Abstract

O câncer colorretal (CRC) está associada a fatores de estilo de vida que afetam a sinalização de insulina /IGF, do qual a insulina um substrato do receptor (IRS1) é um transdutor chave. Nós investigamos a expressão, localização e correlações patológicas de IRS1 no epitélio do cólon câncer não envolvido, CRCs primários com metástases hepáticas e emparelhados

in vitro

polarizar células Caco2 e HT29. IRS1 mRNA e proteína resultou superior, em relação à mucosa emparelhado, em adenomas de pacientes com polipose adenomatosa familiar e CRCs que overexpressed

c-MYC

, ß-catenina, InsRß e IGF1R. Análise do IRS1 imunocoloração em 24 casos de CRC primária, com o epitélio do cólon emparelhado e metástase hepática mostrou que a intensidade de coloração foi significativamente maior em metástases em relação a ambos CRC primário (

P Art 0,01) e epitélio do cólon (

P

0,01). CRCs primários e metastáticos, em comparação com epitélio do cólon, continha números significativamente maiores de células IRS1-positivas (

P

= 0.013 e

P

= 0,014, respectivamente). correlações patológicas em 163 CRCs primárias revelou que a coloração IRS1 difuso foi associado a tumores que combinam fenótipo diferenciado e marcadores agressivos (alta Ki67, p53, e ß-catenina). Em Caco 2 IRS1 e InsR foram maximamente expressa após a polarização, enquanto IGF1R foi maior em células pré-polarizada. Nenhuma IRS1 nuclear foi detectada, enquanto que, com polarização, IRS1 fosforilada (pIRS1) deslocada a partir da lateral à membrana plasmática apical e foi expresso apenas em células superficiais. Em HT29, que carregam mutações constitutivamente ativando a sobrevivência de sinalização, IRS1 e IGF1R diminuiu com a polarização, enquanto pIRS1 localizadas em pontos nucleares ao longo do curso. No geral, estes dados fornecem evidências de que IRS1 é modulada de acordo com diferenciação CRC, e apoiar um papel de IRS1 no CRC progressão e fígado Metastatização

Citation:. Esposito DL, Aru F, Lattanzio R, Morgano A, Abbondanza M , Malekzadeh R, et al. (2012) A Insulina Receptor substrato 1 (IRS1) em intestinal epitelial Diferenciação e no cancro colorectal. PLoS ONE 7 (4): e36190. doi: 10.1371 /journal.pone.0036190

editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2010; Aceito: 01 de abril de 2012; Publicação: 27 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Esposito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it/), IG 9168 (2009); Ministério Italiano de Pesquisa Científica (https://www.istruzione.it/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) tem sido associada a fatores de risco de vida, principalmente dietas à base de alimentos com alta densidade energética e baixa atividade física [1] – [3]. Epidemiológica e evidências experimentais indicam que o hormônio insulina e os fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) papel-chave 1 e 2 peça (s) na mediação do efeito complexo (s) de dieta e exercício sobre o risco de CRC [4] – [10] . A sobre-expressão do receptor de insulina (InsR) e do receptor de IGF1 intimamente relacionados (IGF1R) é crítico para o sistema de insulina /IGF sobre-activação no cancro [4], [7], [9]. epitélio intestinal, que possui uma das mais elevadas taxas de renovação entre os tecidos humanos, expressa tanto a InsR e o IGF1R, e os níveis desses receptores são mais elevados em CRC em relação à mucosa do cólon [4], [7], [8], [ ,,,0],11].

intestinal diferenciação epitelial é regulada por várias vias, WNT particularmente ß-dependente catenin sinalização [12], [13]. A maioria dos CRCs parecem iniciar após inactivação mutações na polipose adenomatosa coli (

APC) do gene, que codifica um componente central do complexo multi-citosólico de proteínas que controla SS-catenina degradação [14] – [16].

APC

células -mutated mostram alta ß-catenina citoplasmática e nuclear; este último, após a ligação com fatores de transcrição TCF /LEF, forma complexos que, ao ligar vários genes relacionados com o cancro, impõem um fenótipo de progenitor cripta proliferativa (revisado em https://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html ) [17].

