Abstract

hipóxia localizada em tumores sólidos ativa programas de transcrição que promovem a transformação metastático de células. Como hypoxia-inducible hiper-vascularização, a perda da proteína do retinoblastoma (Rb) é uma característica comum a estágios avançados da progressão do tumor em muitos cancros metastáticos. No entanto, nenhuma ligação entre o papel do Rb e processos metastáticos orientado a hipóxia foi estabelecida. Nós demonstramos que Rb é um mediador chave da resposta hipóxica mediada por HIF1α /β, o principal regulador da resposta a hipoxia, e a sua co-activador essencial, o receptor da hormona da tiróide /proteína que interage com retinoblastoma (TRIP230). Além disso, a perda de Rb desmascara o potencial de co-activação completa de TRIP230. Usando pequenos abordagens RNA inibitório

in vivo

, estabelecemos que Rb atenua a resposta fisiológica normal à hipóxia por HIF1α. Notavelmente, a perda de Rb resulta em alterações bioquímicas dependente de hipóxia que promovem a aquisição de um fenótipo invasivo em células de cancro da mama MCF-7. Além disso, Rb está presente em HIF1α-ARNt /HIF1β complexos transcricionais associadas com TRIP230 como determinado por ensaios de co-imuno-precipitação, GST-pull-down e chip. Estes resultados demonstram que Rb é um modulador negativo da transcrição regulado por hipoxia em virtude dos seus efeitos directos sobre o complexo de HIF1. Este trabalho representa a primeira ligação entre a ablação funcional do Rb em células tumorais e activação da transcrição HIF1α-dependente e invasão

Citation:. Labrecque MP, Takhar MK, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang TY, et ai. (2014) um complexo de proteínas TRIP230-Retinoblastoma Regula hipoxia-inducible factor-1α-Mediated Transcrição e Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10.1371 /journal.pone.0099214

editor: Sonia Rocha, University of Dundee, Reino Unido

Recebido: 05 de março de 2014; Aceite: 12 de maio de 2014; Publicação: 11 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Labrecque et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos no manuscrito

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento a partir da Canadian Breast Cancer Foundation BC /Yukon (https://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) e as Natural Sciences and Engineering Research Council, RGPIN 356355 (https://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) do Canadá para TVB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hipoxia inducible factor-1α (HIF1α), sua orthologue HIF2α, e seu parceiro de dimerização do receptor de hidrocarboneto aromático translocator nuclear, (ARNT ou HIF1β) que compõem o HIF1 complexo [1], [2] regula a a resposta da célula para condições de baixa de oxigênio. Em tecido saudável, o complexo HIF1 dirige a expressão ordenada e bem regulamentado de genes controlando o

de novo

síntese de nova vasculatura para apoiar o crescimento do tecido ou tecido re-perfusão. Durante a hipóxia, HIF1α acumula, se transloca para o núcleo, e liga-se ARNT. Os HIF1 recrutas complexos co-activadores incluindo CBP /p300 [3], e Brm /Brg-1 [4] e activa a expressão de genes, tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), eritropoietina (EPO) e os marcadores metastáticos, CXCR4 e lisil procolagénio hidroxilase 2 (PLOD2) [1], [5], [6]. As evidências sugerem que o complexo de HIF1 podem activar a expressão de genes de forma independente ou em conjunto com outros factores de transcrição [7], [8]. Demonstração de que HIF1α é capaz de interagir com a c-Myc, Notch e mais recentemente Foxa2 para dirigir a transcrição ordenada e aumentar a formação de tumor [9] – [11], deixa em aberto a possibilidade de que o complexo de HIF1 é uma unidade de transcrição do núcleo que modula a sinalização intracelular múltipla redes, muitos dos quais podem estar envolvidos na transformação metastática. Assim, muitas das moléculas que controlam diferentes aspectos da função de HIF1 ainda têm de ser identificados.

