Abstract

Muitas células cancerosas exibir um CIN (

C

hromosome

Em fenótipo

estabilidade), pelo qual eles apresentam altas taxas de perda cromossômica ou ganho em cada ciclo celular. Ao longo dos anos, uma série de diferentes mecanismos, incluindo multipolar fuso mitótico, insuficiência citocinese, e orientação cinetócoro merotelic, têm sido propostos como causas de CIN. No entanto, uma teoria abrangente de como CIN é perpetuada ainda está faltando. Usamos CIN células cancerosas colorectal como um sistema modelo para investigar a possível mecanismo celular (s) subjacente CIN. Descobrimos que as células NIC freqüentemente montados fusos multipolares na mitose cedo. No entanto, as células anáfase multipolares eram muito raros, e os experimentos em células vivas, mostrou que quase todas as células NIC divididos de forma bipolar. Além disso, a análise de células fixo mostraram altas frequências de cromossomos atrasadas merotelically anexados em células CIN anáfase bipolar, e as frequências mais elevadas de anexos merotelic em multipolares vs. prometáfases bipolares. Finalmente, descobrimos que prometáfases CIN multipolares normalmente possuía γ-tubulina em todos os pólos do fuso, e que uma fração significativa de células CIN bipolar metaphase /início anáfase possuía mais de um centrossoma em um único pólo do fuso. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem um modelo pelo qual anexos cinetócoro merotelic pode ser facilmente estabelecido em prometáfases multipolares. A maioria dessas células prometáfase multipolares então bi-polarizar antes do início anaphase, e os anexos merotelic residuais produziria cromossômicas mis-segregação devido à anáfase ficando cromossomos. Propomos este mecanismo pólo coalescência fuso como um importante factor de instabilidade cromossômica em células cancerosas

Citation:. Silkworth WT, Nardi IK, Scholl LM, Cimini D (2009) Multipolar Spindle Pole Coalescence é uma fonte principal de cinetocore mis-apego e Chromosome mis-segregação em células cancerosas. PLoS ONE 4 (8): e6564. doi: 10.1371 /journal.pone.0006564

editor: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, Reino Unido

Recebido: 10 de maio de 2009; Aceito: 03 de julho de 2009; Publicação: 10 de agosto de 2009

Direitos de autor: © 2009 Silkworth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. IKN foi um destinatário de um Fralin verão Graduação bolsa de Investigação no verão de 2008 e no verão de 2009. Este trabalho foi parcialmente financiado pela NSF conceder MCB-0842551 e Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memorial Trust conceder J-828 para a DC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Accurate mitótico cromossomo segregação é necessária para manter um número diplóide. A maioria das células cancerosas são aneuplóide [1], [2] e aneuploidia foi sugerido, já há um século atrás, para ser uma causa de câncer [3]. Em adição a este estado aneuploidia, muitas células cancerosas exibem altas taxas de cromossoma mis-segregação (ou seja, o ganho ou perda de cromossomas inteiros) em cada ciclo celular, uma condição referida como instabilidade do cromossoma ou CIN [4] – [6], o que contribui para a manutenção de elevados níveis de aneuploidia. Uma série de estudos têm tentado identificar o defeito (s) na segregação cromossômica mitótico potencialmente responsável pela CIN. Os primeiros estudos sugeriram defeitos no checkpoint mitótico como a principal causa da CIN [7]. No entanto, trabalho posterior mostrou que a maioria das células cancerosas CIN tem um ponto de verificação robusta [8] e a sua resposta aos tratamentos mitose perturbando é indistinguível da resposta de células não-CIN [8], [9]. falha citocinese Também tem sido sugerido no passado como uma possível causa de CIN [10], [11]. No entanto, falha citocinese iria produzir uma única célula filha poliplóide, e não podia explicar CIN, que é definido como a mis-segregação de cromossomas em taxas mais elevadas. Como resultado, ambos os CIN produz níveis elevados de aneuploidia e grande variabilidade no número de cópias do cromossoma dentro da população [4], considerando que o não citocinese simplesmente resultar em uma duplicação do número de cromossomas. Assim, a falha cytokinesis

