Abstract

Fundo

O glicogênio sintase quinase 3 beta (GSK3β) está envolvido centralmente em diversos processos celulares, incluindo a proliferação e apoptose. Este estudo teve como objetivo investigar a influência de expressão GSK3β no prognóstico do câncer de pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) e os efeitos da inibição GSK3β em linhas celulares de NSCLC.

Métodos

imuno-histoquímica e os ensaios western blot foram utilizados para avaliar o nível de expressão em tecidos GSK3β NSCLC humanas. interferência de ARN de Lentivirus foi realizada para inibir a expressão de GSK3β no A549, H292, H1299 e SK-MES-1 linhas celulares. sobrevivência celular, apoptose e motilidade foram avaliadas

in vivo

e

in vitro

.

Resultados

Os níveis de GSK3β foram maiores nos tecidos NSCLC (n = 211) do que em tecidos de controlo (n = 194) (

P

0,001). A análise de acompanhamento de 5 anos mostraram que a expressão GSK3β positivo foi indicativo de mau prognóstico (

P

= 0,006). Além disso, knockdown de GSK3β em linhas celulares de NSCLC suprimiu a proliferação de células, células tumorais preso na fase G0 /G1, a apoptose induzida e reduzida motilidade celular. Um modelo de xenoenxerto mostrou que a desregulação de GSK3β atenuada tumorigénese, tal como confirmado por proliferação celular reduzida com base em Ki-67 e aumentou significativamente a morte celular por apoptose. A inibição da GSK3β teve efeitos inconsistentes sobre a expressão de β-catenina, dependendo do tipo de célula examinadas.

Conclusão

expressão aberrante de GSK3β serve como um marcador independente de mau prognóstico para NSCLC. A inibição de tumorigénese por GSK3β suprimida atenuar a proliferação de células, aumentando a apoptose e a motilidade celular imobilizar. Estes resultados identificam GSK3β como um promotor tumoral e um potencial alvo terapêutico em NSCLC

citação:. Zeng J, Liu D, Qiu Z, Huang Y, Chen B, Wang L, et ai. (2014) GSK3β superexpressão Indica mau prognóstico e sua inibição reduz a proliferação celular e sobrevivência de não-pequenas células do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10.1371 /journal.pone.0091231

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de setembro de 2013; Aceito: 10 de fevereiro de 2014; Publicação: 11 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zeng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Nature Science Foundation da China (81201851 para Dan Liu e 81641028 para Weimin Li). O site da National Nature Science Foundation da China é https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão tem sido a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo durante décadas [1]. Na China, o número de casos e de mortes relacionadas ao câncer de pulmão cancro do pulmão têm aumentado com o aumento dos níveis de abuso de cigarro e poluição [2]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que inclui principalmente adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular, é responsável por quase 85% dos cancros do pulmão. Apesar de novas abordagens terapêuticas foram introduzidas, a maioria dos pacientes ainda são diagnosticados em estágios avançados, ea taxa de sobrevida em 5 anos permanece inferior a 15% [1]. Para melhorar o resultado e qualidade de vida de pacientes com NSCLC, muitos estudos recentes têm-se centrado na busca de novos alvos terapêuticos e identificação de biomarcadores para facilitar o tratamento individualizado [3].

O glicogênio sintase quinase 3 beta (GSK3β) é um cinase de proteína serina /treonina multifuncional que foi originalmente isolado a partir de músculo esquelético de coelho [4]. Em condições de repouso, GSK3β é constitutivamente activa devido a tirosina-216 fosforilação, e que fosforila e inibe a um grupo diverso de substratos pró-oncogénicos, tais como β-catenina, ciclina D1, c-Jun, c-Myc e CREB. Por sua vez, a fosforilação de serina-9 inactiva GSK3β [5] – [7]. Com base nessas funções, GSK3β é um potencial supressor de tumor, e a inactivação de GSK3β tem sido relatada em muitas células cancerosas [8], [9]. No entanto, diversos estudos demonstraram que GSK3β pode regular positivamente a proliferação e apoptose das células tumorais [10] – [18]. Além disso, estudos têm demonstrado que a inibição da GSK3β atenua a sobrevivência e a proliferação e induz a apoptose em diversos tipos de cancros, tais como cancro pancreático [11], cancro colorrectal [12], [15] e do cancro da bexiga [18]. No entanto, o papel de GSK3β difere em diferentes tipos de câncer [19], e o papel preciso da GSK3β em NSCLC permanece obscuro.