O complexo HIF1 realiza esta função através do recrutamento de proteínas co-activadores transcricionais incluindo o receptor da hormona da tiróide /em proteínas que interagem com retinoblastoma 230 (TRIP230) para as regiões reguladoras de genes de hipóxia-responsivo para activar a transcrição [12]. TRIP230, foi inicialmente identificado como um receptor da hormona da tiróide (TR) -interacting proteína que actividade melhorada TRs [13]. Além disso, TRIP230 foi isolado como parte do processo de co-activador P160 complexo de [14], um bona fide ARNT co-activador complexo [15]. Importante, nós demonstramos que TRIP230 é recrutada por ARNT como um co-activador transcricional, e é essencial para a actividade de transcrição do complexo de HIF1 [12]. Além disso, foi mostrado que TRIP230 interage com Rb e que Rb atenua TRIP230-enhanced impulsionado-TR transcrição [16]. Este e um estudo subsequente demonstrou que apenas a forma hiper-fosforiladas de Rb interage com TRIP230 [17] destacando uma função para distinta Rb a partir da sua regulação canónica E2F-dependente do ciclo celular, específica para a sua forma hipo-fosforilado.

perda de

RB1 ​​

, o gene que codifica para Rb [18], e ou perda de função de RB for associada com o desenvolvimento e progressão metastática de diversos outros tumores sólidos, incluindo os cancros do ovário, pulmão, da mama, da próstata e do cérebro [19] – [23]. A função melhor compreendido de Rb é o de célula regulador de ciclo reprimindo função do factor de transcrição E2F, assim, mediar a proliferação e diferenciação celular [24]. a progressão do ciclo celular hipo-fosforilada blocos Rb ligando-se a factores de transcrio E2F e que afecta os resultados de transcrição E2F-dependentes. Fá-lo através do recrutamento de proteínas repressores da transcrição-remodelação da cromatina tais como sin3a /b, HDACs, SUV39H1 e DNMT1 [25] – [27]. Hyper-fosforilada Rb não consegue reprimir E2F e lhes permite activar ou reprimir vários programas de expressão gênica [24].

Estudos recentes sugerem que Rb podem ter papéis fisiológicos para além da sua função de E2F canônica [28]. Anteriormente, demonstrou uma interação direta entre TRIP230 e ARNT [12]. Além disso, foi demonstrado que TRIP230 era indispensável para a transcrição mediada por dois parceiros de dimerização distintos de ARNT, ou seja o receptor de hidrocarboneto de arilo e HIF1α [12]. Neste relatório, nós fornecemos a primeira evidência para a existência de um complexo de Rb-TRIP230-ARNT que medeia a transcrição HIF1. Além disso, demonstra-se que Rb atenua a actividade de complexos de transcrição ARNT em virtude da sua associação com TRIP230 e independente de E2F. Em última análise, este trabalho revela a capacidade de Rb para modular a expressão de genes ativados por HIF1 com consequências para a transformação de células cancerígenas.

Resultados

regulada por HIF1 Gene Expression é reforçada por siRNA knock-down de Rb

TRIP230 é conhecido por ligar diretamente a TR e ARNT [12], [16]. Dado que a hiper-fosforilada-Rb reprime a atividade TR co-activado TRIP230 [16], [17] e que a expressão TRIP230 é necessário para a atividade transcricional dos parceiros Arnt, AHR e HIF1α [12], a hipótese de que Rb pode atenuar a hipóxia transcrição do gene induzível. A fim de examinar o papel de Rb sobre a acumulação de espécies de ARNm do gene alvo hipoxia-induzida, que empobrecido Rb em linhas de células de cancro humano por gene siRNA mediada

knock-down

. células MCF7 e LNCaP foram transfectadas quer com mexidos (SCX) ARNsi de controlo ou dois siRNAs-específicos Rb e acumulação de ARNm de genes alvo HIF1 expostas a normoxia e hipoxia foram comparadas (Figura 1). Rb RNA e proteína foram equivalentemente suprimida em ambas as condições de normóxia e hipóxia (Figuras 1A e E). Nenhuma mudança foi observada no CXCR4 ou a expressão de VEGF em Rb siRNA células transfectadas sob condições de normóxia, no entanto, um aumento da acumulação de ARNm PLOD2 sob condições de normóxia foi observada em células MCF-7 (Figura 1D), mas não em células LNCaP (Figura 1E). Além disso, as células MCF-7 transfectadas com os siRNAs Rb específicas-exibiram aumentaram significativamente a acumulação de ARNm de genes alvo HIF1 CXCR4, VEGF e PLOD2 sob condições hipóxicas (Figura 1B-D). Foi observado um efeito dependente da hipoxia semelhante na indução de CXCR4, VEGF e PLOD2 em resposta à expressão Rb suprimida em células cancerosas próstata LNCaP (Figura 1E), sugerindo que esta observação não é tipo de célula específico.