per se

não pode explicar CIN, a menos que seja seguido por outros eventos de cromossomos mis-segregação em que cromossomos individuais (em vez de todo o genoma) são mis-segregadas. Outros estudos sugeriram multipolar como uma causa potencial da CIN [12] – [15] baseia-se na observação de que as células de cancro a partir de numerosos sítios (revisto em [1]) frequentemente montar fusos multipolares (geralmente acompanhada por amplificação centrossoma). Embora multipolar segregação cromossoma certamente levar a extensa cromossómicas mis-segregação, um número de estudos sugeriram que muitas destas células multipolares pode passar por um processo de fuso pólo coalescência /agrupamento [16], [17], o que impediria a mis cromossómicas maciças -segregation que estaria associado a segregação cromossoma multipolar. Tem sido sugerido que este mecanismo de pólo coalescência fuso poderia conferir uma vantagem selectiva às células cujos níveis de aneuploidia de outra forma seria tão grave para resultar em morte celular [18], [19]. Finalmente, uma série de estudos descobriram altas frequências de cromossomos atrasadas anafase (ie, os cromossomos que não segregam para o pólo do fuso, mas ficaram para trás no equador do fuso durante anaphase) em várias células cancerosas, incluindo as células de câncer oral [20], [21], as células humanas de cancro da mama [22], [23], células de carcinoma do ovário [24], e as células de cancro colorrectal [22]. Um desses estudos [22] também mostrou que os cromossomos atrasadas foram merotelically orientada (isto é, a sua kinetochore foi obrigado a microtúbulos a partir de ambos os pólos do fuso em vez de apenas um). Em resumo, muitos mecanismos alternativos de CIN têm sido propostos ao longo dos anos; no entanto, uma teoria abrangente de como CIN é perpetuada ainda não existe, e não é claro se qualquer correlação entre alguns desses mecanismos existe.

Neste estudo, foram utilizados CIN células cancerosas colorectal como um sistema modelo para investigar o possível mecanismo celular (s) subjacente CIN. Descobrimos que as células NIC freqüentemente montados fusos multipolares na mitose cedo, mas anáfases multipolares eram muito raros, e quase todas as células NIC divididos de forma bipolar. Nós também descobrimos que anáfase bipolar células CIN exibiram altas frequências de cromossomos atrasadas merotelically anexados. Além disso, uma fracção significativa de células NIC bipolar metafase /anafase início possuía mais de um centrossoma em um único polo do fuso. Finalmente, encontramos altas frequências de anexos merotelic em prometáfases multipolares. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem um modelo pelo qual anexos cinetócoro merotelic pode ser facilmente estabelecido em prometáfases multipolares. A maioria dessas células, então, bi-polarizar antes do início anaphase, e os anexos merotelic residuais produziria cromossômicas mis-segregação devido à anáfase ficando cromossomos. Propomos este mecanismo pólo coalescência fuso como um importante factor de instabilidade cromossômica em células cancerosas.

Resultados

CIN células cancerosas colorectal possuem fusos multipolares em prometáfase, mas não em anaphase

células de câncer colorretal pode ser dividido em dois grupos [5], [25], os que exibem CIN, e aqueles que não, tradicionalmente chamado MIN por causa de sua típica