Curiosamente, evidências recentes ligam o ß-catenina e os de insulina /IGF vias de sinalização. Na verdade,

IRS1

, codificação de um dos dois substratos principais de receptores de insulina (IRS1 e Irs2), que integram a sinalização a partir do InsR, IGF1R e outros receptores de citocinas e factores de crescimento [18], é altamente regulada positivamente em células com exogenamente-induzido ou constitutiva ß-catenin sinalização [19]. Este parece depender da regulamentação direta de

IRS1

por complexos /LEF-ß-catenina TCF. Além disso, IRS1 é necessária para a transformação em células que expressam ectopicamente oncogénica SS-catenina e para a manutenção do fenótipo neoplásico em

APC células

-mutated [19]. Estes resultados são consistentes com evidências anteriores de que IRS1 ectópica promove a transformação, enquanto que um dominante negativo

IRS1

atos mutantes como um supressor de tumor [20]. Além disso, no

Apc

(

Min

/+) modelo do rato, tumorigênese intestinal é atenuada pela

IRS1

knock-out [21].

no presente estudo, investigamos a expressão, localização e correlações clínico-patológicas de IRS1

ex vivo

, no epitélio câncer não envolvido humano do cólon, CRCs primários e metástases hepáticas pareadas, e

in vitro

, em dois modelos de células CRC capazes de espontânea

in vitro

polarização, Caco2 e HT29 [22], [23].

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes

Uma série (FFPE) fixado em formol e incluído em parafina de 24 CRCs primárias com mucosa do cólon câncer não envolvido emparelhados e metástase hepática síncrona foi retrospectivamente identificados no Departamento de Cirurgia e Ciências Oncológicas, da Universidade de Palermo, Palermo, Itália. Para esta série seções inteiras padrão foram utilizados para imuno-histoquímica (IHQ). Uma série FFPE adicional, consistindo apenas em CRCs primários, fornecidos pelo Digestive Disease Research Center (DDRC), Universidade de Teerã de Ciências Médicas, Teerã, Irã, incluídos 163 dos 205 casos de CRC descritos na Bishehsari et al. e em Mahdavinia et ai. [24], [25], seleccionado com base na disponibilidade de tecido. Estes CRCs tinha sido previamente caracterizado para o status de instabilidade de microssatélites (MSI) e

p53 Comprar e

KRAS

mutações [24], [25]. Dados clínico-patológicas, incluindo a idade e sexo, tamanho do tumor, estágio e grau, estavam disponíveis para todos os 163 pacientes. Não há acompanhamento e sobrevivência de dados estavam disponíveis. microarrays de tecido (TMAs) foram construídos por meio da extração confirmou-histologicamente núcleos CRC de blocos dadores com um Beecher MTA 2 mm perfurador Set (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, EUA). Os núcleos foram re-incorporado em blocos de parafina grade e seções TMA-padrão foram usados ​​para IHC.

As amostras de tumor e emparelhado mucosa do cólon, congelado ou rapidamente corrigido no RNAlater (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA), foram coletadas no Departamento de Fisiopatologia Clínica da Universidade de Florença, Florença, Itália, a partir de 8 casos de CRC não selecionados e 2 polipose adenomatosa () pacientes familiares FAP com linha germinal molecularmente identificadas

APC

mutação (respectivamente Glu1309fsX1312 e Ser843fsX860). Recolha e análise de amostras e dados clínico-patológicos foram aprovadas pelo

G. D’Annunzio

Comitê de Ética da Universidade e pela Institutional Review Board do DDRC, Hospital Shariati, Universidade de Teerã (protocolo datado de 17/03/2004). Todos os casos foram tornados anónimos.

IHC

TMA e secções de tecido inteiro padrão foram cortadas em 4 mm e corados com policlonal de coelho anti-IRS1 (C-20, SC-559, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha) em 1:300 diluição durante 30 min, após a recuperação de antigénio por tratamento de microondas a 750 W durante 10 minutos em tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 6.0 (Dako, Glostrup, Dinamarca). O kit EnVision anti-coelho (K4003, Dako) foi utilizado para amplificação do sinal. As secções em série de TMA, também foram incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais de ratinho: anti-SS-catenina (17C2, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK), anti-p53 (DO7, Novocastra) e anti-Ki67 (MIB-1, Dako), para que a recuperação de antigénio foi realizado por banho termostático a 96 ° C durante 40 minutos em tampão de citrato de sódio (Dako), e anti-EGFR pharmDx (2-18C9, Dako), de acordo com as instruções do fabricante. Todas as reacções imunológicas foram reveladas por um sistema peroxidase-estreptavidina-biotina reforçada (Super Sensível Link-Etiqueta IHC Detection System, BioGenex, Milão, Itália). Foram incluídos controlos positivos e negativos para cada anticorpo e em cada lote de coloração.

