Abstract

esteróides Cardiotônicos são usados ​​para tratar a insuficiência cardíaca e arritmia e têm promissora efeitos anticancerígenos. A ouabaína esteróides cardiotónicos prototípico pode também ser uma hormona que modula a adesão da célula epitelial. esteróides cardiotónicos consistir de um núcleo esteróide e um anel lactona, e os seus efeitos biológicos dependem da ligação ao seu receptor, Na, K-ATPase, através do qual, eles inibem de Na

+ e K

+ ião de transporte e activar de diversas vias de sinalização intracelulares. Neste estudo, adicionou-se uma grupo de estireno para o anel de lactona da digoxina esteróides cardiotónicos, para se obter 21-benzilideno digoxina (21-BD), e investigados os efeitos deste esteróide cardiotónico sintético em diferentes modelos celulares. A modelagem molecular indica que 21-BD se liga ao seu alvo de Na, K-ATPase, com baixa afinidade, que adopta uma conformação diferente farmacofórica quando ligada ao seu receptor de digoxina. Por conseguinte, 21-DB, em quantidades relativamente elevadas jiM inibe a actividade do Na, K-ATPase, a

1, mas não a

2 e a

3 isoformas. Além disso, 21-BD tem como alvo outras proteínas fora da Na, K-ATPase, inibindo o exportador Pdr5p multidroga. Quando usado em células intactas em concentrações baixas uM, 21-BD produz vários efeitos, incluindo: 1), de células sobre-regulação de Na, expressão K-ATPase e actividade em células cancerosas HeLa e RKO, que não é encontrado para a digoxina 2) mudanças específicas na viabilidade das células, reduzindo-o em células cancerosas HeLa e RKO, mas aumentando-a em células MDCK epiteliais normais, que é diferente da resposta a digoxina, e 3) alterações na interacção célula-célula, alterando a composição molecular de junções apertadas e elevando a resistência elétrica transepitelial de monocamadas MDCK, um efeito previamente encontrado para ouabaína. Estes resultados indicam que a modificação do anel de lactona de digoxina fornece novas propriedades para o composto, e mostra que a alteração estrutural introduzida pode ser utilizada para a concepção de novos esteróides cardiotónicos com funções

citação:. Rocha SC, Pessoa MTC, Neves LDR, Alves SLG, Silva LM, Santos HL, et al. (2014) 21-benzilideno Digoxina: A proapoptotic cardenolídeo de células cancerosas que Up-Regulamenta Na, K-ATPase e epiteliais junções apertadas. PLoS ONE 9 (10): e108776. doi: 10.1371 /journal.pone.0108776

editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de abril de 2014; Aceito: 25 de agosto de 2014; Publicação: 07 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Rocha et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi financiado pela FAPEMIG (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais) APQ-01114-12, APQ-02596-12. , CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) 472.394 /2012-6 e NIH DK081431. Os autores são gratos pelo apoio financeiro e estrutural oferecido pela Universidade de São Paulo através da NAP-CatSinQ (Núcleo de Investigação em Catálise e síntese química). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

esteróides Cardiotônicos são substâncias comuns no reino vegetal que confere uma vantagem competitiva contra a depredação, quer para a planta que os sintetiza, ou para os animais que os acumula a partir da dieta [1]. Algumas evidências experimentais mostra que os animais podem sintetizar endogenamente esteróides cardíacos e que estas substâncias desempenham um papel importante na regulação da pressão arterial, a proliferação celular e a morte celular [2], [3]. A estrutura de base de esteróides cardiotónicos consiste de um esqueleto esteróide com um cis /configuração trans /cis e uma unidade de lactona na posição 17β, também conhecida como a aglicona. Além disso, estes compostos têm frequentemente um açúcar ligado à posição 3β do núcleo esteróide, para os quais são vulgarmente conhecidos como glicósidos cardíacos. A natureza do anel de lactona distingue os cardenolidas, que possuem um anel insaturado butirolactona, a partir dos bufadienolides, que apresentam um anel α-pirona. A única diferença estrutural entre os dois principais cardenolidas que são usados ​​terapeuticamente, digoxina e digitoxina, é um único grupo hidroxilo adicional (-OH) em digoxina, o que altera significativamente a sua farmacocinética. Digitoxina, é mais lipofílico, mostra forte ligação às proteínas do plasma, é quase exclusivamente metabolizada no fígado, e apresenta uma semi-vida muito longo. Em contraste, digoxina exibe ligação a proteínas do plasma fracas, não é extensivamente metabolizado e excretado numa forma essencialmente inalterada pelos rins [2], [3].