Neste estudo, nós exploramos a expressão de GSK3β em tecidos NSCLC humanas e seu significado prognóstico. No H292, H1299, SK-MES-1 e A549 linhas de células NSCLC, expressão GSK3β foi inibida por pequenas RNA hairpin (shRNA) transferidos pelo vetor de lentivírus. linhas de células knockdown estáveis ​​foram verificados e utilizados em pesquisas futuras. Tumorigênese, proliferação, apoptose e migração de células também foram avaliadas tanto

in vivo

e

in vitro

, e os resultados demonstraram que a expressão aberrante de GSK3β serviu como um indicador independente de mau prognóstico para NSCLC. Além disso, a inibição da GSK3β por interferência de ARN suprimida tumorigénese atenuando a proliferação de células, aumentando a apoptose e supressão de invasão de células. Juntos, estes resultados identificam GSK3β como promotor de tumor e um potencial alvo terapêutico para NSCLC.

Materiais e Métodos

1. Pacientes e

coleta de tecido

ressecado cirurgicamente tecidos NSCLC (n = 211) e espécimes de pulmão normal adjacente aos tecidos de tumor (n = 194) foram obtidos a partir Hospital China Ocidental, Universidade de Sichuan. Nenhum dos pacientes tinham sido tratados com qualquer quimioterapia pré-operatória ou radioterapia. informações de acompanhamento estava disponível para 160 casos. As etapas patológicas foram determinados de acordo com a União Internacional Contra o Câncer (UICC) tumor-nódulo-metástase (TNM) sistema de classificação de tumores malignos. Para explorar ainda mais, o grau de diferenciação e tipo histológico foi determinada de acordo com a classificação da Organização Mundial da Saúde para NSCLC. Após a ressecção cirúrgica, todos os pacientes receberam terapias padrão de acordo com as diretrizes de prática clínica 2004 NCCN em Oncologia para NSCLC. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente e avaliação institucional aprovação do conselho deste estudo foi obtido a partir Hospital China Ocidental, Universidade de Sichuan.

2. Estável silenciamento de gene utilizando ARN interferente pequeno mediada pelo vector lentiviral

O pulmão humano NSCLC linhas celulares A549, H292, H1299 e SK-MES-1, que foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC), foram cultivadas de acordo com os protocolos ATCC

Sequências (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) visando GSK3β (GenBank: NM_002093). que foram projetados usando o Designer BLOCK-iT interferência de RNA (RNAi) (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram selecionados. Uma sequência relacionada com o gene GSK3β (TTCTCCGAACGTGTCACGT) foi concebido como um controlo negativo (CN) [20]. O vector lentiviral pGCSIL-GFP foi comprado de GeneChem e NeuronBiotech Corp (Xangai, China). A proteína fluorescente verde (GFP) foi utilizada como marcador para observar e classificar essas células de tumor transfectadas com células activadas por fluorescência (FACS). Os efeitos de interferência de RNA foram avaliados por RT-PCR (no 5

th dias após a transfecção) e Western Blotting (no 7

th dias após a transfecção). Em seguida, as linhas celulares de NSCLC com gene estável e sustentado GSK3β derrubar foram obtidos para mais

in vivo Comprar e

in vitro

estudos. As células infectadas com o lentivírus que entregue a sequência de direccionamento de GSK3 foram nomeados como o grupo knock down (grupo KD). Da mesma forma, as células que contêm a sequência NC entregues por lentivírus foram nomeados como o grupo NC; e essas células tumorais não infectadas por lentivírus foram usadas como um controlo normal e nomeado como o (grupo CON) grupo de controlo.

