Abstract

Fundo

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um líder causa de morte por câncer no mundo. O diagnóstico precoce é essencial para melhorias de prognóstico e sobrevida dos pacientes. Atualmente, não há nenhum biomarcador eficaz disponível na prática clínica para detecção precoce de câncer de pulmão. expressões alteradas em muitos tipos de câncer, incluindo NSCLC e existência estáveis ​​no plasma fazem microRNAs (miRNAs) um grupo de biomarcadores potencialmente úteis para avaliações clínicas dos pacientes com NSCLC.

Objetivos

Para avaliar os valores de potencial dos miRNAs como biomarcadores à base de sangue para o diagnóstico precoce e prognóstico em pacientes com NSCLC.

Métodos

amostras de sangue periférico de voluntários saudáveis ​​e pacientes com NSCLC primeiros-encenado, antes e após a cirurgia foram recolhidas e plasma separou-se. Expressão de dez miARNs nas secções de plasma e tumor dos doentes foi detectado por reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Resultados

miARN (MIR) -486 e miR-150 foram encontrados distinguir significativamente pacientes com câncer de pulmão de voluntários saudáveis. Área sob a curva de miR-486 e miR-150 foram 0,926 (sensibilidade, 0,909; especificidade, 0,818) e 0,752 (sensibilidade, 0,818; especificidade, 0,818), respectivamente. Em resposta à terapia, os pacientes com miR-486 expressão regulada para baixo mostrou sobrevida livre de recidiva prolongado do que aqueles com reduzida-un miR-486 expressão (mediana, não alcançados vs. 19 meses; taxa de risco, 0,1053; intervalo de confiança de 95%, 0,01045 para 1.060;

P

= 0,056)

Conclusões

Os resultados sugerem que miR-486 e miR-150 poderia ser potenciais biomarcadores à base de sangue para o diagnóstico precoce do NSCLC. . Monitoramento mudança de expressão de miR-486 no plasma pode ser um método eficaz e não invasivo para a previsão recorrência de pacientes com NSCLC primeiros-encenado

Citation:. Li W, Wang Y, Zhang Q, Tang L, Liu X , Dai Y, et al. (2015) MicroRNA-486 como um biomarcador para diagnóstico precoce e recorrência de não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 10 (8): e0134220. doi: 10.1371 /journal.pone.0134220

editor: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, Estados Unidos

Recebido: 08 de maio de 2015; Aceito: 07 de julho de 2015; Publicação: 03 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte Informações

financiamento:.. Este trabalho foi apoiado por Changzhou Ciência e Tecnologia Programa de Apoio (No. CE20125002)

Conflito de interesses: Jim Lu é um accionista e dono de Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co. Ltd e GoPath Laboratories LLC em Buffalo Grove, IL, EUA. Zhongmin Guo é o funcionário de Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co. Ltd e GoPath Laboratories LLC em Buffalo Grove, IL, EUA. Wanshuai Li, Qi Zhang, Lili Tang, Xiaoping Liu, Yunhua Dai, Liang Xiao, Shuguang Huang, e Lu Chen são empregados por Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co. Ltd. No interesse potencial concorrente é divulgado pelos outros autores. O estudo foi parcialmente financiado pela Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co. Ltd na China e GoPath Laboratories LLC em Buffalo Grove, IL, EUA. A afiliação comercial dos autores e o estudo não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) é responsável por aproximadamente 80% do cancro do pulmão, o que é uma causa principal de mortes por cancro em todo o mundo [1]. Ao longo das últimas décadas, os avanços em técnicas e estratégias de quimioradioterapia e terapia-alvo cirúrgicas têm melhorado significativamente a sobrevida de pacientes com câncer de pulmão [2, 3]. Apesar das melhorias de abordagens clínicas no tratamento de pacientes com câncer de pulmão, a sobrevida de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas localmente avançado (CPNPC) continua pobre, com uma sobrevida de 5 anos global (OS) de 15% para o estágio III pacientes com NSCLC tratados com quimioradioterapia concomitante [3, 4]. Estima-se que mais de 200.000 novos casos de câncer de pulmão e cerca de 150.000 mortes associadas ao câncer de pulmão ocorre anualmente nos Estados Unidos [1]. O diagnóstico precoce representa uma das estratégias mais eficazes na melhoria da sobrevivência e prognóstico de pacientes com câncer de pulmão [2]. No entanto, não há nenhum biomarcador clínica em uso hoje para o diagnóstico precoce e previsão de prognóstico para pacientes com câncer de pulmão.