M

icrosatellite

em

estabilidade. Devido a esta característica, as células de cancro colorrectal representam um modelo particularmente interessante para o estudo da segregação de cromossomas mis-em células de cancro, porque as células MIN pode ser usado como um controlo experimental de células NIC. Para este estudo, foram selecionadas duas linhas CIN câncer colorretal celulares (HT-29 e SW620) e uma linha celular colorectal MIN (HCT116). Para identificar defeitos mitóticas potencialmente responsáveis ​​pela cromossomo mis-segregação em células CIN, realizamos experimentos de positividade para rotular cinetócoros (usando anticorpos CREST) ​​e fusos mitóticos (usando anticorpos anti-alfa tubulina) em células CIN e MIN. Em seguida, utilizada microscopia confocal de alta resolução para identificar defeitos prometáfase em ambas as células min (Figura 1) e CIN. Descobrimos que o defeito prometáfase mais proeminente em células CIN foi multipolaridade fuso e que fusos células prometáfase CIN exibiram multipolares (Figura 1A) em freqüências que foram significativamente superiores aos encontrados em células min (Figura 1B). A maioria dos fusos multipolares exibiu uma morfologia tripolar ou tetrapolar, embora também foram observadas células com 5-8 multipolares pólos do fuso (5,4%, 19,5%, e 7,9% de toda a HCT116 multipolar, HT-29 e SW620, respectivamente). Em seguida, olhou para a multipolaridade nas células anáfase, e descobriram que as frequências de fusos multipolares em células CIN anáfase foram muito menores do que aqueles encontrados em prometáfase (Figura 1B). Além disso, não houve diferença entre as células MIN e CIN na frequência de anáfases multipolares (Figura 1B).

A. Exemplos de MIN (HCT116) e CIN (HT-29, SW620) prometáfase células imunomarcadas para α-tubulina (vermelho, coluna da esquerda) e cinetócoros (verde, coluna do meio). Todas as imagens são projeções de intensidade máxima de pilhas de secções ópticas adquiridos em 0.6 mm intervalos através do Z-eixo celular. imagens integradas são mostradas na coluna da direita. Para cada linha celular, um exemplo de um prometáfase bipolares e de prometáfase multipolares são mostrados. barra de escala, 5 mm. B. As frequências de prometáfase e células anáfase com fusos multipolares. Os dados aqui apresentados representam as médias e os erros padrão (bares) de quatro experiências independentes. prometáfases CIN multipolares foram significativamente mais frequente do que prometáfases MIN multipolares (χ

2 test, P 0,001 para ambos HT-29 e SW620 quando comparado com HCT116). No entanto, anáfases CIN multipolares ocorreu em baixas freqüências que não diferem dos anáfases MIN multipolares.

Tanto as células NIC e MIN dividir de forma bipolar, mas a mitose dura mais tempo em células CIN

As baixas frequências de fusos multipolares em células CIN anáfase sugeriu que prometáfases multipolares pode não completar uma divisão multipolar, mas pode em vez disso encontrar diferentes destinos. Algumas possibilidades incluem paragem da mitose, a morte celular mitótico, ou derrapagem mitótico. Para determinar o possível destino (s) das células cancerosas CIN mitóticas, realizamos experimentos de lapso de tempo. Em cada experiência, foram seleccionados vários campos de visão e fotografada por microscopia de contraste de fase com uma objectiva 20x num microscópio invertido equipado com uma plataforma totalmente automatizada. As imagens foram adquiridas a cada 30 seg durante três horas. Os filmes de lapso de tempo foram subsequentemente analisados ​​para determinar a duração da mitose e destino das células entrando em mitose durante o período de gravação. Como esperado dos seus dados de células fixas (Fig. 1B), que raramente observada cromossoma segregação podem ocorrer numa forma multipolar (Figura 2A). Na maioria das células, cromossomas segregados em dois grupos em lados opostos da célula, e um único sulco cytokinetic formadas entre eles (Vídeo S1). O número de células que apresentem segregação cromossoma multipolar nas nossas experiências em células vivas (Figura 2A) não foi significativamente diferente (χ

2, P 0,37 para todas as três linhas de células) a partir do número de células anafase multipolares encontramos na célula fixo experiências (Figura 1B). Além disso, verificou-se que 40-67% das células CIN expositoras segregação cromossômica multipolar não conseguiu completar citocinese (Figura 2A), enquanto que não houve casos de insuficiência citocinese em células que exibem segregação cromossômica bipolar. Por último, não encontramos qualquer indício de prisão persistente mitótico, a morte celular durante a mitose, ou derrapagem mitótico. Estes dados indicam que a maioria da instabilidade dos cromossomas de células NIC deve derivar de defeitos cromossoma segregação em células em divisão de uma forma bipolar e completando a divisão celular. Nossos experimentos em células vivas, também revelou que o tempo gasto na mitose, medido como o tempo decorrido entre o início dos célula arredondamento para o início anaphase, foi significativamente maior em células CIN comparação com células min (Tabela 1), à semelhança do que já foi encontrado em outras linhas celulares de cancro [26].