3. Tumorigénese em ratinhos xenoenxertados

ratinhos

nu (BALB /c-nu /nu, n = 6 para cada grupo, números iguais de machos e fêmeas, 6-8 semanas de idade) foram fornecidos pelo Central Animal Laboratory de Sichuan Universidade. Os ratos foram alojados em cabines de fluxo laminar em condições livres de patógenos específicos e alimentados ad libitum. Todos os estudos envolvendo ratos foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Aprovação para este estudo foi dada pelo Comité de Assistência e Tratamento Institucional animal da Universidade de Sichuan.

Após o tratamento com vírus diferentes, crescimento exponencial células A549 foram injectadas subcutaneamente nas costas de ratinhos Balb /c nu (1 × 10

6 /ml cada). Os volumes dos tumores foram avaliados a cada 3 dias de acordo com a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = d

2 × D × 0,52. Quatro semanas após a implantação do tumor, os ratos foram sacrificados sem dor. Seus órgãos foram examinados para a evidência bruta de alterações anatômicas.

4. Os ensaios de proliferação celular

A contagem celular Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Rockville, EUA) foi utilizado para avaliar a proliferação celular de acordo com o protocolo do fabricante. As células tumorais (2 x 10

3 por poço) foram semeadas em placas de cultura de 96 poços, e tratou-se com 10% de FBS e incubou-se a 37 ° C. A densidade óptica a 450 nm foi medida a 24, 48, 72, 96 e 120 h após a transfecção do vírus. Os dados apresentados são representativos de 3 experiências independentes e estão apresentados como a média ± S.D.

5. Análise do ciclo celular

Setenta e duas horas após a transfecção, os dados do ciclo celular foram obtidas por meio da análise de células marcadas com PI utilizando células activadas por fluorescência (FACS) com um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA ). Para cada amostra, pelo menos, 3 × 10

5 as células foram contadas, e os dados foram analisados ​​com o software CellQuest BD. Os dados apresentados são representativos de 3 experiências independentes e estão apresentados como a média ± S.D.

6. análise apoptose

As células de tumor (cerca de 5 × 10

5) foram coradas com 5 jil de anexina V-APC e 7AAD (KeyGen, Nanjing, China) à temperatura ambiente e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo a 1 h. A Anexina V (+) /7AAD (-). As células foram considerados como células apoptóticas

O método de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit AP, Roche, Suíça) foi utilizado para determinar o nível de apoptose em xenoenxerto tecidos tumorais. As células apoptóticas foram detectadas utilizando fosfatase alcalina e coradas a vermelho. Para cada tumor, as células apoptóticas em 5 campos aleatórios de alta potência foram contadas, e a taxa de apoptose foi calculada com a seguinte fórmula:

a taxa de apoptose = número de células apoptóticas /número total de células contadas x 100 tumorais %.

7. extração de RNA e PCR em tempo real

Os iniciadores para GSK3β humano eram 5′-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 ‘(sentido) e 5′-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3′ (anti-sentido); e aqueles para GAPDH foram 5’-CCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘(sentido) e 5′-ATGAGTCCTTCCACGATAC -3’ (anti-sentido). Os iniciadores e as sondas foram adquiridos a GeneChem, Xangai, China. Os níveis de expressão de mRNA foram quantificados em triplicado por em tempo real de RT-PCR utilizando um termociclador 2720 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Os níveis relativos de transcritos alvo foram quantificadas usando o método 2 (-Delta Delta Ct) [21] e normalizados para o nível de transcritos de GAPDH humano.

8. Celular invasão ensaio

O celular Invasion Assay Kit (ECM550, Chemicon, Califórnia, EUA) foi utilizado para avaliar a capacidade de invasão celular. Após a transfecção do vírus, uma alíquota da suspensão de células preparada (300? L, 1,0 × 10

6 células /ml) foram adicionados a cada inserção superior. Após 48 h de incubação, as pastilhas foram mergulhados em solução de coloração, durante 20 minutos para corar as células invasivas sobre a membrana. Em seguida, as células invasivas em 5 vistas aleatórias do microscópio foram contadas. Os dados apresentados são representativos de 3 experiências independentes e estão apresentados como a média ± S.D.