Os microRNAs (miRNAs) são espécies de cadeia simples de RNA que constituem uma classe de não-codificante RNAs, e estão surgindo como reguladores chave da expressão do gene [5]. Muitos estudos têm mostrado que exibem expressão alterada miARNs em vários tipos de cancro e pode servir como biomarcador importante de prognóstico de cancros [6-8]. Recentes descobertas que o plasma humano contém microRNA estavelmente expressa revelaram um grande potencial de assinatura miRNA-base do sangue biomarcadores como fáceis para avaliação clínica da cancros humanos [8-10]. Por exemplo, circulando o miR-21 foi significativamente maior em pacientes com NSCLC do que em controlos normais [9, 11]. Os níveis séricos de miR-486, miR-30d, miR-1 e miR-499 foram significativamente associados com a sobrevida global em pacientes com NSCLC [8]. Serum miR-210 foi significativamente up-regulamentada em pacientes com NSCLC, em comparação com indivíduos saudáveis ​​de controlo [12].

Neste estudo, nós analisamos a literatura e selecionaram dez miRNAs relacionadas com NSCLC, incluindo miR-126 [13 ], miR-150 [14], miR-155, miR-205 [11, 15], miR-21 [9, 11], miR-210 [12], miR-26b [10], miR-34a [7 ], miR-451 [16] e miR-486 [8, 9], para comparar os níveis de miRNA entre os voluntários saudáveis ​​e pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

os pacientes

Este estudo envolveu retrospectivamente pacientes em estágio inicial (antes IIIa estágio) que tinham sofrido anteriormente ressecções pulmonares para NSCLC primária entre novembro de 2012 e fevereiro de 2014. os pacientes foram identificados a partir de banco de dados biorrepositório de patologia cirúrgica do Departamento de Cirurgia Torácica, No. 2 Hospital Popular da Changzhou, Changzhou, Jiangsu, China. Não houve outros critérios de inclusão ou exclusão para este estudo. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) da American Joint Committee on Cancer [17]. indivíduos controle foram recrutados indivíduos que procuraram a saúde de rotina check-up na saúde física Exame Centro de No. 2 Hospital Popular da Changzhou e não tinham sido previamente diagnosticados com câncer. Uma amostra de sangue venoso periférico de 5 ml foi desenhado a partir de voluntários saudáveis ​​e doentes com NSCLC de 2 dias antes, e de 7-10 dias após a cirurgia, e recolhidas num tubo de anticoagulante com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). As amostras de sangue total foram então centrifugados a 1000 g durante 30 min a 4 ° C numa centrífuga Sigma 3K15 (SIGMA Laborzentrifugen, Osterode am Harz, Alemanha). O plasma foi imediatamente recolhido, congelado e armazenado a -80 ° C para posteriores análises. descongelação repetidas foi evitada durante o armazenamento para garantir a qualidade das amostras. Além disso, combinado fixado em formol e (FFPE) tecidos embebidos em parafina dos 11 pacientes com NSCLC foram coletadas para análises seguintes. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de No. 2 Hospital Popular da Changzhou de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo.