células MCF7 (A , B, C e D) e células LNCaP (e) foram transfectadas com qualquer mexidos siRNA (SCX) ou Rb siRNAs SIRB 1, e SIRB 2. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram ou mantidas sob condições de normóxia ou S

2 durante mais 24 h. A expressão de genes foi determinada por quantitativa PCR em tempo real após o isolamento e transcrição reversa do RNA total. VEGF, CXCR4, PLOD2 e expressão Rb foram normalizados para a expressão do gene 36B4 constitutivamente ativo. barras abertas representam normoxia (20% O

2) e fechada (cinza) barras representam hipoxia (1% O

2). As barras de erro representam ± S.D. * P . 0,05

Rb e Rb-associados proteínas Repressoras são recrutados para as regiões reguladoras de genes induzido por hipóxia durante a transcrição ativado

Foi observado que a perda de Rb resultou na expressão exagerada de genes alvo HIF1 de um modo dependente-hipoxia. Assim, estávamos interessados ​​para determinar se a presença de Rb podia ser registada ao longo das regiões reguladoras de genes regulados por HIF1 albergando elementos de resposta a hipoxia bem caracterizados durante a transcrição activada; ou seja, o promotor de VEGF e a EPO potenciador. Um esquema destas regiões e a colocação de oligonucleótidos para a amplificação por PCR de cromatina estão representadas na Figura 2A. imuno-precipitação análise da cromatina (ChIP) revelou que os associados do Rb com regiões reguladoras dos genes regulados por HIF1, VEGF e a EPO de um modo dependente-hipóxia em células MCF7 (Figura 2B). Para garantir que as nossas condições experimentais produzidos a resposta adequada à hipóxia, também precipitou cromatina com anticorpos para HIF1α, ARNT, TRIP230 ou IgG de coelho de controlo. IgG controle era incapaz de precipitação de cromatina contendo as regiões reguladoras de VEGF e de EPO. Como já demonstrado anteriormente [12], que eram mais facilmente capazes de amplificar cromatina precipitado de hipóxia tratada lisados ​​do que de os derivados de lisados ​​mantidos sob condições de normóxia utilizando os anticorpos HIF1α, Arnt, TRIP230 e Rb. Poderíamos ampliar baixos níveis de promotor de VEGF e EPO potenciador sob condições de normóxia (Figura 2B) quando precipitando cromatina com a nossa anticorpo TRIP230, portanto, não podemos descartar a possibilidade de que TRIP230 associados com HRE em níveis baixos apesar da tensão de oxigênio normal. No entanto, a nossa incapacidade para detectar proteína HIF1α ou HIF2α sob essas condições (Figura 2C) sugere a possibilidade de que Rb não é recrutado para estas regiões HRE sob condições de normóxia.

(A) Um esquema do promotor proximal de VEGF e EPO intensificador e a localização relativa dos oligonucleótidos usados ​​para amplificação por PCR. (B) O estado de HIF1α, ARNT, TRIP230, e Rb no promotor de VEGF e a EPO potenciador em células MCF-7 tal como ensaiado por cromatina-imuno-precipitação (ChIP) e reacção em cadeia da polimerase (PCR) e em comparação com amplificação reacções derivadas a partir de lisados precipitado com IgG de controlo. Todos os chips foram realizadas pelo menos três vezes excepto quando indicado. Os níveis de proteína (C) HIF1α e HIF2α são drasticamente enriquecido durante a hipóxia em células MCF-7. As células MCF7 foram mantidas em cultura em qualquer dos 20% ou 1% de O

2 durante 24 h. Os extractos nucleares foram analisados ​​por imuno-mancha e as membranas foram sondadas com anticorpos purificados por afinidade para HIF1α e α-tubulina. ChIP sequencial do promotor VEGF proximal e EPO potenciador utilizando quer anti-HIF1α (D) ou os anticorpos purificados por afinidade anti-ARNT (e), seguido por imuno-precipi tacão com anti-TRIP230 e anticorpos anti-Rb. (F) do chip do promotor de VEGF, depois em células MCF-7 após a transfecção com quer mexidos siRNA ou siRb1 e imuno-precipi tacão com anticorpo anti-TRIP230. Os valores são expressos como o enriquecimento de dobragem sobre o controle e foram determinados por quantitativa PCR em tempo real. Cada valor experimental foi corrigido para a entrada e as experiências foram realizadas duas vezes. (L) a análise imuno-blot de lisados ​​de células MCF7 transfectadas com ARNsi utilizados em experiências de chip. (H) ChIP de Rb-repressor proteínas complexas em células MCF-7. As células foram tratadas como descrito acima e complexos de cromatina foram isolados com anticorpos purificados por afinidade dirigidos a sin3a, Sin3b e HDACs 1-3.