9. análise de Western blot

As proteínas totais foram extraídas de tecidos tumorais NSCLC e transfectadas células cultivadas e, em seguida qualificado usando um kit de extração de proteínas (Keygen, Nanjing, China) e o reagente de Ensaio BCA Protein (Thermo Scientific, Rockford, EUA) . As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas por imunotransferência com anticorpos específicos para GSK3β (# 9315, diluída de 1: 400) e β-catenina (# 9582, diluída de 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, EUA). Depois de exposição a um substrato quimioluminescente HRP (Millipore, Billerica, EUA), as proteínas alvo foram detectadas utilizando um sistema de ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Filadélfia, EUA), e as imagens foram analisadas com Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics ).

10. Imuno-ensaio

GSK3β em tecidos de tumores NSCLC e os tecidos normais adjacentes foi imuno-histoquimicamente coradas como descrito nos nossos estudos anteriores [22] – [24]. avaliação semiquantitativa das secções foi efectuada por patologistas 2 de uma maneira cega. O controlo negativo para a imunocoloração foi realizada sem anticorpo primário. Tanto a fracção e a intensidade das células tumorais foram considerados imunocoradas. A pontuação fracção foi calculada como a média de 5 campos de alta potência seleccionados aleatoriamente avaliada por microscopia de luz como se segue: 0, não há células alvo de tumor (coradas, dos brônquios ou células alveolares); 1, 20% de células coradas; 2, 20~50% de células coradas; e 3, mais de 50% de células coradas. A pontuação da intensidade foi definida como se segue: 0, sem coloração apreciável das células-alvo; 1, a coloração quase não detectável no citoplasma e /ou núcleo das células alvo; 2, coloração castanha prontamente aparente; e 3, de coloração marrom escuro. As pontuações de fração e intensidade foram multiplicados para dar uma pontuação total que varia de 0 a 9. Os resultados entre 2 e 9 foram considerados como expressão positiva. Os ensaios de imuno-histoquímicos foram também realizada em secções histológicas de tumores de xenoenxerto embebidos em parafina.

Coloração do marcador proliferativa Ki-67 foi realizada para avaliar o crescimento dos tumores de xenoenxerto. foi obtido a partir de Thermo Fisher Scientific, Rockford, EUA: O anticorpo Ki-67 (100 # MA1-80199, diluída 1). O Ki-67 O índice de marcação (LI Ki-67) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

Ki-67 LI = número de células positivas Ki-67 /número total de células contadas tumorais × 100%

11. A análise estatística

SPSS 17.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA) foi utilizado para todas as análises de dados. Os resultados de imunohistoquímica e suas associações com características clínicas foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. teste de Spearman foi utilizado para analisar a correlação entre diferentes fenótipos proteicos. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para analisar a sobrevida univariada, e as comparações das distribuições de sobrevivência entre os grupos foram realizadas pelo teste de log-rank. O significado prognóstico da expressão GSK3β com relação a outras variáveis ​​patológicas foi avaliada utilizando análise de regressão de Cox multivariada. Os dados quantitativos são expressos como a média ± S.D. A significância estatística das diferenças entre os grupos foi determinada por ANOVA de uma via seguido por teste post-hoc PLSD de Fisher. Todos

P valores

foram 2 de cauda, ​​e os valores de

P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

1. GSK3β é regulada positivamente em tecidos de tumor de NSCLC

Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica em tecidos de GSK3β NSCLC e os correspondentes tecidos normais são mostrados na Figura 1A. GSK3β foi proeminentemente expresso em NSCLC (N = 211), principalmente no citoplasma das células tumorais. As comparações dos níveis de proteína GSK3β entre o tumor e os tecidos pulmonares normais são mostrados na Tabela 1. Os resultados demonstraram que o nível GSK3β foi significativamente aumentada em tecidos em comparação com NSCLC os tecidos pulmonares normais (

P

0,001). Os ensaios de transferência Western também confirmou que o nível de expressão de GSK3β em tumores era maior do que nos seus equivalentes normais. (

P

= 0,04, Figura 1B).