Para cada marcador as percentagens de células positivas foram estimados em quatro campos a 400 x de ampliação (≈1000 células). IRS1, Ki67, p53, EGFR e SS-catenina foram consideradas positivas quando o 1% das células tumorais foram coradas, SS-catenina foi pontuado separadamente para a imunocoloração no citoplasma, núcleo e ao longo da membrana celular. As amostras independentes t-teste foi utilizado para avaliar diferenças na expressão IRS1 (% de células positivas) de acordo com as características patológicas e mutacionais. Expressão de IRS1 foi correlacionada com a de cada um dos outros marcadores de teste por Rho de Spearman. Foi utilizado o programa SPSS (versão 15.0) (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) para todas as análises estatísticas. Todos os

valores P

citados são frente e verso;

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significante

A densidade do IRS1 imunocoloração no epitélio do cólon câncer não envolvido emparelhado, principal metástase CRC e fígado foi determinada por análise digital semi-quantitativo utilizando o software ImageJ ( https://rsbweb.nih.gov/ij/). As imagens foram adquiridas em configurações de campo brilhante padronizados (400 × ampliação). imagens JPEG Cor capturados foram convertidas em tons de cinza 8 bit imagens, em seguida, a região de interesse função de gerente foi usada para delinear áreas citoplasmáticos, cada um compreendendo 5-15 células. elementos nucleares ou estroma indesejados foram editados para fora. As áreas analisadas em 4 conjuntos combinados de epitélio da cripta, CRC primário e metástases hepáticas eram 11 por epitélio da cripta inferior, 10 por epitélio superior cripta, 78 para epitélio colônico total, 84 para CRC primário, e 84 para câncer colorretal metastático. Usando as configurações ImageJ padrão, as unidades de medição para cada área foram valor de densidade, área total de pixels quadrados, tamanho médio e fração de área. Os valores de densidade para epitélio da cripta, CRC primário e metastático CRC, normalizada por tamanhos da área, foram analisadas utilizando o teste t de Student não pareado. Um valor de

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo [26]

Quantitative PCR em tempo real (RTqPCR)

RNA total a partir de mucosa emparelhados e amostras de CRC foi. isolado com QIAzol (Qiagen, Hilden, Alemanha), tratou-se com ADNase-1 (Ambion), verificada por espectrofotometria e electroforese em gel de agarose, e retro-transcrito com o ADN de alta Capacidade Arquivo Kit (Applied Biosystems), seguindo as instruções do fabricante. RTqPCR ensaios foram realizados em duplicado, utilizando placas de 96 poços de reacção ópticos e uma máquina ABI 7500HT (Applied Biosystems). valores da trama de amplificação de base foram definidas automaticamente e limiares foram mantidos constantes para obter tempos de ciclo normalizados e dados de regressão linear. A mistura de reacção por poço continha 10 jil de alimentação Syber verde (Applied Biosystems), 2,4 ul de iniciadores (concentração final 150 nM), 4,6 ul de água livre de ARNase, 3 ul de cDNA (60 ng). Para todas as experiências, o protocolo de PCR foi: desnaturação a 95 ° C durante 10 min, em seguida 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e a 60 ° C durante 60 seg. A quantificação foi realizada em relação ao

ciclofilina

[27] usando o método ΔΔCT. primers Validated RTqPCR, projetado com software Primer Express 3.0, foram:

ciclofilina

, FW 5’TTTCATCTGCACTGCCAAGA3 ‘; RV5’TTGCAAAACACCACATGCT3 ‘;

IRS1

, ‘RV5’GGAGAAAGTCTCGGAGCTATGC3’ FW 5’GCAACCAGAGTGCCAAAGTGA3;

c-MYC

, FW5’CCACCACCAGCAGCGACT3 ‘, RV5’CAGAAACAACATCGATTTCTTCCTC3’.