O principal efeito farmacológico de doses terapêuticas de digoxina e digitoxina é o seu efeito inotrópico positivo. Este é mediado através da inibição das células do miocárdio de Na, K-ATPase, o que resulta em um aumento nos níveis de Na citosólicas

+ e, secundariamente, Ca

2+, devido à diminuição do transporte do Na

+ dependente Na

+ /Ca

2 + trocador. A contracção do músculo aumentado de Ca

2+ no citosol da célula do miocárdio leva a mais de enchimento do retículo sarcoplasmático com Ca

2+, que estarão prontamente disponíveis para a sua libertação por estimulação, para a produção melhorada [3] – [5 ]

no contexto da biologia celular, há duas áreas em que os esteróides cardíacos são de interesse potencial:. câncer e adesão celular. Ambos estes fenómenos estão intimamente relacionadas, como demonstrado pela perda de adesão celular que ocorre durante a proliferação e a metástase de cancros. O efeito de esteróides cardíacas sobre a adesão celular é mal compreendida e é o foco de intensa investigação [6] – [8]. Desde 1960, vários efeitos antitumorais interessantes foram observadas para digitalis [9], [10], bem como para outras cardenolidas [11] – [15] e os glicosídeos cardíacos relacionados, os bufadienolides [16] – [19].

Cancro humano afeta predominantemente epitélios [20], que as células são altamente polarizada e ligados entre si através de complexos juncionais, incluindo junções apertadas (TJS). Esta última estrutura confere epitélios sua capacidade para funcionar como barreiras eficazes na separação de compartimentos biológicos [21]. Perda de TJs está envolvida na progressão e metástase [6], [22], por exemplo, uma diminuição na expressão da claudina apertado proteína de junção (CLDN) -7, está envolvido na disseminação de células de cancro da mama [23] cancro . Além disso, a importância de Na, K-ATPase para a formação de complexos juncionais tem sido bem estabelecida [24], [25], como é o requisito de contactos célula-célula para a expressão polarizada da Na, K-ATPase em decúbito lateral membrana plasmática das células epiteliais [26]. Curiosamente, o β

uma subunidade de Na, K-ATPase em si funciona como uma molécula de adesão celular em astrócitos [27] e epitélios [28] – [31]

Uma diminuição na expressão à superfície celular de. o β

uma subunidade tem sido associada com epitelial para mesenquimal transição, um processo envolvido na invasão tumoral e metástase [25], [32]. O tratamento com vários tipos de esteróides cardíacas provoca vários efeitos sobre junções celulares. Elevadas concentrações de ouabaína (≥300 nM) e outros esteróides cardíacas perturbar apertados, aderente e junções comunicantes, bem como desmosomas de células epiteliais [24], [33], [34]. Pelo contrário, concentrações baixas de ouabaína (10 nM) aumentar a vedação de TJs [35], acelerar a polaridade celular (tal como determinado pelo desenvolvimento de cílios [36]) e aumentar a comunicação célula através de junções comunicantes [30].

Embora os estudos sobre os efeitos biológicos dos esteróides cardíacas disponíveis no células de tumor estão a desenvolver-se rapidamente, este não é o caso para os esteróides cardiotónicos recém-sintetizadas. Alguns esteróides cardiotónicos sintéticas foram testadas quanto à sua actividade contra o cancro [17], [37] – [44]. Oleandrin e 9-hidroxi-2 “oxovoruscharin, um cardenolídeo hemi-sintético, está em ensaios clínicos e demonstrou actividade anti-cancerígena ambos

em

vitro

e

em

vivo

, em células cancerosas multirresistência culturas [15], [43], [44]. Outros estudos demonstraram que várias modificações da porção de açúcar de digoxina e digitoxina, pode aumentar o efeito anti-cancro destes compostos [45] – [48].