extração de RNA e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

extracção de ARN foi efectuada tal como descrito [12] com ligeiras modificações. O ARN total, incluindo miARNs, foi extraída e purificada a partir de 200 ul de plasma ou 4 lâminas de tecido tumoral FFPE utilizando o Kit QIAGEN miRNeasy Mini ou QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. A pureza e concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotómetro de ultravioleta de duplo feixe (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Para a detecção quantitativa de miARN por RT-PCR [18], o plasma purificado miARN foi convertido em ADNc por reacções de transcrição reversa, utilizando TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, EUA) e de haste miARN-específica iniciadores de ansa foram fornecidos pela TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, EUA). Um total de 10 miRNAs que foram relatados para mostrar expressões alteradas no câncer de pulmão foi selecionado para análise e as suas sequências são apresentados na Tabela S1. As reacções RT foram misturados de acordo com o protocolo do fabricante e realizada num Applied Biosystems 9700 instrumento de PCR utilizando as seguintes condições: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 5 min, mantido a 4 ° C . Os níveis de expressão das miARNs seleccionados foram testados usando análises em tempo real quantitativa de PCR num sistema de PCR em tempo real ABI rápido 7900HT (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, EUA). As reacções de PCR em tempo real foram realizadas numa mistura de reacção contendo 5 ul 2,5 ul TaqMan Universal PCR Mistura de PCR II (Applied Biosystems, Inc.), 0,25 ul iniciador específico miARN-/mistura de sonda (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY , EUA), e diluiu-se 2,25 ul de ADNc molde RT utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. As reacções foram realizadas em triplicado. Os dados de PCR em tempo real foram recolhidos por SDS 2.2 Software (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, EUA) e os níveis relativos de miARN testado em amostras de plasma e tecido foram calculadas usando C. elegans sintético miR-39 e como RNU44 controlos de normalização, respectivamente [18-20]. As sequências de ambos os iniciadores de controlo de normalização são mostrados na Tabela S1. O limiar de ciclo (CT), que foi definida como o número de ciclos de PCR requeridos para o sinal de fluorescência a ser maior do que um limiar que indica a variabilidade da linha de base, foi registado. Os níveis de expressão de genes relativos das amostras testadas foram representados por 2

-ΔΔCT, onde ΔΔCT = CT

miRNAs-CT

controle de normalização.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizada utilizando o GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) e o pacote estatístico SPSS, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) para Windows. Os dados são expressos como a média ± DP. teste de Mann Whitney foi utilizado para analisar as diferenças nas concentrações plasmáticas de miRNA entre pacientes com NSCLC e voluntários saudáveis. características de operação da análise do receptor (ROC) foi realizado para determinar a capacidade do plasma níveis de miARN de discriminar entre doentes com NSCLC e voluntários saudáveis. A associação entre o tecido e os níveis plasmáticos de miRNA foi analisada pelo coeficiente de correlação de Spearman. Log-rank (Mantel-Cox) teste foi utilizado para avaliar a associação entre a sobrevida livre de recidiva (RFS) e mudanças de expressão de miRNA antes e após a cirurgia. A

P

-valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

miR-486 e miR-150 foram significativamente aumentados no plasma de NSCLC pacientes

para identificar potenciais biomarcadores miRNA à base de sangue de pacientes com NSCLC, nós analisados ​​quantitativamente os níveis de 10 miRNAs candidatos no plasma de 11 pacientes com NSCLC e 11 controles individuais normais de expressão. As características clínicas e histopatológicas de pacientes com NSCLC e controles estão listadas na Tabela 1. Não houve diferença estatisticamente significativa na idade e sexo entre pacientes e indivíduos controle.