(A) típicos de coloração IHC imagens de tumores NSCLC humana e tecido pulmonar normal (ampliação de × 200). (B) Os ensaios de transferência Western confirmou que em tecidos normais /tumorais emparelhados de doentes de cancro NSCLC, os níveis de expressão mais elevados de GSK3β em tumores foram encontrados em comparação com as suas contrapartidas normais. As experiências foram repetidas 3 vezes, e os dados são apresentados como a média ± DP. *

P Art 0,001. (C) glicogênio sintase fosforilada (PGS), um substrato de GSK3β, foi detectado nestas linhas de células NSCLC, exceto para H292.

Como um substrato de GSK3β, a expressão da proteína fosforilada glicogénio-sintase (PGs) foi utilizada para indicar a actividade de GSK3β. Nestas linhas 4 celulares, exceto em H292 PGS, foi detectada (Fig 1C), que sugeriu alta atividade de GSK3β no cancro do pulmão humano.

2. A expressão positiva da GSK3β está associada com mau prognóstico para o NSCLC

Os pacientes com informação clínica completa (160 casos, 39 mulheres e 121 homens, 61,19 ± 10,53 anos) foram incluídos na análise de sobrevivência. A idade média foi de 60,00 anos (variação de 29 a 83 anos). As características clínicas e resultados de análises de sobrevivência estão resumidos na Tabela 2 e Figura 2. A taxa de sobrevida em 5 anos para todo o grupo foi 49,07%, ea mediana do tempo de seguimento foi de 58,00 meses (variação de 0 a 77,67 meses).

(a) Em todo o grupo, os pacientes com expressão positiva GSK3β teve tempo de sobrevivência mais curtos,

P

= 0,006. Figura 2B-D mostra a análise de sobrevivência para os subgrupos. (B) No subgrupo menor diferenciação, os pacientes com expressão positiva GSK3β teve tempo de sobrevivência significativamente mais curtos,

P

= 0,013. (C) No T2 T1 + subgrupo, doentes com expressão GSK3β positiva teve tempo de sobrevivência significativamente mais curtos,

P

= 0,003. (D) No subgrupo N0 + N1, os pacientes com expressão positiva GSK3β teve tempo de sobrevivência significativamente mais curtos,

P

= 0,010. (E) Os pacientes do subgrupo M0 com expressão GSK3β positiva teve tempo de sobrevivência significativamente mais curtos,

P

= 0,008. As curvas de Kaplan-Meier para as proteínas investigadas foram usados ​​para comparar o positivo (

linhas tracejadas

) e fenótipos negativos (

linhas sólidas

).

foi realizada análise univariada para estimar a relação entre as características clínicas e expressão GSK3β. Como mostrado na Tabela 2, os pacientes com NSCLC com características clínicas diferentes, tais como sexo, idade, tipo histológico e fase do tumor-nódulo-metástase (TNM), demonstraram níveis semelhantes de GSK3β. O significado prognóstico da expressão positiva GSK3β em diferentes subgrupos foi avaliada usando o teste de log rank. Em todo o grupo, os pacientes com expressão positiva GSK3β teve tempo de sobrevivência mais curtos (

P

= 0,006, Figura 2A). Os resultados também indicaram que o sexo masculino, idade avançada e câncer de células escamosas (SCC) com expressão GSK3β positivos foram associados com pior prognóstico (

P

= 0,019,

P = 0,020

e

P

= 0,002, respectivamente). Além disso, pacientes com NSCLC com tumores pouco diferenciados ou nos subgrupos fase relativamente precoce (T1 + T2, N0 + N1 e M0) com expressão GSK3β positiva teve tempo de sobrevivência significativamente menor (

P

= 0,013,

P

= 0,003,

P = 0,010

e

P

= 0,008, respectivamente;. mostrado na Figura 2B-e)

Além disso, a análise de regressão multivariada de Cox revelou que , neste grupo, o tamanho do tumor, invasão linfonodal e expressão GSK3β foram preditores independentes de NSCLC prognóstico. Estes resultados sugerem que GSK3β desempenha um papel importante no NSCLC tumorigênese e solicitado uma análise mais aprofundada.