Vários autores descreveram a síntese de derivados de digoxina em que a adição grupos de estireno para a porção de anel de lactona produzida alguma actividade biológica interessante [49], [50]. No entanto, há ainda há relatórios sobre a actividade anti-cancerígena ou os efeitos desses derivados de digoxina sobre a atividade de Na, K-ATPase.

O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos biológicos da digoxina 21-benzilideno (21 -BD), um derivado de digoxina com um grupo estireno adicional no carbono C21 do anel de lactona, no cancro e as células normais.

Materiais e Métodos

procedimento geral para a síntese de 21- benzilideno digoxina

benzaldeído (0,18 ml, 1,8 mmol), digoxina (0,469 g, 0,6 mmol), K anidro

foram adicionados 2CO

3 (0,249 g, 1,8 mmol) e 60 ml de metanol para um balão de fundo redondo. Depois de se agitar durante 6 h a 70 ° C, o solvente foi evaporado num evaporador rotativo. O produto em bruto foi diluída com 20 ml de água e extraiu-se com acetato de etilo quente (3 x 30 mL). A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre Na anidro

2SO

4 e concentrou-se sob vácuo. O produto em bruto foi então purificado por meio de cromatografia em coluna de sílica (CH

2Cl

2 /MeOH 11:01). Após purificação, o produto puro foi diluído em tetrahidrofurano (THF), precipitado com hexano e concentrou-se sob pressão reduzida para dar 21-BD (0,325 g, 0,37 mmol, 62%) como um

cultura sólido branco. Cell

HeLa (carcinoma de colo do útero humano; ATCC CCL2) Comprar e RKO-AS45-1 (carcinoma do cólon; ATCC CRL-2579), as células foram cultivadas em meio RPMI ou F-10 (01:01) meio DMEM /HAM (Sigma , St. Louis, MO, EUA). As células CHO-K1 (ATCC CCL61) e células MDCK (II-renal canino; ATCC CCL-34) foram cultivadas em DMEM. Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone) (CDMEM), 60 mg /ml de estreptomicina e 100 mg /ml de penicilina. As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

5 células /cm

2 e incubados numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. O meio de cultura foi trocado a cada 48 h para evitar o esgotamento de nutrientes.

cultura de células de inseto e infecções virais

Sf-9 células de insecto foram crescidas em meio de Grace com 3,3 g /l de hidrolisado de lactalbumina, 3.3 g /l de Yeastolate, e suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 0,25 ng /mL de Fungizone. As células foram cultivadas em culturas em suspensão e foram transferidas para placas de cultura de tecidos de 150 mm antes da infecção. As infecções foram realizados como previamente descrito [51]. Após 72 h a 27 ° C, as células foram raspadas das placas de cultura, centrifugou-se a 1500 ×

g

durante 10 minutos e suspensas em 10 mM de cloridrato de imidazol (pH 7,5) e EGTA 1 mM. As células foram homogeneizadas em gelo utilizando um homogeneizador Potter-Elvehjem e o lisado foi centrifugado durante 10 min a 1000 ×

g

. O sobrenadante foi removido, centrifugado durante um adicional de 10 min a 12000 ×

g

, e o pellet final foi suspenso em sacarose 250 mM, EGTA 0,1 mM, e 25 mM de imidazol HCl, pH 7,4.

ensaio de citotoxicidade

efeito do composto a citotoxicidade foi avaliada usando o MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) sal de tetrazólio método colorimétrico (Sigma, St. Louis , MO, EUA). Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços (1 × 10

5 células /poço) e incubadas durante 24 h a 37 ° C até à confluência. Em seguida, as cavidades foram lavadas com meio de cultura e digoxina ou 21-BD foi adicionado em diferentes concentrações (0,05-500 uM). Após incubação durante 24 ou 48 h, as placas foram tratadas com MTT. As leituras foram feitas num leitor de microplacas Spectramax M5E (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) a 550 nm. A citotoxicidade foi registada como a percentagem de redução de absorvância, em relação a culturas de controlo não tratadas [52]. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os resultados foram expressos como a média de LC

50 (a concentração da droga que reduziu a viabilidade celular para 50%).