As culturas de células

A modulação da IRS1 e do eixo de insulina /IGF1 foi investigada no Caco- 2 e linhas de células HT29 CRC, que, sob condições específicas de cultura, se submetem a

in vitro

diferenciação espontânea [22], [28], [29]. Caco-2, desenvolvido a partir de uma CRC primária excisadas a partir de um 72 anos de idade, masculino, branco, é MSI-estável e carrega uma inactivação

APC

mutação pontual, com a segunda batida pela perda de heterozigosidade (LOH), uma mutação missense em

ß-catenina

exão 5 (que não parecem afectar a degradação), e é do tipo selvagem para

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e

PTEN

[23], [30] – [32]. HT29, desenvolvido a partir de uma CRC primária excisadas a partir de um 44 anos de idade sexo feminino, branca, também é MSI-estável e carrega double-hit inativação

APC

mutações (que ainda permitem limitada fosforilação ß-catenina e ubiquitination), bem como mutações em

SMAD4

,

BRAF

,

TP53

, e

PI3KCA

, que codifica a p110α subunidade catalítica da classe I fosfatidilinositol 3-quinases ( PI3K) [23], [31] (ver também o Catálogo de Somatic Mutações em Câncer, https://www.sanger.ac.uk/cosmic).

células Caco-2 e HT29 foram obtidos a partir ATCC (ATCC-LGC Promochem, London UK). células Caco-2 foram mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /ml), sob uma atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. As células foram plaqueadas em placas de Petri de 10 cm e deixadas a crescer a confluência. Após confluência (designada como tempo zero) Caco-2 de cultura foi efectuada em DMEM com 20% de FBS. O decurso de tempo inteiro foi realizada duas vezes e os lisados ​​de células inteiras foram obtidos em 3, 7 e 14 dias de confluência. células HT29 foram mantidas em DMEM com 10% de FBS e deixadas a crescer durante 3 (preconfluent), 7 (confluentes) e 14 (pós-confluentes) dias, altura em que foram obtidos tempos de lisados ​​de células inteiras.

Western blotting

célula inteira ou lisados ​​de tecidos inteiros foram preparadas utilizando tampão de lise arrefecido em gelo (NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, 1% Triton X-100, 50 mM de Hepes pH 7,9, NaF 10 mM, pirofosfato de sódio a 4 mM, Na3VO4 2 mM) suplementado com inibidores de protease (1 mM de phenylmethylsulphonylfluoride, 2 ug /mL de aprotinina, 2? g /mL de leupeptina). Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação (10000 x g durante 20 min) e o teor de proteína foi determinada pelo método de Bradford. Cinquenta microgramas (50 ug) de proteínas totais foram resolvidas sob condições redutoras em 7,5% SDS-PAGE e transferidos para nitrocelulose reforçada. A membrana foi bloqueada com leite seco a 3% não-gordo em PBS com 0,01% de Tween 20 durante 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite com os anticorpos primários seguintes: policlonal de coelho anti-IRS1 (C-20, Santa Cruz), diluída 1:500; IRS1 anti-tirosina-632 fosforilada (pIRS1 Tyr632) anticorpo policlonal (Santa Cruz), diluída 1:200; anti-ß-catenina monoclonal (Ylem, Roma, Itália), diluídas a 1:50 ou policlonais anti-ß-catenina (# 9562, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), diluída 1:1000; policlonal contra a subunidade beta do InsR (InsRß) (C-19, Santa Cruz) diluída 1:200; policlonal contra a subunidade beta do IGF1R (anti-IGF1Rß, Cell Signaling Technology /Euroclone, Milão, Itália) diluída 1:800; monoclonal anti-actina (Sigma-Aldrich, Milão, Itália) diluída 1:10000. A membrana foi então lavada em PBS e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário correspondente de rábano silvestre conjugado com peroxidase, diluída 1:2000 (GE Healthcare, Milão, Itália). Os anticorpos ligados foram detectados usando o método quimioluminescente melhorado (ECL) (Pierce-Celbio, Pero, Itália). A quantificação de sinais de Western blot (média ± SE de pelo menos duas experiências independentes) foi obtido com a análise sinais digitalizados com o software ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Os dados foram normalizados para ß-actina e expressas como percentagem do valor máximo.