3. GSK3β regula positivamente a proliferação de células de tumor e a sobrevivência em NSCLC

Um vector lentiviral que foi usada para transferir shRNAs concebidos de segmentação GSK3β para estas linhas de células NSCLC 4 persistentemente silenciar a sua expressão. Os efeitos de interferência de RNA foram avaliados por RT-PCR (5 dias após a transfecção) e Western blotting (7 dias após a transfecção). Estes resultados demonstraram que os níveis de RNA e de proteína de GSK3β em células de tumor a partir de todas as 4 linhas celulares examinadas foram significativamente reduzidas, tal como mostrado na Figura 3A-B (todas

P

0,001). Além disso, os tecidos de xenoenxertos isolados a partir de ratinhos nus foram imuno-histoquimicamente manchadas, e os resultados verificados a redução estável sustentada dos níveis GSK3β após a interferência de ARN (Figura 3C). Estes resultados indicaram que GSK3β foi eficientemente e de forma estável derrubado por o shRNA em todas as 4 linhas celulares de NSCLC.

(A) shRNAs GSK3β-específicos foram transfectados em células NSCLC com um vector lentiviral, e as células foram colhidas e contadas 5 dias após a transfecção. PCR em tempo real indicaram que a interferência por shRNA efetivamente derrubou a expressão de mRNA de GSK3β em células NSCLC. (B) As células foram colhidas e contadas 7 dias após a transfecção. Western blot mostra a eficiência de silenciamento proteína por shRNA. (C) após o tratamento com a GSK3 shRNA (grupo KD), o controlo negativo shRNA (grupo CN) ou salina (grupo CON) normal, as células A549 (1 × 10

6 /ml) foram injectadas nas costas de ratinhos nus. Quatro semanas mais tarde, os tumores de xenoenxerto foram isoladas e coradas imuno-histoquímica. Os resultados verificados os níveis reduzidos sustentados de GSK3β no grupo KD em relação aos grupos de controlo. As setas indicam a coloração positiva no citoplasma das células tumorais (ampliação de × 400). As experiências foram repetidas 3 vezes, e os dados são expressos como a média ± DP. *

P

. 0,001

O ensaio de CCK-8 demonstrou que o knockdown de GSK3β suprimida claramente a viabilidade de todas as linhas de células 4 (todo o

P

0,001, Figura 4A). Na

in vivo

estudo com ratos de xenotransplante, os tumores no grupo KD cresceu significativamente mais lentamente e tinham volumes tumorais mais baixos durante todo o período de 4 semanas (

P

= 0,001, Figura 4B ). No final do período de observação, os pesos dos xenoenxertos do grupo de KD foram muito menores do que aqueles para os grupos de controlo (

P

= 0,001, Figura 4C). Além disso, o Ki-67 LI dos xenoenxertos foi drasticamente reduzida no grupo de KD em comparação com os dos grupos de NC e CON (38,98% vs 75,14% vs 73,84%,

P

0,001, Figura 4D), que indicaram que a regulação negativa da GSK3β inibiu a proliferação de células

in vivo

. Estes resultados sugerem que GSK3β regula positivamente o crescimento e a tumorigénese de células NSCLC, e nós próxima procurou tratar como estes efeitos fossem mediados.