A. Frequências de células que exibem segregação cromossômica multipolar em contraste de fase experimentos de lapso de tempo. B. As frequências de anaphase bipolar MIN (HCT116) e CIN (HT-29, SW620) células com cromossomos atrasadas. Os dados aqui apresentados representam as médias e os erros padrão (bares) de quatro experiências independentes. Frequências de anáfase ficando cromossomos foram significativamente maiores no CIN do que as células min (χ

2 test, P 0,001 para ambos HT-29 e SW620 quando comparado com HCT116). C. Exemplos de MIN (HCT116) e CIN (HT-29, SW620) células anáfase imunomarcadas para α-tubulina (vermelho, primeira coluna) e cinetócoros (verde, segunda coluna). As imagens são projeções de intensidade máxima de pilhas de secções ópticas adquiridos em 0.6 mm intervalos através do Z-eixo celular. imagens integradas são mostradas na terceira coluna. Para cada linha celular, um exemplo de anafase normal e um anafase com um cromossoma são mostrados. A coluna à direita mostra as células com cromossomos ficando em um único plano focal, em que o contraste foi melhorado para destacar as conexões merotelic do kinetochore de cromossoma. barra de escala, 5 mm.

anáfase células CIN bipolares apresentam altas frequências de cromossomos atrasadas merotelically ligados

Como descrito acima, a multipolaridade era comum em células prometáfase CIN, mas raramente foi observada em anafase (Figura 1B), e a maioria das células NIC seus cromossomas segregados de forma bipolar (Figura 2A). Isto indicou que multipolar segregação cromossômica é uma causa improvável de instabilidade cromossômica em células CIN, e sugeriu que os erros que ocorrem durante a segregação cromossômica bipolar foram a causa mais provável do CIN. Para identificar esses defeitos potenciais, usamos a microscopia confocal de alta resolução para analisar células anáfase com cinetócoros e microtúbulos (Figura 2C) imunomarcadas. Descobrimos que as células anáfase CIN bipolar possuía merotelically anexado cromossomos retardatários (ou seja, cromossomos que ficaram para trás no equador do fuso ao invés de segregar para o pólo do fuso, e cuja kinetochore foi obrigado a feixes de microtúbulos a partir de ambos os pólos do fuso, em vez de apenas um; Figura 2C , coluna da direita) a frequências mais elevadas do que as células min (Figura 2B). Curiosamente, as frequências de células anáfase com ficando cromossomos eram muito semelhantes às frequências de células prometáfase multipolares (comparar Figura 1B com a Figura 2B).

Ambas as células NIC multipolares e bipolares possuem múltiplas centrossomas

as baixas frequências de anáfases multipolares, em comparação com os de prometáfases multipolares (Figura 1B) e a segregação cromossoma bipolar observada em células vivas (Figura 2A) sugeriu que a maioria dos fusos multipolares pode bipolarize antes do início da anafase. Para testar esta hipótese, foi realizada a coloração γ-tubulina, em combinação com microtúbulos e imunocoloração cinetócoro em células NIC em diferentes fases da mitose (Figura 3A-B). microscopia confocal de alta resolução revelou que em células NIC prometáfase, coloração γ-tubulina foi presentes em todos os pólos do fuso em mais de 95% das células (Figura 3a). Em seguida, nós olhamos /células bipolares metafásicas primeiros anafase (Figura 3B) e descobriu que um número significativo de células exibiram vários pontos γ-tubulina-positivos em um único polo do fuso (Figura 3B-C), sugerindo que alguns dos pólos do fuso presente nas células prometáfase multipolares pode mover próximas umas das outras em estágios de mitose posteriores para gerar dois pólos do fuso focado, e, portanto, um eixo bipolar. Deve notar-se que as frequências observadas (6,8% e 10,5% para HT-29 e SW620, respectivamente) poderia subestimar o número real de pólos do fuso submetidos a esse processo de coalescência, como alguns deles pode mover-se tão próximos uns dos outros para aparecer como uma por coloração γ-tubulina.