Imunofluorescência

células Caco-2 e HT29, cultivadas em lamelas sob as condições descritas acima, foram fixadas em metanol (-20 ° C) e incubadas com anti-SS-catenina monoclonal (BD Ciência, Franklin Lakes, NJ, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-IRS1 (C-20, Santa Cruz), diluída 1:50; e anti-pIRS1 (Tyr632) policlonal (Santa Cruz), diluída 1:50. Os núcleos foram coradas com 4,6-diamido-2-fenilindole (DAPI, Sigma-Aldrich) e membranas celulares com aglutinina de gérmen de trigo (WGA, Sigma-Aldrich). Os anticorpos primários foram visualizadas utilizando IgG de cabra anti-rato fluoresceína conjugado com isotiocianato de (Cappel, MP Biomedicals Europa, Illkirch, França) ou de cabra anti-IgG de coelho-Texas-Red-conjugado (Jackson ImmunoResearch Laboratories Europa, Newmarket, Suffolk, UK) para 30 min à temperatura ambiente. As células foram analisadas utilizando um microscópio invertido ApoTome axio Observador Z1 (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) equipado com um AxioCam MRM Rev. 3 a 40 x de ampliação. Co-localização dos sinais de fluorescência foi analisada com o software AxioVision 4.6.3. A análise de imagem foi realizada utilizando o Adobe Photoshop.

Microscopia electrónica

As células foram fixadas numa mistura de 2% de paraformaldeído-2% de glutaraldeído em PBS (pH 7,4), pós-fixadas em 1% de ósmio tetróxido em tampão de acetato de veronal (pH 7,4) durante 1 h a 25 ° C, corado com ácido tânico 0,1% no mesmo tampão durante 30 min a 25 ° C e com acetato de uranilo (5 mg /ml) durante 1 h a 25 ° C, desidratadas em acetona e embebidas em Epon 812. As lâminas foram finalmente analisada sob um microscópio eletrônico de transmissão Philips CM10, depois de pós-coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo.

resultados

IRS1 em CRC

Nós determinado por RTqPCR a expressão constitutiva da

IRS1

e

c-MYC,

alvo WNT chave e efetoras [17], em RNA total de emparelhado mucosa colorectal e amostras de CRC (Figura 1A). Cinco CRCs overexpressed

IRS1

em relação à mucosa emparelhado. No geral, os níveis de mRNA de

IRS1

estavam de acordo com os de

c-MYC

.

O painel A mostra histogramas da expressão relativa de

IRS1

(esquerda) e

c-MYC

(à direita) transcrições em amostras pareadas de mucosa câncer colorretal afetado (branco) e CRC (preto), como determinado por quantitativa PCR em tempo real (RTqPCR). amostras de mucosa foram igualados a 100% e normalizadas para a expressão relativa do gene de manutenção,

ciclofilina. amostras de cancro foram expressos em relação à mucosa e normalizadas para a expressão relativa do gene de manutenção. Em pares M1T1 para M4T4 e em M8T8, tanto

c-MYC

e

IRS1

aumento da CRC em relação à mucosa, apenas em M5T5 e M6T6

IRS1

e

c-MYC

discordam (

IRS1

:

P

= 0,05,

c-MYC

:

P Art 0,001, teste t não pareado sobre os meio de todas as diferenças, dados não mostrados). O painel B mostra a análise de Western blot de IRS1, subunidade beta do receptor de insulina (InsRß), subunidade beta do receptor do factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF1Rß), SS-catenina e ß-actina, como controlo de carga, no cólon emparelhado mucosa e amostras de CRC mostrado em a (excepto M6T6, para que o tecido para análise de western blot não estava disponível). Os histogramas no Painel C mostram quantitations, após a normalização para ß-actina, do IRS1, InsRß, IGF1Rß e sinais de ß-catenina. Em relação à mucosa emparelhado, IRS1 é abundante na CRCs de pares M1T1-M4T4, juntamente com InsRß, IGF1Rß e ß-catenina (IRS1:

P

= 0,017, InsRß:

P = 0,044

, IGF1Rß:

P Art 0,001, ß-catenina:

P Art 0,001, teste t não pareado sobre os meios de todas as diferenças, os dados não mostrados). Notavelmente, os CRCs que overexpressed o IRS1, proteínas InsRß, IGF1Rß e ß-catenina também sobre-expresso

IRS1 Comprar e c-

MYC

mRNA.