Apoptosis Assay

Ensaio Cometa.

A ensaio de electroforese em gel de uma única célula (comet assay) foi realizada de acordo com protocolos anteriormente publicados [53], [54]. Para isso, as células CHO-K1 foram tratados com 20, 35 ou 50 uM de digoxina ou 21-DB, que são as concentrações que não afectam a viabilidade celular de acordo com o ensaio MTT. As células foram semeadas em placas de 24 poços. As células do dia seguinte foram lavadas duas vezes com PBS, e incubadas 3 horas com os compostos correspondentes em meio de cultura sem soro. Os grupos de controlo positivo e negativo foram tratados com PBS, e metanossulfonato de metilo (400 ^ M), respectivamente. Após 24 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS e isolada usando uma solução de tripsina-EDTA. A tripsina foi inactivada com 3,0 ml de meio completo, seguido por centrifugação (5 min, 150 ×

g

). O sedimento foi então ressuspenso em 500 ul de PBS, e alíquotas de 30 ul das suspensões de células foram misturados com 70 ul de agarose de baixo ponto de fusão (0,5%). Estas misturas foram colocadas em lâminas pré-revestidas com agarose de ponto de fusão normal (1,5%) e cobertas com lamelas. As lamelas de cobertura foram removidas após cinco minutos, e as lâminas foram imersas durante a noite em solução de lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, pH 10; Triton X-100 a 1% e DMSO 10%). Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS e mantidas durante 40 minutos numa caixa de electroforese horizontal, cheio com tampão alcalina fria (EDTA 1 mM, NaOH a 300 mM, a pH 13). A electroforese foi conduzida a 0,86 V /cm e 300 mA (20 minutos) e as lâminas foram subsequentemente neutralizado (0,4 M de Tris, pH 7,5), fixadas com metanol e coradas com brometo de etídio. análises visuais foram realizados sob fluorescência [55], [56].

Phosphatidylserine translocação.

As células HeLa foram semeadas em diâmetro pratos de 60 mm de Petri em confluência e foram incubadas durante a noite em CDMEM. Eles foram, em seguida, tratou-se com 2 digoxina uM ou 50 uM de 21-BD em CDMEM para 6, 12 ou 24 h. Após a incubação, as células em suspensão foram recuperados a partir do meio por centrifugação a 150 ×

g

, 20 ° C durante 5 minutos. células ligadas foram obtidas através de um tratamento suave da protease 1 ml Accutase mais 3 ml de PBS), centrifugadas como acima indicado e adicionou-se as células obtidas a partir do suporte. Anexina-V ligado ao folheto exterior da membrana plasmática foi medida com um kit comercial (kit de anexina-V-Fluos Stainig, Roche, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, a suspensão de células foi incubada com uma mistura de Anexina-F-FITC e iodeto de propídio em tampão de solução salina durante 15 minutos. suspensão celular foi analisada por citometria de fluxo (FACSCalibur citômetro de fluxo, software Fow Jo).

Transepitelial resistência elétrica (TER)

células MDCK foram cultivadas em Transwell suportes permeáveis ​​(3415, Corning Inc., Nova Iorque, EUA) a resistência eléctrica transepitelial foi medida com um Evom e o sistema EndOhm-6 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA). Os valores finais foram obtidos subtraindo a resistência da solução do banho e a inserção vazio. Os resultados são expressos em ohms · cm

2 (Ω · cm

2) como uma percentagem do controlo.