A análise quantitativa de 10 miRNAs candidatos consistindo de miR -126, miR-150, miR-155, miR-205, miR-21, miR-210, miR-26b, miR-34a, miR-451 e miR-486 no plasma por PCR em tempo real revelaram níveis significativamente mais elevados de miR-486 (

P

= 0,008) e miR-150 (

P

= 0,0488) em amostras de plasma de pacientes com NSCLC do que os de controles normais (Tabela 2 e Figura 1). Não foram observadas diferenças significativas nos níveis plasmáticos dos miRNAs restantes entre pacientes com NSCLC e indivíduos normais. Níveis dos miARNs testadas em amostra de plasma individuais são apresentados na Fig 1 e os níveis de expressão média de miARNs testados no plasma de NSCLC e indivíduos de controlo normais encontram-se resumidos na Tabela 1.

níveis

de plasma de miR-126 , miR-150, miR-155, miR-205, miR-21, miR-210, miR-26b, miR-34a, miR-451 e miR-486 em 11 voluntários saudáveis ​​(saudáveis) e 11 pacientes com NSCLC foram analisados ​​usando qRT-PCR e normalizado com CEL-miR-39. pontos sólidos mostraram expressão relativa de miRNAs em cada disciplina; linhas transversais indicados meio de miRNAs em cada grupo.

Para determinar se os níveis mais elevados de miR-486 e miR-150 no plasma estão associados com o aumento das suas expressões em tecidos de câncer de pulmão, analisamos correlações de sua Os níveis de expressão entre os tecidos de plasma e cancro. coeficiente de correlação de Spearman indicaram que miR-486 níveis no plasma foi altamente correlacionada com o seu nível de expressão no tecido (Spearman r, 0,8273; 95% intervalo de confiança (IC), 0,4348-0,9556;

P

= 0. 0,0027) , enquanto não houve correlação significativa (Spearman r, 0,5455; 95% CI, -0,1014 a 0,8681;

P

= 0,0876) foi observada entre o plasma e os níveis de tecido para miR-150 (Fig 2). Esta constatação sugere que a expressão alterada do miR-486 no plasma é cancro específico.

análises de correlação de níveis de plasma e tecidos de miR-486 e miR-150 foi realizada com o software GraphPad Prism 5.0. (A) análise do coeficiente de correlação de Spearman de plasma e tecido níveis de miR-486. (B) análise do coeficiente de correlação de Spearman de plasma e tecido miR-150 níveis.

miR-486 e miR-150 são potenciais biomarcadores à base de sangue para detecção de NSCLC

Para mais explorar a utilidade clínica de miR-486 e miR-150, foi realizada a análise as características do receptor operacionais (ROC) sobre os dados de miRNA plasma de pacientes com câncer de pulmão e indivíduos de controlo normais. A análise observou-se que a área sob a curva (AUC), a sensibilidade e especificidade para miR-486 foram 0,926, 0,909 e 0,818, respectivamente, e aqueles para miR-150 foram 0,752, 0,818 e 0,818, respectivamente (figura 3). Os resultados implicam expressões diferenciais de miR-486 e miR-150 como potenciais biomarcadores à base de sangue para detecção e diagnóstico de câncer de pulmão.

Análise

ROC foi realizada com SPSS 16.0 software. A linha a cheio e ponteada indicada curva ROC de miR-486 e miR-150, respectivamente. AUC, área sob a curva.

plasma regulada miR-486 de nível após a cirurgia está associada a sobrevida livre de recidiva prolongado de NSCLC pacientes

Para determinar potenciais papéis de miR-486 e miR-150 na previsão de resultados clínicos de pacientes com câncer de pulmão, dobre alterações nos níveis plasmáticos de miR-486 e miR-150 antes e após a cirurgia foram gravadas e foram correlacionados com a sobrevida dos pacientes. os níveis de expressão relativa e dobrar mudanças de miR-486 e miR-150 antes e depois da cirurgia para pacientes individuais são apresentados na Tabela 2. Todos os 11 doentes foram seguidos após a cirurgia inicial e o período de seguimento de 24 meses máxima alcançada. Durante o follow-up, três pacientes (No. paciente, 101, 103 e 152) foram diagnosticados como recidiva local ou metástase distal, enquanto os outros oito pacientes foram diagnosticados como não houve recorrência Tabela 2).