Nós expandimos nossas investigações na tentativa de determinar se TRIP230 e Rb tem a capacidade de interagir com elementos de DNA individuais em concerto com HIF1α e ARNT em elementos de resposta a hipóxia. Foi realizado um ensaio de ChIP de duas etapas sequenciais, em primeiro lugar isolar cromatina com anticorpos purificados por afinidade para ARNt ou HIF1α seguido por precipitação destas fracções de cromatina purificado com anticorpos para TRIP230 e Rb. Em cada promotor caso VEGF ADN foi amplificado por PCR de um modo dependente da hipoxia (Figura 2D e E) sugerindo fortemente que HIF1α, ARNT, TRIP230 e Rb estão presentes em HRE em um complexo multi-proteico. Além disso, knock-down de Rb como avaliado por imuno-mancha (Figura 2G), não resultou em posterior enriquecimento de TRIP230 no promotor de VEGF (Figura 2F), sugerindo que Rb não interfere com TRIP230 recrutamento de elementos responsivos HIF1.

Por fim, estávamos interessados ​​para ver se conhecidos complexos repressores Rb-associados [26], [27] estavam presentes na estes elementos durante a transcrição orientada por hipóxia. análise ChIP revelou a sin3a /b, HDAC1 e HDAC3 foram enriquecidos nas regiões reguladoras HIF-responsiva, tanto do VEGF e genes EPO em condições de hipóxia (Figura 2H) que apoiam a nossa hipótese de que Rb é parte do repressor atuação complexo transcricional em HIF1-regulada transcrição. Em contraste, HDAC2 se comportou de uma forma mais canónico e foi demitido dessas regiões de uma forma dependente da hipóxia (Figura 2H). Estes dados sugerem que as proteínas repressores da transcrição são recrutados para genes regulados por hipoxia durante a transcrição activada. Além disso, estas observações apoiam a hipótese de que a transcrição deve ser atenuado para assegurar a resposta transcricional apropriado.

ARNT e TRIP230 são essenciais para Rb-regulação do HIF1 Atividade

proteínas

Uma vez que Rb e TRIP230 estão interagindo , os quantitativos experiências de RT-PCR foram repetidos utilizando um ARNsi dirigido para TRIP230. indução do gene hipóxica da acumulação de ARNm de CXCR4 foi severamente prejudicada em cima knock-down de TRIP230 (Figura 3A e B). Knock-down de Rb sob estas condições, como evidenciado por análise de imuno-mancha (Figura 3B) não resultou em qualquer aumento significativo em ARNm de CXCR4, proporcionando mais provas de que o efeito é dependente de TRIP230. Imagens de inteiros imuno-manchas podem ser encontrados na Figura S1. Além disso, a perda de Rb não levou a um aumento da acumulação de ARNm de CXCR4 nas células submetidas à ablação por ARNT por mediada por siRNA knock-down ainda mais o que sugere que o efeito mediado pelo símbolo Rb representa (Figura 3C e D) dependente da hipoxia. Além disso, a supressão mediada por siARN da expressão DP1 em células MCF7 respondeu a hipóxia tão prontamente como as células de controlo (Figura 3C e E), indicando que a função moduladora de Rb em genes regulados por HIF é independente de E2F e desacoplado do papel canónica de Rb como um mediador do ciclo celular. As células MCF7

(a) foram transfectadas com qualquer mexidos siRNA (SCX) ou Rb siRNAs SIRB 1, e SIRB 2, ou uma combinação de TRIP230 siRNA e siRb1. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram ou mantidas sob condições de normóxia ou 1% O