Imunofluorescência

Depois de medições de TER, monocamadas MDCK foram lavadas três vezes com PBS gelado /Ca

2+, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 30 min a 4 ° C, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 durante 5 min, bloqueada durante 30 minutos com BSA a 3% e tratada para 1 h a 37 ° C com um anticorpo primário específico. As monocamadas foram então lavadas 3 vezes com PBS /Ca

2+, incubadas com anticorpos conjugados com FITC ou um marcado com trito adequados durante 30 min à temperatura ambiente e lavaram-se como acima indicado. Os filtros com as células foram excisadas com um bisturi e montadas em Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA, EUA). As preparações foram examinadas com um microscópio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). As imagens capturadas foram importados para FIJI, versão 2.8 (National Institutes of Health, Baltimore, EUA), para obter as projeções máximas e para o GNU Image Manipulation Program (GIMP) para normalizar o brilho e contraste em todas as imagens e construir figuras.

imunotransferência

análise Western blot de extractos de proteína de célula total foi realizado tal como descrito anteriormente [57]. Resumidamente, as células MDCK e HeLa foram lavadas com PBS e solubilizadas com ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão [mM de piperazina

N

,

-bis (ácido 2-etanossulfónico) 10 N ‘, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 2 mM de ácido etilenodiamino-tetracético (EDTA), 1% de Triton X-100, 0,5% de soluções de deoxicolato de sódio, e glicerol a 10%], contendo inibidores de protease (completo Mini; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). O teor de proteína de lisado celular foi medida (reagente de ensaio de proteína BCA; Pierce Chemical, Rockford, IL) e preparada para electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) por ebulição em tampão de amostra. As proteínas foram resolvidas electrotransfered para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Hybond-P; GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). As proteínas de interesse foram então detectados com o anticorpo policlonal específico ou anticorpos monoclonais indicados, em cada caso, seguido de anticorpos em espécies apropriadas conjugados com peroxidase (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) e detecção quimioluminescente (ECL plus; GE Healthcare).

Detecção de na, K-ATPase e expressão claudina via em tempo real quantitativa de RT-PCR

em tempo real quantitativa de RT-PCR (RT-qPCR), o ARN total foi extraído a partir da célula amostras utilizando TRIzol (Life Technologies, EUA). A concentração foi estimada por meio de espectrofotometria com um Nanodrop ND2000 (Thermo Scientific, EUA). Todas as reacções de transcriptase reversa foram realizadas utilizando 5 ug de ARN com o kit Superscript III (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras de ARN foram transcritas inversa simultaneamente para minimizar a variação interensaios associado com a reacção de transcrição inversa. PCR em tempo real quantitativa foi realizada num sistema de detecção de sequência ABI Prism 7500 rápido (Applied Biosystems) utilizando a Taq Vai qPCR mestre mistura (Promega, EUA). Os seguintes iniciadores e as concentrações foram empregues (Murphy et al, 2004): Na, K-ATPase α

uma subunidade (número de acesso GenBank NM_000701): FW (300 nm): 5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3, Rv (300 nM ): 5′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3 ‘; Na, K-ATPase β

uma subunidade (número de acesso GenBank NM_001677): FW (300 nm): 5′-ACC AAT CTT ACC ATG GAC ACT GAA-3 ‘, Rv (300 nm): 5’-CGG TCT TTC TCA CTG TAC CCA AT-3 ‘; CLDN-2 Fw GGTGGGCATGAGATGCACT, Rv CACCACCGCCAGTCTGTCTT; CLDN-4 Fw TGCACCAACTGCGTGGAGGATGAG, Rv ACCACCAGCGGGTTGTAGAAGTCC. As condições de PCR foram aplicados como se segue: 50 ° C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Cada um destes conjuntos de iniciadores geraram um produto de PCR original, tal como confirmado pelas curvas de fusão obtidas. Os ensaios de PCR foram realizados em triplicado, e os dados foram reunidos. medição quantitativa relativa dos níveis de genes-alvo foi realizada utilizando o método ΔΔCt de Livak et al. [58]. Como os genes endógenos de controlo de arrumação, que empregou o gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH, número de acesso GenBank NM_002046) e ribossomal 18S genes das subunidades (GenBank número de acesso NR_003286) [59]. Foram utilizados os seguintes iniciadores e concentrações: GAPDH FW (300 nm): 5’-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3 ‘, Rv GAPDH (300 nm): 5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′, 18S FW (300 nm): 5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA- 3 ‘, 18S Rv (300 nm): 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’.