A figura mostra exemplos de prometáfase multipolar (A) e metáfase bipolar (B) células imunocoradas para CIN α-tubulina, cinetócoros, e γ-tubulina. As imagens mostradas foram obtidos através da fusão projeções de intensidade máxima de qualquer das imagens CREST (cinetócoros) (coluna da esquerda) ou imagens α-tubulina e y-tubulina (coluna da direita) α-tubulina e. A. células prometáfase maioria multipolares (percentagens exactas mostradas no canto inferior direito dos painéis à direita) apresentaram coloração γ-tubulina em todos os pólos do fuso. B. Exemplos de metafásicas bipolar células CIN com vários centrossomas em um único polo do fuso (setas apontam em pontos γ-tubulina-coradas). barra de escala, 5 mm. C. As freqüências de /anáfase células bipolares metafásicas primeiros CIN possuem múltiplas centrossomas (como visualizado por coloração γ-tubulina) em um único polo do fuso.

A elevada freqüência de anexos merotelic em multipolar vs bipolar prometáfase CIN células

os sinais de y-tubulina múltiplas nos pólos do fuso de células CIN metafásicas bipolar, juntamente com a ocorrência de ficando cromossomos em anáfases bipolares em freqüências que se assemelham as frequências de prometáfases multipolares, sugeriu que os anexos merotelic pode ser preferencialmente formada em células prometáfase multipolares que subsequentemente bi-polarizam por coalescência polo do fuso. Para testar esta hipótese, utilizou-se microscopia confocal de alta resolução combinada com visualização 3-D e processamento de imagem (ver Materiais e Métodos para detalhes) para identificar cinetócoros merotelic em cold-tratada (para induzir a desmontagem de microtúbulos não kinetochore, mas preservar os microtúbulos cinetócoro CIN) células imunocoradas para prometáfase cinetocoros e microtúbulos (Figura 4A-D). Nós determinamos o número de cinetócoros merotelic em células CIN prometáfase bipolares vs. multipolar, identificando todos os cinetócoros ligados a dois feixes de microtúbulos orientados em direções opostas, e descobriram que as células prometáfase multipolares possuía números significativamente maiores de anexos merotelic do que as células bipolares prometáfase (Figura 4E ), sugerindo anexos merotelic em tais prometáfases multipolares como uma importante fonte de ficando cromossomos nas células anáfase bipolares.

a. único plano focal de um HT-29 prometáfase multipolar não transformados. barra de escala, 2,5 mm. B. mesma célula e mesmo plano focal como em (A) obtido após a transformação das imagens dos dois canais de filtragem especial, fundindo, e alisando (ver Materiais e Métodos para mais detalhes). A kinetochore merotelic é visível na área de box. KTs: cinetócoros. MTs: microtúbulos. C. proporção de visualização do plano focal mostrado em (A) e (B). Regiões de justaposição entre o kinetochore e seu pacote (s) de microtúbulos aparecem em verde. D. O alargamento (400%) da área de box em (B). E. Número médio de cinetócoros merotelic em células CIN prometáfase bipolares vs. multipolar. prometáfases multipolares possuem cinetócoros significativamente mais do que merotelic prometáfases bipolares (t-test, P 0,001 para ambas as linhas celulares)

Discussão

falha Citocinese não contribui para CIN

.