2 durante mais 24 h. A expressão de genes foi determinada por quantitativa PCR em tempo real após o isolamento e transcrição reversa do RNA total. expressão CXCR4 foi normalizada para a expressão do gene 36B4 constitutivamente ativo. (B) Análise de Imuno-blot de TRIP230 e Rb após siARN transfecção ou com ARNsi mexidos, ou uma combinação de siTRIP230 e SIRB. Alfa-tubulina (α-tubulina) foi utilizada como um controlo de carga. células (C) MCF7 foram transfectadas com ARNsi quer mexidos (SCX) ou Rb siRNAs SIRB 1, e SIRB 2, ou ARNT, ou DP1 siRNA ou de uma combinação de ARNT /Rb1 siRNA e tratada tal como descrito acima. (D) Immuno-blot de ARNT e α-TUB após transfecção com qualquer mexidos controle de siRNA direcionado para ARNT. (E) Immuno-blot de DP1, TRIP230 e α-tubulina (α-tubulina). células MCF-7 foram transfectadas com qualquer mexidos controlo (SCX) ou siARN direccionado para DP1. Os dados da Figura 3A e 3C foram analisados ​​por meio de uma de duas vias-ANOVA. * P . 0,01

Perda de Rb leva a um aumento no gene alvo HIF1 Protein Expression

Estávamos interessados ​​para determinar se o efeito de Rb-loss na acumulação de mRNA foi refletido ao nível das proteínas de genes alvo HIF1 e, em particular, se factores pró-metastáticos foram afectados. Assim, também examinámos o papel de Rb na expressão de marcadores metastáticas a jusante que são sensíveis a hipoxia. Perda de Rb resultou em um aumento concomitante nos níveis de proteína CXCR4 após 48 horas de hipóxia e PLOD2 após 96 horas de hipóxia (Figura 4A). Além disso, uma 24 horas de exposição a hipoxia com Rb knock-down também resultou num aumento na expressão do marcador mesenquimal, vimentina (Figura S2A). Além disso, a perda de Rb não aumentou os níveis endógenos de HIF1α (Figura 4A), sugerindo que o efeito hipóxico observada não era devida a um aumento na expressão ou estabilidade HIF1α. Finalmente, os relatórios anteriores demonstraram que TRIP230 associados com Rb hiper-fosforilada [16], [17]. Os lisados ​​immunoblotting de células MCF7 e de LNCaP com anticorpos dirigidos para Rb, Rb-fosfo-serina

780 e Rb-fosfo-serina

807/811 demonstrar que há uma quantidade significativa de Rb fosforilado em células MCF7 e LNCaP células (Figura 4B).

células MCF7 (a) foram transfectadas com ARNsi quer mexidos (SCX) ou Rb siRNAs SIRB 1, e SIRB 2. Rb, CXCR4, HIF1α, PLOD2 e os níveis de proteína alfa-tubulina foram avaliada por imuno-blot após a exposição ao O atmosférico

2 ou 1% O

2 para 48 (Rb e CXCR4) ou 96 h (HIF1α e PLOD2). (B) imuno-blots de lisados ​​de células inteiras a partir de MCF7 e LNCaP, ou deixados em normoxia (N) ou tratados com 1% de O

2 durante 6 h (h). As manchas foram sondadas com anticorpos primários para o total de Rb, Rb-fosfo-serina

780 (Rb-pS

780), Rb-fosfo-serina

807/811 (Rb-pS

807/811 ), ou α-tubulina como um controle de carga.

Perda de Rb promove uma invasiva fenótipo de células cancerosas da mama MCF7

a capacidade do Rb knock-down para melhorar HIF1 transcricional complexo actividade e a expressão da proteína levou-nos a avaliar se a supressão Rb pode também aumentar a invasão celular induzida por hipoxia em células de cancro da mama MCF7, tradicionalmente, não-invasivos [29]. Para as células com um complemento completo de Rb (isto é, as células transfectadas com controlo SCX siRNA), a hipoxia não teve efeito na invasão de células de MCF7 em matrigel (Figura 5A e B). No entanto, siRNA knock-down de Rb levou a um aumento da invasão de células MCF-7 sob condições hipóxicas, mas não teve efeito na invasão sob condições de normóxia (Figura 5A e B). Estes dados apoiam o papel de Rb como um supressor de tumor de programas metastáticos regulado por hipoxia.