Para explorar a modulação da IRS1 e de outros componentes da via de insulina /IGF, foram avaliadas por western blot os níveis de proteína de IRS1, InsRß, IGF1Rß e ß-catenina em 7 dos 8 casos de CRC acima relatados (para o qual o tecido estava disponível) e, em mucosa e adenoma amostras do cólon emparelhados de dois pacientes FAP independentes [33]. Nos CRCs primárias os níveis de proteína IRS1 refletiu os níveis de mRNA, sendo maior, em relação à mucosa emparelhado, em 4 dos 5 casos que overexpressed

IRS1

e

c-MYC

mRNA. Estes CRCs também sobre-expressa InsRß, IGF1R, e SS-catenina, enquanto que nos outros casos, os níveis de mucosas InsRß, IGF1R, e SS-catenina eram semelhantes ou superiores aos da CRC emparelhados (Figura 1B-C). Nos dois casos FAP, IRS1 aumentou acentuadamente no adenoma em relação à mucosa, juntamente com InsRß, IGF1Rß e ß-catenina e IHC mostraram IRS1 difusa em adenomas (Figura S1).

Nós ainda avaliada a expressão da proteína IRS1 por IHC em secções embebidas em parafina individualmente combinados de mucosa do cólon, primário e metastático CRC. Vinte e quatro casos com CRC primária emparelhados e metástases hepáticas, incluindo também mucosa do cólon câncer não envolvido, estavam disponíveis para análise. IRS1 imunorreactivo foi claramente detectável em enterócitos das criptas, bem como no primário e metastático CRC (Figura 2A-E). Os tumores primários e metastáticos, quando comparado com o epitélio do cólon, continha os números mais elevados de células que expressam IRS1 (80,8 ± 6,2% para o primário e 81,3 ± 6,6% para CRC metastático contra 59,1 ± 5,6% para o epitélio colónico,

P =

0.013 e

P

= 0,014, respectivamente, Figura 2F). Os valores de densidade de pixels para IRS1, como quantificados usando software ImageJ, não diferiu entre CRC primário e epitélio do cólon, mas foram significativamente maiores em metástases hepáticas em relação ao CRC (

P Art 0,01) e epitélio do cólon (

P

0,01) (Tabela 1). Diferenças nos valores de densidade de IRS1 entre epitélio do cólon da cripta inferior e superior não foram significativas. Nós exploramos ainda mais as correlações patológicas de expressão IRS1 em uma série de 163 CRCs primários ensaiados por IHC em TMA (Tabela 2). No geral 151/163 casos (92,6%) foram IRS1-positivo. expressão IRS1 não diferiram significativamente em relação à idade no momento do diagnóstico, sexo, localização do tumor (certo ou cólon esquerdo), estágio de Duke e status MSI. No entanto, CRCs com elevada diferenciação /moderada foram mais propensos a mostrar elevadas percentagens de células IRS1-positivas do que tumores pouco diferenciados (

P

= 0,001), enquanto CRCs com fenótipo mucinoso /anel de sinete foram associados com focal ou nenhuma IRS1 (

P Art 0,001). CRCs pouco diferenciados muitas vezes se manifesta coloração nuclear, além de reactividade citoplasmática. Figura 3A-E exemplifica padrões de coloração IRS1.

O painel A mostra imunocoloração IRS1 nos cortes longitudinais de comprimento total de criptas do cólon câncer não envolvido. Os painéis B-E fornecem um exemplo de IRS1 imunocoloração em CRC primário (B-C) versus metástase emparelhado (núcleo de biópsia hepática, D-E). Ambos mostram IRS1 citoplasmática difusa, com a imunocoloração muito mais forte em células metastáticas. Painel F mostra os histogramas das porcentagens médias de células IRS1-positivos em 24 casos de correspondência epitélio do cólon não-neoplásica, CRC primário e câncer colorretal metastático (barras de erro significa ± SEM). Houve diferenças significativas entre epitélio do cólon (59,1 ± 5,6%) e CRC primário (80,8 ± 6,2%,

P

= 0,013 pelo teste independente amostra t) e entre o epitélio (59,1 ± 5,6%) e metástases hepáticas ( 81,3 ± 6,6%,

P

= 0,014). A diferença entre CRC primário e metastático não foi significativa (

P

= 0,964).