Entre 11 pacientes, a maioria dos pacientes tinha níveis plasmáticos significativamente reduzidos após a cirurgia, tanto para miR-486 e miR-150 (Tabela 2). Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com as mudanças de níveis de miRNA após a cirurgia. Pacientes com níveis de miRNA significativamente reduzidos no plasma (dobre mudança 0,8) foram classificados em grupo regulamentada-down (DR), e os pacientes restante em grupo não reduzido (UR). A análise de sobrevida de dois grupos de pacientes mostrou que regulada para baixo nível de miR-486 no plasma foi associada com sobrevivência prolongada dos pacientes com sobrevida média não alcançados para DR e 19 meses para UR grupo (Fig 3, relação de risco, 0,1053; 95% CI , ,01045-1,060;

p

= 0,0561). Embora a diferença não atingir o nível estatisticamente significativa devido ao número limitado de doentes para o estudo, a tendência de associação é óbvia e a descoberta apoia um estudo ainda mais em um grande grupo de pacientes. Não foi observada diferença na sobrevida do paciente para o plasma miR-150 de nível entre DR e UR grupos (Fig 3, relação de risco, 0,7936; 95% CI, ,07682-8,198;

P

= 0,7936)

Discussão

NSCLC é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo e diagnóstico precoce é essencial para o prognóstico dos pacientes [1, 2]. A falta de biomarcadores de diagnóstico para a detecção precoce fez com que o cancro do pulmão um dos cancros humanos com o pior prognóstico. miRNAs circulantes foram relatados para ser notável bio-marcadores para diagnóstico de câncer devido à sua abundância e estabilidade no sangue [6-8] circulação. Neste estudo, comparamos os níveis plasmáticos de dez miRNAs que foram relatados para ter expressão alterada em NSCLC [7-16], entre os voluntários saudáveis ​​e pacientes com NSCLC fase precoce. O nosso estudo identificou dois candidato miRNAsmiR-486 e miR-150 como potenciais biomarcadores à base de sangue para o diagnóstico precoce e o prognóstico dos doentes com NSCLC (Fig 1).

O soro de miR-150 tem sido relatada a ser anormalmente aumentada no início encenar pacientes com NSCLC e significativamente correlacionada com metástases à distância [14]. MiR-150 promove a proliferação de células de câncer de pulmão, visando P53 [21, 22] e BAK1 [23] e, portanto, desempenha um papel mecanicista importante na patogênese do câncer de pulmão. Estudos sobre valor diagnóstico de miR-150, especialmente para as fases iniciais do câncer de pulmão, são limitados. Consistente com relatórios anteriores [21-23], o nosso estudo observou um aumento significativo expressões de miR-150 em ambos os tecidos e plasma de pacientes com NSCLC fase precoce do câncer. Mais importante, nós mostramos que o maior nível de miR-150 pode ser detectado no plasma de estágios iniciais de pacientes com câncer de pulmão e foi capaz de distinguir pacientes com câncer pulmonar de indivíduos saudáveis ​​com valor de AUC de 0,752 (Fig 2). Esta constatação implica miR-150 como um biomarcador candidato à base de sangue para detecção precoce de câncer de pulmão.

Outro achado interessante do estudo é que o miR-486 aparece como um biomarcador mais significativo para avaliação clínica de pacientes com câncer de pulmão . Dados acumulados a partir de diferentes estudos anteriores sobre miR-486 no cancro do pulmão eram controversos. Peng et al relataram que miR-486 é significativamente regulada em cancros [24]. Wang et al relatou ainda que a regulação negativa de miR-486 no cancro do pulmão significativamente correlacionados aos estágios e metástase linfática dos pacientes [25]. Estudo por Solomides et ai revelaram que o miR-486 é reduzida em tecidos de cancro do pulmão [10]. No entanto, um estudo de miR-486 mostrou que up-regulada nível de miR-486 no plasma foi correlacionada com sobrevida global curta [8]. Neste estudo, demonstrámos que o miR-486 foi regulada positivamente no plasma dos pacientes com NSCLC e aparece como um marcador mais sensível e específico no plasma para diferenciar as fases precoces de cancro do pulmão de indivíduos normais (AUC, 0,926, Fig 2), conforme em comparação com o miR-150. Esta descoberta sugere que miR-486 é um marcador mais promissor no sangue periférico para a detecção precoce do cancro do pulmão. Estamos cientes de que nosso resultado é inconsistente com os resultados de alguns dos estudos anteriores, que relataram constante diminuição da regulação de miR-486 no cancro do pulmão [10, 24, 25]. Esta inconsistência pode ser devido à diferença racial nas coortes para o estudo.