(A) O ensaio CCK-8 mostrou que a inibição de GSK3β suprimiu a proliferação das linhas de células NSCLC

in vitro

. *

P Art 0,001. (B)

In vivo

: Tal como descrito na Figura 3C, os modelos de xenoenxerto foram desenvolvidos em ratinhos nus. Cada grupo consistia de 6 animais. Os tumores foram observados a cada 3 dias durante 4 semanas. Os tumores de xenoenxerto de murganhos no grupo KD cresceu significativamente mais lento (como determinado pelo volume do tumor) ao longo de todo o período de observação. *

P Art 0,001. (C) Comparação dos tumores de xenoenxertos isolados. A imagem mostra que os tumores isoladas a partir do grupo KD eram menores e mais leves do que os tumores do grupo de controlo. Os dados são expressos como a média ± DP, n = 6. *

P

0,001. (D) Imagem representativa do Ki-67 IHC de um xenoenxerto de tumor visto sob um microscópio. Para calcular o Ki-67 LI, células com núcleos marrom com manchas foram considerados positivos, indicando proliferação activa (ampliação × 400). Os dados são expressos como a média ± DP, *

P

0,001. análise (E) do ciclo celular em 72 h após a transfecção. Os resultados sugerem que a inibição da GSK3β resultou em G1 /S de detenção em células A549 e SK-MES-1 e alterou as proporções de a população de células em diferentes fases do ciclo celular. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de 3 experiências independentes realizadas em triplicado. *

P Art 0,001. (F) por citometria de fluxo, os resultados da análise apoptóticas indicaram que a inibição da GSK3β aumentou significativamente a taxa de apoptose de células NSCLC (excepto para as células A549)

In vitro

. *

P Art 0,001, ▴

P Art 0,05. (G) Os resultados do ensaio de TUNEL de tumores de xenoenxerto sugerido que a inibição da GSK3β aumentou a taxa de apoptose de células A549

in vivo

(ampliação de × 400). Os dados são expressos como a média ± DP, *

P

0,001. Os ensaios (H) Transwell que mostra que a inibição da GSK3β

In vitro

diminuiu significativamente a capacidade de invasão de células NSCLC. Os dados são expressos como a média ± S.D. *

P

. 0,001

Depois de realizar análise do ciclo celular por citometria de fluxo, descobrimos que a inibição da GSK3β aumentou o número de células na fase G0 /G1 e diminuiu o número de células em fase S em A549 (

P

= 0,003, e

P Art 0,001) e SK-MES-1 células (

P

= 0,002,

P

= 0,022) (Figura 4E). Em células H1299 e H292, GSK3β knockdown resultou em uma tendência de aumento na população G0 /G1, mas as diferenças não atingiram significância estatística (em células H1299,

P

= 0,056; e em células H292,

P

= 0,216).

In vitro

, o ensaio de apoptose celular sugeriu que as taxas apoptóticos no grupo KD foi muito maior do que aqueles nos grupos de controlo, com a exceção da linha de células A549 (H292, H1299 e SK-MES-1, tudo

P

0,001; A549,

P

= 0,461, Figura 4F). Para os murganhos de xenoenxerto, o ensaio TUNEL revelou que a taxa de apoptose no grupo KD (3,06% ± 1,24%) foi muito mais elevado do que aqueles dos outros grupos (grupo CN, 0,11% ± 0,04%; e grupo CON, 0,46% ± 0,23%) (

P Art 0,001). Tal como mostrado na Figura 4G, as células apoptóticas foram corados de vermelho e encolhido. Juntos, estes resultados sugerem que a inibição da apoptose induzida GSK3β células NSCLC.

4. A inibição da GSK3β reduz a invasividade de células NSCLC

Para contar as células que migraram

in vitro

, o ensaio Transwell usando células NSCLC foi repetido 3 vezes, e os resultados são mostrados na Figura 4H. Para todas as linhas de células 4, o grupo KD demonstraram significativamente menos células invasoras (todas

P

0,001), o que sugere que a inibição de GSK3β suprimiu grandemente a capacidade de invasão de células NSCLC. Nos ratos de xenotransplante, sem metástases foram encontrados após uma inspeção bruta e palpação. Além disso, a análise de microscopia de luz revelou nenhuma evidência de focos metastáticos nos órgãos fixadas e coradas.

Expressão

5.β-catenina após a inibição da GSK3β

Como se mostra na Figura 5, a expressão nível de β-catenina foi significativamente aumentada no grupo KD da linha de células escamosas SK-MES (

P

0,001). Além disso, knockdown de GSK3β suprimiu grandemente a expressão de β-catenina em células H1299 (

P

0,001) mas não em H292 (

P

= 0,108) ou células A549 (

P

= 0,185).