análises de modelagem molecular

Inicialmente, digoxina, ouabaína, e 21-BD (Figura 1A) e foram gerados refinado através do método semi-empírico PM6 [60] implementado no software de 09 W gaussiana [61]. A estrutura cristalográfica de Na, K-ATPase (proteína alvo) complexado com ouabaína foi obtido a partir do Protein Data Bank (PDB ID: 4HYT [62] com uma resolução de 3,40 Â, utilizando o α

uma subunidade de Na, K ATPase). O ião magnésio e três moléculas de água intersticiais foram mantidos no local de ligação. Em seguida, uma rígida re-dock de ouabaína foi realizado para validar o nosso sistema. Subsequentemente, digoxina e 21-BD foram ancorado contra a ATPase. As análises de acoplamento foram realizados utilizando AutoDock Vina 1.0.2 [63]. O algoritmo de pesquisa aplicada foi iterado Local Search global Optimizer para otimização global. Neste processo, uma sucessão de passos com mutação e optimização local (o método Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno [BFGS]) foram realizadas, e cada passo seguido o critério Metropolis [64]. Neste estudo, uma caixa de grade foi construído explorar todos os sítios ativos, que foi definido como um cubo com o centro geométrico em ouabaína, com dimensões de 20 × 20 × 24 A, pontos espaçados de 1 A e X, Y e Z do -27,065, -69,469 20,469 e, respectivamente. Todos os valores de modelação molecular foram construídos utilizando DS visualizador 3.1 [65].

(A) Estrutura química de ouabaína, digoxina, e 21-BD. (B) À esquerda: estrutura inteira de Na, K-ATPase (PDB: 4HYT) mostrou na representação fita sólida, onde os alfa-hélice, beta-folhas e voltas são em vermelho, azul e cinza, respectivamente; direita: destaque do sítio de ligação com ouabaína mostrado na representação tubo. linhas vermelhas tracejadas indicam ligações de hidrogênio. Apenas átomos de hidrogênio polares foram mostrou para uma melhor visualização. conformação de farmacofórica, (C) e digoxina (D) 21-BD; interações polares e não polares são representadas por magenta e cores verdes, respectivamente. As linhas tracejadas indicam ligações de hidrogênio. interações de resíduos são codificados por cores, como indicado na escala inserido.

Preparação de membranas plasmáticas Pdr5p

As membranas plasmáticas contendo a proteína Pdr5p overexpressed foram preparados a partir da

Saccharomyces cerevisiae

AD124567 estirpe mutante conforme relatado anteriormente [66].

O fracionamento de lisados ​​celulares e preparação de fracções de membrana

Um total de 2,5 × 10

5 células foram cultivadas em 75 cm

2 garrafas de cultura e tratados com digoxina e 21-BD. Após 48 horas de tratamento, as células foram lavadas três vezes com PBS frio e descartado a partir do frasco de cultura com uma vareta de borracha em um tampão de preparação de membrana (6 mM Tris [pH 6,8], imidazole 20 mM, 0,25 M de sacarose, 0,01% de SDS, EDTA a 3 mM e PMSF 2 mM). As células foram homogeneizadas num homogeneizador Potter-Elvehjem, usando dez Stokes em gelo. Em seguida, eles foram sonicadas em um disruptor de células ultrassónico em gelo durante 10 s com a potência de 45%. A amostra foi submetida a centrifugação a 20000 × g durante 90 min a 4 ° C. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 250 ul de tampão de preparação de membrana. Por último, esta amostra a ultra-sons durante 10 s com potência de 25% até à homogeneização completa.

preparação Na, K-ATPase de rato hemisférios cerebrais

hemisférios cerebrais de ratos Wistar machos adultos foram rapidamente recolhido após anestesia de éter dietílico e decapitação. Os protocolos utilizados para o uso de ratos foram aprovados pela Comissão Institucional de Ética no Uso de Animais, DFBCICB011 código de processo e conformados com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH publicação n . 85-23, revista em 1996). Os tecidos de cérebro, usados ​​como uma fonte de sensível ouabaina-(α