Citocinese falha tem sido sugerido no passado como um mecanismo responsável por aneuploidia em células cancerosas [10], [11]. Com efeito, um certo número de estudos demonstraram que poliploidia induzida experimentalmente por inibição da citocinese, pode levar à transformação maligna e tumorigénese [27], [28]. No entanto, como apontado na introdução, insuficiência cytokinesis

per se

não seria suficiente para explicar CIN, ou seja, alta de cromossomos taxas mis-segregação. No entanto, a falha cytokinesis pode ser um fator que contribui para a NIC, assim, determinou-se a frequência de falha cytokinesis tanto em células que exibem segregação cromossômica bipolar e em células com segregação cromossômica tripolar. Nunca observada falha citocinese em células que sofrem divisão celular bipolar, e este fenómeno ocorreu apenas em cerca de metade das células que sofrem divisão celular multipolar (Figura 2A). Porque muito poucas células apresentam segregação cromossômica multipolar, as taxas observadas de falha cytokinesis representam um evento muito raro na população de células em geral. Assim, a falha cytokinesis não consegue explicar tanto as altas taxas de cromossomo mis-segregação observadas nas células CIN [4], [5] e as altas taxas de cromossomos atrasadas encontrados em células de câncer [20] – [24] (Figura 2B). Em conclusão, embora a falha cytokinesis poderia representar um evento raro, no início do desenvolvimento do tumor [27], [28], não parece contribuir de forma significativa para CIN em células de câncer em fases posteriores da progressão do tumor.

multipolaridade e segregação cromossoma multipolar em células cancerosas CIN

Muitas células cancerosas têm sido anteriormente demonstrado que exibem amplificação do centrossoma [12], [15], [29], [30], e mitótico multipolar fuso tem sido observada em cancro As células a partir de vários locais [1], [12], [15], [20], [21], [24], [29] – [34]. Tem sido sugerido que a segregação multipolar cromossoma iria produzir células filhas em grande parte aneuploides, que muito provavelmente não iria sobreviver ciclos subsequentes de células [18], [19]. De facto, as nossas experiências com células vivo mostraram que a divisão celular multipolar é um evento raro em células NIC (Figura 2A). Além disso, um estudo recente mostrou que a divisão celular nas células multipolar CIN resulta numa morte celular ou a paragem do ciclo celular [35]. Foi previamente sugerido que as células cancerosas multipolares pode ser submetida a um processo de bipolarização, o que iria ocorrer através de agrupamento centrossoma, e conduziria à segregação bipolar cromossoma [16] – [18]. Estudos recentes têm mostrado que vários jogadores podem estar envolvidos na promoção do agrupamento centrossoma (revisto em [36]). Estes incluem mecanismos associados a actina [16], dineína [17], cinesina 14s (NCD /HSEt) [16], [37], e talvez outras proteínas /mecanismos [16], [36], [37]. Estudos recentes [16], [26], [37] também têm sugerido um possível papel do checkpoint de montagem do eixo em que haja tempo para bipolarização do fuso em células multipolares, como a inibição Mad2 impedido bipolarização do fuso [16], [37] e mitótico acelerada saída em células multipolares [26]. De acordo com estes estudos, descobrimos que as células com frequências mais altas de fusos multipolares gastar, em média vezes, mais longos na mitose (Tabela 1). No entanto, a inibição Mad2 acelera saída mitose independentemente do número de pólos do fuso e do apego kinetochore [38] – [40], de modo que seu efeito sobre multipolar eixo bi-polarização pode ser simplesmente um efeito secundário. Nós também descobrimos que as células multipolares possuem maior número de cinetócoros merotelic. No entanto, merotelic anexos não são detectadas pelo posto de montagem do eixo (revisto em [1]), e, portanto, esta parece improvável que seja a razão para o atraso mitótico. Por outro lado, as células cancerígenas têm números de cromossomas CIN excessivas, por isso, é fácil imaginar que a obtenção de ligações estáveis ​​para todos os cromossomas levará mais tempo em tais células em comparação com as células diplóides bipolares. No entanto, Yang et al. [26] mostrou recentemente que as células diplóides RPE1 multipolares experimentalmente gerados tomar duas vezes mais longa para entrar anafase em comparação com as suas contrapartes bipolares, sugerindo que o aumento no número centrossoma pode ser suficiente para retardar o início da anafase. Os autores sugerem que a presença de múltiplos ásteres de microtúbulos pode perturbar a estabilidade do cinetocoro anexos [26], levando assim a um aumento no tempo necessário para completar a fixação cinetocoro, e consequentemente alongar a mitose. Esta é uma possibilidade intrigante, as quais terão de ser testados em experiências futuras. Em conclusão, como centrossomas extra de retardar o início anaphase ainda não está claro, mas esses estudos sugerem que ambos os cromossomos extras e os centrossomas extras em células cancerosas CIN pode contribuir para o aumento do tempo médio gasto na mitose, durante o qual as células multipolares bipolarize através do fuso coalescência poste. O agrupamento centrossoma associada com fuso bi-polarização foi anteriormente sugerida para conferir as células cancerosas com uma vantagem selectiva que impediria maciça cromossoma mis-segregação e permitir que as células cancerosas para continuar a dividir, mesmo na presença de centrossomas adicionais [18], [19]. Assim, os estudos anteriores proposta tal processo pólo coalescência fuso como um mecanismo para evitar a segregação cromossômica errônea. Por outro lado, propõe-se aqui que a montagem do fuso multipolar seguido por coalescência polo do fuso representa um importante mecanismo do cromossomo mis-segregação em células cancerosas CIN (ver secção seguinte para uma descrição detalhada do nosso modelo proposto).