Os painéis A e B mostram respectivamente IRS1 citoplasmática difusa em CRCs colorretais não-mucinoso, incluindo um moderadamente tumor diferenciado, com forte imunomarcação das células cancerosas, e um tumor pouco diferenciado, com mais fraco e, possivelmente, também nuclear IRS1 (setas). Painéis C-E mostram uma CRC pouco diferenciados com mucinoso, principalmente fenótipo anel de sinete. Nomeadamente, na zona marginal (asterisco single) detalhado no painel D, as células tumorais com não-mucinoso fenótipo mostram nuclear /perinuclear IRS1 (setas), enquanto que as células em anel de sinete que flutuam na mucina (asterisco duplo), detalhadas no painel E, fazer não mostrar IRS1 imunocoloração.

Como mostrado na Tabela 3, que relata as correlações de Spearman entre os marcadores IHC, IRS1 foi positivamente associado com Ki67 (

P = 0,008

), p53 (

P

= 0,032), membrana (

P

= 0,001) e citoplasmática (

P Art 0,001) ß-catenina. Outras associações envolvidas ß-catenina membrana celular, correlacionou positivamente com citoplasmática ß-catenina (

P Art 0,001) e EGFR (

P

= 0,005), e citoplasmática ß-catenina, correlacionou positivamente com ß-catenina nuclear (

P Art 0,001), Ki67 (

P

= 0,002) e p53 (

P

= 0,009), enquanto ß-catenina nuclear positivamente correlacionada com p53 (

P

= 0,049). Previsivelmente, uma correlação positiva foi encontrada entre Ki67 e p53 (

P

= 0,029).

Estes resultados sugerem que a alta IRS1 está associada com CRCs que combinam bem fenótipo histológico /moderadamente diferenciado com marcadores imunoistoquímicos de mau prognóstico (expressão de Ki67, p53, e citoplasmática ß-catenina).

IRS1 em Caco-2 polarização

Caco-2 transporta uma mutação APC inativação com o segundo hit por LOH , mas é conhecido por ser negativo para mutações no

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e

PTEN

[23], [31] (ver também COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic). Células Caco-2 são capazes de diferenciação espontânea, documentada pela expressão das microvilosidades, enzimas e transportadores característicos dos enterócitos polarizadas e pelo desenvolvimento de junções apertadas, que, no

In vivo

configuração, são necessários para cima migração de células epiteliais de cripta em direcção à superfície da mucosa [28], [29], [34]. IRS1 expressão e activação foi analisado por western blot em Caco-2 culturas durante polarização em 3, 7 e 14 dias após a confluência, na presença e na ausência de soro, em conjunto com a expressão de InsRß e IGF1Rß (Figura 4A). Sob ambas as condições de cultura IRS1 diminuiu no dia 7, mas aumentou subsequentemente, com maior expressão no dia 14. Notavelmente, em ambas as culturas normais e isentas de soro, InsRß resultaram fracamente expresso no dia 3 e aumentou significativamente no dia 7, com expressão máxima em dia 14. Inversamente, novamente sob ambas as condições, IGF1Rß foi maior no dia 3 e diminuiu drasticamente nos dias 7 e 14. Para avaliar a activação IRS1, Caco-2 células em 3, 7 e 14 dias de confluência foram privadas de soro durante a noite e, em seguida, estimuladas com ou sem insulina (100 nM) ou IGF-1 (10 nM) durante 5 min. lisados ​​de proteína total (80 ug) obtido após 5 min do tratamento foram resolvidos e apagou com anti-pIRS1 Tyr632 (Figura 4G). fosforilação IRS1 tirosina foi relevante no dia 7 de polarização e não pareceu ser modulada por insulina exógena ou IGF1 (pista 4-6). No entanto, no dia 3, apenas exógena IGF1 activado IRS1. Estes dados sugerem que IRS1 poderia mediar autocrinely-activado InsR sinalização em células polarizadas (onde IRS1 e InsRß são maximamente expressos e IGF1Rß é menor), e a sinalização do IGF1R, activado por IGFs exógenos, em células pré-polarizado (onde IRS1 é expresso em menor nível e IGF1Rß InsRß e em níveis mais elevados e mais baixos, respectivamente)