Vinte e quatro horas após o siARN da transfecção, as células foram submetidas ao ensaio de invasão de Matrigel. As placas foram incubadas em normóxica (20% O

2) ou condições de hipoxia (1% de O

2) a 37 ° C durante 24 h e células invasoras foram fixadas e visualizada com azul de toluidina. As fotomicrografias (A) de células MCF7 embebidos em Matrigel. (B) a representação numérica da invasão relativa de células MCF7 embebidos em Matrigel após o tratamento com SCX ou SIRB e exposição a condições de normóxia ou hipóxia (n = 6), (C) knock-down de Rb em células MCF-7 não altera a proliferação de células em resposta a CoCl

2. As células foram transfectadas com ARNsi de, tal como descrito acima. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com o veículo ou 100 uM CoCl

2 para activar HIF1α e as células foram contadas às 0, 6, 12, 24, 36 48, e 72 h mais tarde. As barras de erro representam ± S.E.M. * P . 0,01

estavam preocupados que o aumento da capacidade de invasão pode ser devido a um aumento dramático na proliferação celular devido à perda de controlo Rb do ciclo celular. Para evitar períodos de prolongado, hipoxia grave, foi demonstrado que o agente de estabilização HIF1α CoCl

2 que imitam os efeitos de hipóxia no ensaio de Matrigel (Figura S2C). Estes dados suportam ainda mais a nossa hipótese de que os efeitos observados são mediados através do complexo de HIF1. Com CoCl

2 estabelecida como um imitador eficaz de hipoxia após knock-down de Rb no ensaio de Matrigel, fomos capazes de determinar se o aumento observado na invasão de células era devido a um aumento na proliferação de células (Figura 5C). dinâmica de crescimento das células MCF7 foram monitorizados em intervalos regulares por meio da contagem de células viáveis ​​ao longo de um período de 72 h. Em células transfectadas com SCX ARNsi de controlo ou Rb siRNA e com amostras separadas de cada mantida quer na presença ou ausência de CoCl

2, observou-se que a perda de Rb diminuição da proliferação tanto em não-tratados e CoCl

2 células tenha sido tratada com (Figura 5C) sem diferença significativa entre os outros tratamentos. Da mesma forma, matrigel invasão das células de controle SCX era indistinguível sob qualquer condição. Separação de células após coloração com iodeto de propidio revelaram uma maior proporção das células knock-down Rb na fase sub-G1 do ciclo celular (Figura 5D e E). Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que a perda de Rb promove a invasão de células de uma forma dependente da hipoxia e que estes efeitos não são, devido ao aumento do número de células ou proliferação.

Rb Associados com o PAS-B /TRIP230- interacção do domínio da proteína ARNT

a possibilidade de que ARNT, TRIP230 e Rb pode ser parte de um complexo multimérico foi explorada por imuno-precipi tacão de complexos TRIP230 associado a partir dos extractos nucleares de células MCF-7 incubadas durante 6 h sob hipóxica condições (Figura 6A). A análise imuno-blot revelou ARNT e Rb estar presente no anti-TRIP230 imuno-precipitado enquanto que nenhum dos três factores foram detectadas em precipitados de lisados ​​realizados com IgG não-imune. Estes resultados fornecem uma forte evidência de que a proteína TRIP230 nativa é capaz de interacções proteína-proteína com ARNT e Rb.

(A) Imuno-blot dos complexos precipitados utilizando quer um anticorpo monoclonal de ratinho dirigido para TRIP230 ou controlo de IgG de ratinho a partir de os extractos nucleares de células MCF7. As manchas foram sondadas para a presença de TRIP30, ARNT e Rb. A faixa da esquerda de cada blot contém extrato nuclear representando 10% da entrada. (B) GST-ARNT-PAS-B é capaz de puxar para baixo TRIP230 e Rb. A análise imuno-blot de GST-ARNT-PAS-B suspenso e GST pull-down de TRIP230 e Rb a partir de extractos nucleares MCF7. porções GST foram fixados a contas de glutationa-agarose e incubada durante 90 min a 4 graus C com 500 ug de extracto nuclear de células MCF7. pistas de entrada foram carregadas com 250 ug de extracto nuclear. borrões completas para os painéis A e B podem ser encontrados em Suplementar Figura S1. GST-ARNT-PAS-B é capaz de puxar para baixo fosforilada Rb. (C) Análise de Immuno-blot de GST-ARNT-PAS-B suspenso e GST pull-down de Rb-fosfo-serina