(a) faixas típicas no ensaio western blot mostrou que os níveis de proteína p-catenina foram regulados de uma forma específica do tipo de células após a inibição da GSK3β. (B) A análise quantitativa da expressão β-catenina. A experiência foi repetida 3 vezes, e os dados são expressos como as médias ± DP. *

P

. 0,001

Discussão

GSK3β foi originalmente identificado como um importante enzima reguladora do metabolismo do glicogênio [4], [7]. Desde então, esta proteína foi identificada como sendo um regulador importante da sobrevivência celular e apoptose, que liga esta quinase multifuncional para o cancro [25], [26]. Recentemente, um número de estudos demonstraram que GSK3β pode regular positivamente a proliferação e apoptose das células tumorais [10] – [18], embora o papel preciso da GSK3β no cancro do pulmão permanece desconhecida. Portanto, o presente estudo explorou o significado prognóstico da GSK3β e sua função em NSCLC.

Em primeiro lugar, observou-se a superexpressão de GSK3β em tecidos NSCLC ao comparar tecidos NSCLC com tecidos normais adjacentes, e esta acumulação aberrante de GSK3β em células NSCLC foi associada com um menor tempo de sobrevivência e identificado como um novo factor de risco para o mau prognóstico. Embora pouca atenção tem sido dada para a expressão de GSK3β no cancro do pulmão, as evidências sugerem que a sobre-expressão de p-GSK3β pode servir como um marcador para pior prognóstico no câncer de pulmão [27]. Como p-GSK3β é a forma inactiva de GSK3β, a sobre-expressão de P-GSK3β não é necessariamente equivalente à perda de GSK3β, especialmente quando o nível de proteína total é também grandemente supra-regulada. No nosso estudo, as expressões elevados de PGS, que é um indicador de actividade GSK3β, foi detectada na maioria das linhas celulares de NSCLC, indicando que é altamente activo GSK3β em células NSCLC. Por isso, o nosso estudo sugere que a sobre-expressão de um total de GSK3β foi sobre-activado e conferiu mau prognóstico em pacientes com NSCLC. Resultados semelhantes foram relatados para câncer de bexiga [18]. Portanto, GSK3β superexpressão pode servir como um biomarcador para melhorar o diagnóstico precoce, a seleção dos pacientes ea determinação do prognóstico.

Em addtion, nossos resultados mostraram que IHC GSK3β é localizada predominantemente no citoplasma no paciente e do tumor xenoenxerto tecidos. Por outro lado, diversos estudos demonstraram que GSK3β acumulou-se no núcleo em pancreático [11], cancros renais [28] e [18] da bexiga. Nestes tecidos tumorais, GSK3β nucleares pode desempenhar um papel no NF-kB mediada pela sobrevivência de células de cancro; No entanto, depois de knockdown de GSK3β, os níveis de expressão de NF-kB em diferentes linhas celulares de NSCLC de nosso estudo foram consistentes, indicando que GSK3β podem mediar a sobrevivência de células de cancro independente de expressão de NFkB (dados não mostrados). Portanto, a localização subcelular de GSK3β é complexa e fortemente relacionada com o seu mecanismo molecular. Um estudo mais aprofundado sobre o papel localização subcelular de GSK3β precisa ser conduzida.

A próxima questão importante é como explicar a profunda influência de GSK3β no prognóstico de NSCLC paciente. Este estudo tentou investigar os mecanismos moleculares básicos de GSK3β

in vitro

e

in vivo

. Tem sido bem estabelecido que GSK3β desempenha um papel central na regulação da apoptose [26]. Por exemplo, GSK3β nocaute ou tratamento de lítio potencializa a apoptose em hepatócitos [29], e um aumento da taxa de apoptose após a inibição da GSK3β foi reportado no cancro da próstata [30], o cancro pancreático [11], leucemia [13], glioma [ ,,,0],17] e cancro da bexiga [18].