2 /α

3) Na, isoformas K-ATPase, foram homogeneizados em 250 mM tamponada sacarose, ditiotreitol 2 mM, PMSF 0,1 mM e 5 mM Tris /HCl (pH 7,4) com uma matriz de Teflon Potter-Elvehjem homogeneizador accionado por motor. Posteriormente, o tratamento com M caotrópico Kl 2 foi realizada durante 1 h sob agitação constante, seguido por centrifugação, três vezes em 100000 ×

g

durante 1 h. O sedimento final foi ressuspenso em 250 mM de sacarose, 0,1% de desoxicolato de sódio e maleato 20 mM /Tris (pH 7,4), em seguida armazenada durante a noite a -20 ° C e submetido a centrifugação diferencial após descongelação [67]. Os peletes foram ressuspensos no mesmo tampão sem adição de PMSF e armazenado em N líquido

2.

preparação de Na, K-ATPase de rato rim

tecido renal foi isolado a partir de murganhos adultos e foi homogeneizados em sacarose 250 mM, EGTA 0,1 mM e imidazole 25 mM de HCl, pH 7,4, usando um accionado por um motor de Teflon Potter

–

Elvehjem homogeneizador. A amostra foi então sujeita a centrifugação a 4500 ×

g

durante 10 min. O sobrenadante resultante foi centrifugado a 70.000 ×

g

durante 1 h. O sedimento final foi ressuspenso na solução de homogeneização e usado para ensaios da actividade da Na, K-ATPase. Todos os protocolos experimentais envolvendo ratos foram aprovados pela Universidade de Kansas Medical Center Institutional Animal Care e do Comitê Use.

NTPase Assays

actividades enzimáticas foram analisadas usando ATP como substrato no meio padrão (50 ul de volume final) contendo 100 mM de Tris-HCl pH 7,5, MgCl 4 mM de

2, 75 mM de KNO

3, NaN 7,5 mM de molibdato de amónio

3, e 0,3 mM, na presença de ATP 3 mM. A reacção foi iniciada pela adição de 13 ug /ml das preparações de membrana do plasma, em seguida, mantida a 37 ° C durante 60 min e parou-se a adição de 1% de SDS, como previamente descrito [68]. O fosfato inorgânico libertado (Pi) foi medida tal como descrito noutro local [69]. Usando soluções estoque em DMSO, 21-BD e digoxina foram adicionadas até uma concentração de 5% v /v final. A diferença na actividade da ATPase na presença ou ausência de 3 uM oligomicina correspondeu a uma actividade de ATPase Pdr5p-mediada.

Medição do efeito de 21-BD de Na, K-ATPase actividade

as preparações hemisfério cerebral foram incubadas a 37 ° C durante 2 h em meio contendo NaCl 87,6 mM, KCl 3 mM, MgCl 3 mM de

2, ATPNa 3 mM de

2, EGTA 1 mM, azida de sódio 10 mM e 20 ácido maleico mM /Tris (pH 7,4), e as preparações de membrana de células foram incubadas a 37 ° C durante 1 h em NaCl 120 mM, KCl 20 mM, MgCl 2 mM de

2, ATPNa 3 mM de

2 e 50 HEPES mM, (pH 7,5), tanto na ausência e na presença de 1 mM de ouabaina ou concentrações crescentes de 21-BD e digoxina. Na, K-ATPase actividade foi determinada pela medição da Pi libertado de acordo com um método colorimétrico descrito anteriormente [69], e a actividade especifica foi considerada como sendo a diferença entre as actividades totais e ouabaína resistente ATPase [70].

ouabaina

As células HeLa foram semeadas em 24 placas de multi bem na confluência e cultivadas durante a noite. As monocamadas foram então rapidamente lavadas três vezes com tampão de solução salina isenta de potássio (NaCl 140 mM, CaCl 1,8 mM

2, sacarose a 5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,4 à temperatura ambiente) e incubado durante 30 minutos com uma solução de ligação total (0,1 × 10

-6

3H-ouabaína mais 0,9 × 10

-6 ouabaína frio em tampão de solução salina livre de potássio), sob agitação suave e à temperatura ambiente. Em seguida, as monocamadas foram lavadas quatro vezes, 1 min cada, com gelo frio 0,1 M MgCl

2 e dissolveu-se com 400 ul de SDS a 1%.