.

o painel a mostra uma análise de western blot de IRS1, subunidade beta do receptor de insulina (InsRß), subunidade beta do receptor do factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1Rß) e ß-actina, como controlo de carga, em células Caco-2 no dia 3, 7 e 14 pós-confluência, duplicado na ausência (-) e presença (+) de soro no meio de cultura. Os histogramas mostram quantitations, após a normalização para ß-actina, dos sinais IRS1, InsRß e IGF1Rß (significa ± SE dos dois experimentos). Sob tanto a cultura condições aumento espression de IRS1 e InsRß é claramente evidente em células polarizadas no dia 14 (IRS1) e nos dias 7 e 14 (InsRß), enquanto expressão máxima do IGF1Rß é detectada apenas no dia microscopia eletrônica 3. Transmissão de Caco- 2 as células no dia 3 do decurso de tempo de polarização espontânea revela formar junções densos em electrões no ápice das membranas laterais de células adjacentes (painel a, seta). Com a progressão da polarização, junções apertadas e desmosomes (painéis C-D, setas) e junções de adesão (painel D) tornam-se evidentes como placas elétron-densas nas membranas laterais adjacentes nos dias 7 e 14, respectivamente. Além disso, os clusters multicelulares apertados, com características de diferenciação, tais como Lumina intracelular rica da borda em escova apical (painéis E-F), tornam-se evidentes no dia 14. Abreviaturas: tj, junção apertada; anúncio, junção de adesão; ds, desmosome. Painel G mostra os níveis de transferência de Western de IRS1 tirosina 632 fosforilado (IRS1tyr632) e, como controlo de carga, de ß-actina, em células Caco-2 privadas de soro não estimuladas (-) e estimulada (+) com a insulina (100 nM) ou IGF1 (10 nM). IRS1 a fosforilação da tirosina é relevante no dia 7 de polarização, de forma independente a partir da adição de insulina exógena ou IGF1. No entanto, no dia 3, apenas exógena IGF1 determina fosforilação IRS1.

A microscopia eletrônica de transmissão dos Caco-2 culturas documentados no dia 3 a formação de áreas elétron-densas localizadas perto da oposição entre o plasma de lateral adjacente membranas, característicos de formar junções apertadas, e no dia 14, a presença de complexos juncionais intercelulares completas, bem como de polarização da borda em escova de absorção apical (Figura 4B-F). Em geral, este confirmou enterocytic polarização durante o curso de tempo de cultura [28].

Análise por imunofluorescência demonstraram diferenças na distribuição subcelular de IRS1 total e de Tyr632 pIRS1 durante o curso de tempo de cultura de Caco-2 (Figura 5). No dia 3 imunomarcação IRS1 era nitidamente menos intensa do que nos dias 7 e 14, e foi predominantemente localizadas ao longo das membranas celulares laterais e basolateral. A fusão das imagens SS-catenina e IRS1 confirmou a co-localização das duas proteínas ao longo das membranas basolaterais. No dia 3, a coloração de pIRS1 Tyr632 foi relativamente fraca e que teve uma distribuição semelhante à da IRS1 total. No dia 7 pIRS1 Tyr632 aumentou e apareceu como principalmente coloração pontilhada no topo de células da superfície, sugestivo de localização por baixo da membrana de plasma no lado apical. Total de IRS1 permaneceu predominantemente localizadas ao longo das membranas basolaterais, juntamente com ß-catenina. Notavelmente, no dia 14 pIRS1 Tyr632 foi restrito a poucas células superficiais, o qual, no entanto, apareceram mais fortemente marcadas do que no dia 7, com o padrão ponteada membrana plasmática apical normal (o menor número de células positivas foi consistente com a diminuição da pIRS1 Tyr632