780 (Rb-pS

780) a partir de MCF7 extractos nucleares colhidos a partir de células esquerda em normoxia (N) ou tratados com 1% de O

2 durante 6 h (h). ensaio imuno-precipitação (D) da cromatina de potenciador e VEGF regiões promotoras de EPO em células MCF-7 usando o controle ou Rb-fosfo-serina

780 anticorpos. As células foram tratadas tal como descrito acima. Rb atenua a co-activação TRIP230 mediada por actividade de transcrição ARNT-dependente. Os domínios Rb- e ARNT de interação são indicados. células Hepa-1c1c7 (E) e as células MCF7 (F) foram transfectadas com uma hipoxia responsivo luciferase 4xHRE-driven construir como um repórter, plasmídeos de expressão para TRIP230, TRIP230ΔRB e Rb tal como indicado e sujeitas a 1% O

2 ou atmosférico (20%) O

2 durante 24 h. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​quanto à actividade de luciferase. (G) Um esquema do mutante TRIP230ΔRB. níveis (H) TRIP230 proteínas não são afetados por transfecção de plasmídeo de expressão Rb em células Hepa1c1c7. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​por imuno-mancha e as membranas foram sondadas com anticorpos purificados por afinidade para TRIP230, Rb e α-tubulina. * P . 0,05

Dado que a anterior

in vitro

estudos de interacção determinou que Rb não interage diretamente com ARNT [30], nós, portanto, foram interessados ​​para determinar se a interação TRIP230 domínio dentro ARNT poderia ser utilizada para isolar Rb a partir de extractos nucleares de células MCF7. Partch e colegas identificaram que o domínio de interacção TRIP230 dentro ARNT situa-se na sua região PAS-B [31]. Nós fundido aminoácidos 344-479 albergando o domínio PAS-B expandida de ARNT rato para GST. Usando este domínio de interacção mínima foi feito, em parte, para reduzir o potencial de ARNT para interagir com outras proteínas nucleares. Suspenso de TRIP230 e Rb a partir de extractos nucleares de células MCF7 com ar-hipoxia foi dramaticamente enriquecido utilizando o domínio de GST-ARNT-PAS-B em comparação com GST sozinho (Figura 6B). Assim, é possível que um complexo de ARNT incluindo TRIP230 e Rb é formada através do domínio ARNT PAS-B. Este domínio medeia a interação entre ARNT e múltiplas co-ativadores que são essenciais para a transcrição ARNT mediada: ou seja, TRIP230 [12], os p160 /NCOA /SRC-família de co-activadores da transcrição [15], e cacau [32] .

Finalmente, nós fato para determinar especificamente, se Rb hiper-fosforilada estava envolvido na transcrição de genes regulados por HIF1. Nós sondado imuno-manchas com um anticorpo anti-fosfo-serina

anticorpo específico para o Rb 780 depois suspenso utilizando GST-PAS-B. Desta forma, observou-se Rb hiper-fosforiladas em transferências gerados a partir de extractos nucleares de células MCF7 de normóxia e de hipóxia (Figura 6c). Além disso, a interrogação das regiões reguladoras da transcrição do promotor de VEGF HRE e contendo EPO potenciador revelou a presença de Rb-pSer

780 numa forma dependente da hipoxia (Figura 6D).