Tem sido demonstrado que os níveis aberrantes de miARN no sangue periférico de pacientes com cancro são causadas pela expressão desregulada de miARN em tecidos tumorais que secretos miARNs derivadas de tumores em fluidos corporais, incluindo sangue periférico [15]. Para determinar se níveis anormais de miR486 e miR150 no plasma são tumor específico, comparou tecido níveis de miRNA e níveis de miRNA plasma correspondente. Descobrimos que esse tecido NSCLC níveis de miR-486 foram significativamente correlacionados com os níveis plasmáticos, enquanto nenhuma correlação estatística foi observada em miR-150 níveis (Fig 3). Estes resultados implicam que o miR-486 pode ser mais do que o miR-150 específico do tumor. Com base nesta constatação, a hipótese de que os níveis de miRNAs no plasma pode ser usado para monitorar o status local de tumores, por exemplo recorrência após a cirurgia. Para testar esta hipótese, foram comparados nível de miR-486 no plasma antes e após a cirurgia. Descobrimos que os níveis de miR-486 no plasma diminuiu significativamente na maioria dos pacientes após a remoção cirúrgica dos tumores, enquanto apenas 3 casos permaneceram altos níveis de miR-486 no plasma. Curiosamente, a análise de associação dos níveis plasmáticos de miR-486 com RFS dados de acompanhamento dos pacientes revelou uma estreita correlação das mudanças de plasma miR-486 com status recorrentes de pacientes. Pacientes com plasma regulada para baixo níveis de miR-486 após a cirurgia tinha RFS prolongada do que aqueles com níveis elevados de miR-486 no plasma (Fig 4). Esta descoberta implica que as mudanças de miR-468 níveis no plasma em resposta a cirurgia pode ser um marcador à base de sangue promissor para predizer recorrência local do tumor após a cirurgia em pacientes com NSCLC. Devido ao número limitado de pacientes neste estudo, um grande grupo de pacientes está sob recrutamento em nosso estudo contínuo para comprovar esta importante descoberta.

Associação de RFS e miRNA plasma mudanças de nível, antes e depois da cirurgia foi plotada com Log-rank (Mantel-Cox) Teste. (A) RFS geral de todos os pacientes com NSCLC. (B) Associação de RFS e mudança de nível plasmático de miR-486 antes e após a cirurgia. (C) Associação de RFS e mudança de nível plasmático de miR-150 antes e após a cirurgia. DR, regulada para baixo; UD, un-down-regulada; HR, taxa de risco; CI, intervalo de confiança.

Conclusões

Os níveis plasmáticos de miR-486 e miR-150 pode ser potenciais biomarcadores para o diagnóstico precoce de pacientes com NSCLC. plasmáticas monitoramento miR-486 níveis antes e após a cirurgia pode prever risco de recorrência para a fase inicial de NSCLC.

Informações de Apoio

Tabela S1. As sequências alvo das sondas de miRNA

doi: 10.1371. /journal.pone.0134220.s001

(DOCX)

Reconhecimentos

Graças Dr. Leiming Cai (O Departamento de Patologia , No. 2 Hospital Popular da Changzhou) para obter informações clínica e coleta de amostras. Este trabalho foi apoiado por Changzhou Ciência e Tecnologia Programa de Apoio (No. CE20125002).