3H actividade foi medida em amostras de 350 uL por contagem de cintilação. Total

ligação foi competiu pela adição à solução de ligação total da quantidade necessária de 21-BD para atingir as concentrações indicadas no resultado de ouabaina-3H. Um subconjunto de monocamadas foi exposto a solução de ligação competiu (solução de ligação total mais 0,5 × 10

-4 M ouabaína frio) para medir a ligação inespecífica e subtrair-lo para os valores de ligação total.

Análise estatística

as análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism, versão 5. os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. A significância estatística de uma análise unidireccional da variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações de pares seleccionado um de Bonferroni, foi ajustado a

P

0,05 (*),

P

0,01 (**), ou

P

. 0,001 (***) vs. a condição de controle, e “n” representa o número de experimentos independentes

resultados

Sintetizámos 21-BD através de uma reacção selectiva estéreo simples vin�oga aldólica, de acordo com Xu et al. [50], e caracteriza-se o produto final por meio convencionais de RMN, HRMS e análise de IR (Figura 1A; Figura S1 e Dados S1).

Para executar análises de modelagem molecular que começou com a otimização geométrica de ligantes, por meio de uma abordagem semi-empíricos, para corrigir os parâmetros geométricos, tais como comprimentos de ligação e refinar a estrutura. A estrutura de re-dock obtidos com o software AutoDock Vina, mostra que o refinado e o compartilhamento ligando cristalográfica a mesma conformação no sítio ativo, com uma raiz significa valor do desvio quadrado de 2,24 Å para a melhor solução, o que indicou a precisão do metodologia utilizada (veja a Figura S2A). A Figura 1B mostra uma simulação do encaixe de ouabaína para o seu local de ligação nas α de Na, K-ATPase

1 isoformas. Como mostrado, a enzima preserva os elementos secundários estruturais da família ATPase (Figura 1B, à esquerda) e que o local activo é composto por Gln111, Glu117, Pro118, Asn122, Leu125, Glu312, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Phe783, Phe786, Leu793, Ile800, Arg880 (Figura 1B, à direita), de acordo com as estruturas conhecidas [71].

a seguir analisa estes modelagem molecular que ancorados ouabaína, digoxina e 21-BD de na, K-ATPase ( Figura S2B e Figura 1C e D). Simulações resultou em energias de ligação de ouabaína, digoxina, e 21-BD de -9,8, -1,9 e -10,0 kcal /mol, respectivamente. Estes dados sugerem que o 21-BD pode ter uma afinidade de ligação semelhante ao de Na, K-ATPase ouabaína e de digoxina. No entanto, ambos estes últimos compostos apresentam diferentes conformações farmacofóricos no local de ligação, principalmente ao nível do anel de lactona. As Figuras 1C e D realçar as interacções intermoleculares mais importantes entre os ligandos e a proteína alvo. Digoxina se liga à enzima através de ligações de hidrogénio com Thr797, Asp884 e Lys905 aminoácidos. O eletrostática e interação hidrofóbica ocorrer com Glu117, Asn120, Asp121, Asn122, Ile315, Gly319, Val322, Ala323, Arg880, Asp884, Tyr901, Glu908 e Gln111, Leu125, Phe316, Phe783, Phe786, Leu793, Arg886, Phe909, Arg972, respectivamente (Figura 1C). Em contraste com os glicosídeos cardíacos naturais, complexos de 21-bd para o Na, K-ATPase através Gln111, Glu312, e Thr797 ligação de hidrogénio. Além disso, o anel aromático atinge uma bolsa hidrofóbica formada principalmente por Cys104, Val322, Ala323, Glu327, Ile800 (Figura 1D). Além disso, a conformação farmacofórica é completamente diferente da dos glicosídeos naturais, cuja porção aromática liga-se a moléculas de água e de iões de magnésio.

Para determinar directamente a ligação de 21-BD para o local de ouabaína da Na, K ATPase, primeiro testado se o esteróide sintético poderia competir com

obrigatório em células HeLa, que expressam o α

1 isoforma da na, K-ATPase [72] ouabaina-3H. Como mostrado na Fig.