celular parental gerar células estaminais que foram em seguida recolhidas e cultivadas na presença de LIF para mantê-las num estado indiferenciado flutuante. Os MPeMSCs flutuantes recolhidos a partir do LIF tratada de cultura de células foi utilizado para as experiências subsequentes. Para todos os experimentos MPeMSCs foram cultivadas na ausência de LIF salvo indicação em contrário.

Curto-Time Imagens ao vivo de células e imunofluorescência

Para determinar que as células flutuantes isolados foram CSCs, que estudou primeiramente com células-tronco divisão em células vivas por estudos de lapso de tempo por meio de microscopia (Olympus IX71); imagens foram capturadas usando software cellSens. Para imunof luorescência, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente, e depois tratou-se com 0,2% de Triton X-100 (Sigma) em PBS durante 10 minutos, excepto para a detecção de proteínas da superfície celular. As células foram lavadas, com PBS e bloqueadas com BSA a 5% em PBS contendo 0,25% de NP-40 durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram então incubadas com qualquer um dos seguintes anticorpos primários: Alexa Fluor conjugado monoclonal anti-α-tubulina (1:1000; Millipore), conjugados com Alexa Fluor faloidina (1:1000; Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000; Sigma) , anti-nestina (anti-NES, 1:250; Millipore), anti-βIII-tubulina (anti-TUBB3; 1:1000; Covance), receptor do factor de crescimento endotelial anti-vascular (anti-VEGFR) 2 (1:200 ; Cell Signaling), anti-CD133 /1-aloficocianina (APC, 1:100; Miltenyi Biotech). Foram utilizados os seguintes anticorpos secundários a partir de Molecular Probes (Invitrogen): Alexa Fluor rato conjugado ou anticorpo de coelho anti-IgG (1:1000). anticorpos secundários sozinho ou IgG1 serviu como controle para ligação não especifica. As imagens foram capturadas usando Olympus CKX41 microscópio de fluorescência equipado com câmera digital F-View II CCD ou usar Olympus 1 × 81 microscópio com um scanner a laser confocal Fluoview-1000.

marcação BrdU e Chase

para determinar adicionalmente a divisão celular assimétrica em MPeMSCs, procurou-se testar a segregação do ADN molde durante a divisão celular mitótica utilizando 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) pulse-chase [34]. Resumidamente, MPeMSCs foram tratadas com 1 uM de BrdU (Sigma) durante várias passagens para assegurar que as cadeias de ADN foram marcadas com BrdU na grande maioria das células. Depois de um tempo de pulso de BrdU foram removidas a partir da cultura de células e foram examinados para o padrão de marcação de BrdU durante a divisão celular. As células foram fixadas em etanol a 70% e incubou-se em HCl 2N contendo 0,5% de Triton X-100 durante 1 h. e bloqueadas com BSA a 5% contendo 0,25% de NP-40. As células foram lavadas e incubadas com anticorpo anti-BrdU-FITC (BD Biosciences) durante a noite a 4 ° C, lavadas e contra-coradas com DAPI. padrão de marcação BrdU em células foram vistos usando Olympus 1 × 81 microscópio com um scanner a laser confocal Fluoview-1000.

RNA Preparação, em tempo real PCR quantitativo e Western Blotting

O RNA total foi extraído de células utilizando Trizol (Invitrogen) e pré-tratadas com DNase. Um total de 1 ug de ARN foi transcrito de forma reversa em cDNA com Transcriptase Reversa III (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.