multipolaridade Célula cancerosa e kinetochore merotelic anexo: as duas faces da mesma moeda

o baixo número de anáfases multipolares comparação com prometáfases multipolares (Figura 1B), o baixo número de divisões celulares multipolares (Figura 2A), ea presença de múltiplas γ -tubulina sinais positivos em varas de eixo único em anafase início /CIN células em metafase (Figura 3B-C), sugerem que a maioria dos prometáfases multipolares passam por um processo de coalescência polo do fuso antes do início da anafase, como sugerido anteriormente [16] – [19 ].

propomos que quando as células cancerosas CIN inicialmente montar fusos multipolares, cinetócoros individuais são mais propensos do que estariam dentro de um fuso bipolar a face (Figura 5A), e tornar-se ligado a (Figura 5B), dois pólos do fuso (fixação merotelic). Assim, seria de esperar que células prometáfase multipolares possuir mais merotelic anexos em comparação com prometáfases bipolares. De fato, descobrimos células prometáfase multipolares de possuir cinetócoros mais merotelic comparação com prometáfases bipolares (Figura 4). Como descrito acima, fusos multipolares provável bipolarize através de um processo de pólo coalescência fuso (Figura 5B-C) antes do início da anafase. Embora os mecanismos de correcção para fixação kinetochore merotelic existem [39], [41], [42], este cinetócoro mis-apego não é detectado pelo checkpoint mitótico [43], [44] e as células podem entrar anaphase antes de alcançar a correção completa [ ,,,0],39], [43]. Como as células que transitoriamente montar fusos multipolares seria começar com mais anexos merotelic comparação com células bipolares (Figura 4 e 5B), são esperados mais de tais mis-anexos a persistir através anaphase e produzir cromossomos atrasadas (ou seja, cromossomas em atraso no equador do eixo em vez de segregar para o polo do fuso; Figura 5D), e portanto do cromossoma mis-segregação e aneuploidia. Notavelmente, também descobrimos que as frequências de células anáfase com cromossomos atrasadas orientados merotelically foram muito semelhantes às frequências de células prometáfase multipolares (comparar Figura 1B e Figura 2B), sugerindo a possibilidade intrigante que os cromossomos mais atrasadas são encontrados nessas células que, inicialmente, montar fusos multipolares. Em resumo, enquanto a multipolaridade fuso e anaphase ficando cromossomos haviam sido previamente sugerida como causas não relacionadas de CIN, mostramos aqui para a primeira vez que um grande número de forma cinetócoros merotelic em células prometáfase multipolares, revelando, assim, a estreita ligação entre a multipolaridade e anáfase ficando cromossomos .