TRIP230 medeia a Efeitos repressivas do Rb em regulado pelo HIF Transcrição

Nós estabelecemos que Rb co-purifica com TRIP230 e que Rb atenua o acúmulo de mRNA do gene alvo hipoxia-inducible e os níveis de proteína. De modo a determinar se a capacidade de Rb para modular a actividade transcricional regulada por HIF1 foi mediada através TRIP230, examinámos os efeitos de Rb sobre a expressão de uma construção repórter hipóxia-responsivo usando mutantes de deleção de TRIP230 em linhas de células RB-negativas e -positivas . células Hepa1c1c7 Rb-negativo foram transfectadas com um plasmídeo que codifica a expressão TRIP230, ou uma deleção-mutante transcricionalmente competente de TRIP230 (TRIP230ΔRb; esquemática na Figura 6G) a que falta o domínio de Rb-interacção [17], um plasmídeo de expressão de cDNA de Rb, e um sintético construção repórter da luciferase contendo um promotor multimerizada elemento hipóxia-sensível (HRE) (Figura 6E). Rb revogada indução hipóxica da actividade repórter nas células transfectadas com o tipo selvagem TRIP230, mas foi ineficaz nas células transfectadas com o TRIP230 mutante. A transfecção do Rb na linha celular Hepa1c1c7 não teve efeito sobre níveis de proteína TRIP230 endógena (Figura 6H). Com efeito, a titulação de quantidades crescentes de plasmídeo Rb-expressão reprimida actividade repórter indutível por hipoxia em uma maneira dependente da dose (Figura S2B). A transfecção do TRIP230 mutante em células de cancro da mama humano MCF7 Rb-positivas aumentou ainda mais a expressão do gene repórter (Figura 6F), actuando assim como um dominante provável negativo competindo por HRE com o tipo selvagem endógena TRIP230. Estes dados sugerem colectivamente que os efeitos atenuantes de Rb sobre a actividade transcricional HIF1 parecem ser mediados por TRIP230.

Discussão

Nós determinamos que Rb atenua a resposta fisiológica à hipóxia por HIF1α e que é um parte integrante e indispensável do complexo transcricional HIF1 em virtude de uma interação direta com TRIP230. Este efeito é independente de outras interacções proteína-proteína como o efeito repressor de Rb foi perdido em células que sobre-expressam um mutante transcricionalmente competente de TRIP230 a que falta o domínio de Rb-interacção (Figura 6E e F) e em células desprovidas de TRIP230 (Figura 3A ). Além disso, siRNA mediada knock-down de Rb levou a um aumento concomitante de genes alvo HIF1 conhecidos de um modo dependente-hipóxia em células MCF7 da mama humano e em linhas celulares de cancro da próstata LNCaP humanas (Figura 1). Além disso, fomos capazes de gravar Rb sobre HRE bem caracterizados nas regiões reguladoras de EPO e o VEGF (Figura 2) o que sugere que Rb podem regular a expressão destes genes ao nível da transcrição.

O co-activador TRIP230 estava clonados e caracterizados com base na sua capacidade de interagir com o receptor da hormona da tiróide (TR), e melhorar a sua função de transactivação [13], [16], e por virtude da sua capacidade para interagir com Rb [16]. Neste último relatório, foram apresentadas provas de que suportado um papel para Rb como um atenuador de transcrição da função do receptor da hormona da tiróide, provavelmente mediada através da co-activador TRIP230 transcricional. TRIP230 foi encontrado mais tarde para actuar como um co-activador essencial para as actividades de transcrição ARNT-dependentes, incluindo a expressão do gene hypoxia-inducible [12]. Mais importante, verificou-se que TRIP230 não interagir com HIF1α num ensaio de levedura de dois híbridos (T. Beischlag, dados não publicados). Nossos estudos imuno-precipitação que empregam anticorpos dirigidos para TRIP230 demonstrar que endógena ARNT e Rb interagir com TRIP230 em células MCF-7 (Figura 6A) apoiar ainda mais a nossa hipótese de que Rb é parte de um complexo de transcrição HIF1.

Para delinear ainda mais a natureza deste putativo complexo e para determinar se ARNT, TRIP230 e Rb existe num único complexo, que eliminado outras interfaces conhecida interacção proteína-proteína dentro ARNT e utilizado uma estratégia de pull-down GST de afinidade TRIP230 captura e Rb. A análise compreensiva pela GST pull-down realizada por Elferink e seus colegas não conseguiram demonstrar uma interação direta com ARNT e Rb

in vitro

[30]. Além disso, com base nos nossos estudos anteriores que caracterizam a interacção entre o ARNT e TRIP230 [12], Partch e colegas identificaram aminoácidos dentro do domínio ARNT PAS-B que medeiam a interacção ARNT-TRIP230 [31]. Nós projetamos uma fusão GST-ARNT-PAS-B eliminando, assim, outros domínios de interação proteína dentro ARNT. A capacidade da região de ARNT-PAS-B para puxar para baixo Rb suporta a existência de um complexo multi-mero contendo ARNT, TRIP230 e Rb (Figura 6B). Na verdade, o domínio PAS-B surgiu como uma plataforma de boa-fé para o recrutamento de múltiplas formas de complexos de co-regulação da transcrição [12], [15], [31], [33].

O HIF1