A. Dentro de um eixo multipolar, um único cinetócoro é mais provável que enfrentar dois pólos do fuso do que seria em um fuso bipolar. B. Por causa da geometria do fuso multipolar, um único cinetócoro pode facilmente ligar microtúbulos que emanem de dois pólos do fuso, em vez de apenas a partir de um pólo. Após o estabelecimento do apego kinetochore merotelic, o fuso mitótico bi-polariza por um processo de coalescência polo do fuso (ou agrupamento centrossoma). C. Merotelic anexo kinetochore pode persistir através metaphase e em anaphase. D. Durante anaphase, o anexo kinetochore merotelic pode dar origem a um cromossoma.

Devemos notar que, apesar de frequências muito mais baixas do que em células CIN, encontramos dois fusos prometáfase multipolares (Figura 1 ) e anáfase ficando cromossomos (Figura 2B-C) em células HCT116 (MIN). No entanto, estas células foram previamente demonstrado que não exibem CIN [4], [22], e eles mostraram não tolerar cromossómicas induzidas experimentalmente mis-segregação [22], sugerindo que CIN deve resultar de uma combinação de mis elevados cromossómicas taxas -segregation (não observadas em células HCT116) e algum outro recurso fenotípica que faz com que as células tolerantes para aneuploidia [22].

experimentos futuros devem ser destinados a testar o nosso modelo e sua previsão de que a inibição da coalescência polo do fuso deve resultar em frequências mais baixas de atraso de cromossomos nas células anáfase bipolares. imagens de lapso de tempo de células com cinetócoros e microtúbulos marcados confirmaria a sequência de eventos aqui propostas (Figura 5), ​​se cromossomos atrasadas anáfase merotelically anexado foram observados mais frequentemente em células começam a mitose com fusos multipolares comparação com células começando com fusos bipolares. Além disso, o agrupamento polo do fuso pode ser inibida para desacoplar do fuso multipolaridade da anáfase ficando cromossomos, e, assim, demonstrar a relação causal entre estes dois fenómenos. Por exemplo, através da realização de uma tela de RNAi do genoma em células S2 de Drosophila, Kwon et ai. [16] verificaram muitos genes diferentes implicada numa variedade de processos celulares, incluindo a fuso de organização do pólo, a forma da célula e polaridade, e a adesão de células, a ser envolvido no agrupamento centrossoma. De acordo com o nosso modelo, silenciando destes genes em células NIC deve resultar em frequências reduzidas de atraso de cromossomos em anáfases bipolares e experimentos futuros devem ser destinados a testar esta hipótese. Embora a experiência inversa (isto é, redução do apego merotelic em células multipolares) seria muito mais difícil, algumas experiências poderia proporcionar evidência indirecta que a redução da ligação merotelic resultaria numa redução da anafase os cromossomas ficando em células que transitoriamente montar um eixo multipolar. Por exemplo, o início da anafase pode ser retardada por meio do tratamento de células multinucleadas com um inibidor de proteassoma. Durante o tempo de inibição de proteassoma, os fusos multipolares são esperados para bi-polarizar, e os anexos merotelic está prevista para ser corrigido. Assim, após a lavagem do inibidor, as células devem entrar anaphase e exibem baixas frequências de cromossomos atrasadas.

Será que qualquer outro mecanismo de contribuir para CIN?

Nós não descarta que outros mecanismos podem contribuem para a instabilidade dos cromossomas de células cancerosas. Por exemplo, estudos recentes sugeriram que os mecanismos de correcção cinetócoro merotelic não são muito eficientes em células cancerosas CIN [9], [45].