Abstract
Evidências recentes indicam que a sinalização CXCR2 é crucial para a progressão do câncer, e os seus induz antagonista SB225002 apoptose em células de tumor de Wilms. Aqui, nós investigamos o efeito da SB225002 na progressão do ciclo celular e indução de apoptose
in vitro
, utilizando linhas celulares OVCA CDDP-sensíveis e resistentes ao com status diferente p53 (tipo selvagem, mutante ou nulo). infecção por adenovírus do tipo selvagem p53 ou transfecção de siRNA p53 foi usada para p53 sobre-expresso ou knock-down. ciclo celular e apoptose foram determinados por citometria de fluxo ou de coloração Hoechst e observação da morfologia nuclear. Os nossos dados demonstram que a apoptose induzida SB225002 em ambas as células deficientes em p53 do cancro do ovário (OVCA) de tipo selvagem e através de mecanismos alternativos. SB225002 promovido catástrofe mitótico, como evidenciado pelo acúmulo de células mitóticas com anormalidades do fuso, mis-segregação cromossômica, a divisão celular multi-polar, múltiplos núcleos, aneuploidia /polyploidy e subsequente apoptose extensiva. induzida por SB225002 catástrofe mitótica pareceu ser mediada por sub-regulação da cinase Chk1 do ponto de verificação e activação Cdk1-ciclina B. Em células que expressam a p53 de tipo selvagem (OV2008 e C13 *), SB225002 aumentou os níveis totais de p53 e fosfo-Ser, e p53 knock-down diminuiu a apoptose induzida por SB225002, sem afectar a mitose prematura. Estes resultados sugerem que SB225002 induz a apoptose dependente de p53, e provoca catástrofe mitótica de uma maneira independente de p53 em células p53 de tipo selvagem. Reconstituição com p53 de tipo selvagem em células sem p53 SKOV3 atenuada catástrofe mitótica induzida por SB225002, sugerindo p53 impediu catástrofe mitótica induzida por SB225002 em células deficientes em p53 OVCA. Finalmente, o efeito de SB225002 não poderia ser evitada por pré-tratamento com o ligando de CXCR2 ou seu anticorpo neutralizante. Os presentes estudos demonstram pela primeira vez que SB225002 tem acções duais em células, OVCA clássico indutor de apoptose através da activação de p53 e provocando catástrofe mitótica em ambas p53 do tipo selvagem e deficientes em células por inibição da activação de Chk1 e Cdk. Estes resultados levantam a possibilidade de SB225002 como uma nova molécula candidata para a terapia OVCA independente do estatuto p53
Citation:. Du M, Qiu Q, Gruslin A, Gordon J, Ele M, Chan CC, et al. (2013) SB225002 Promove Catastrophe mitótico em células quimio-sensíveis e -Resistente cancro do ovário independente do estado p53
In Vitro
. PLoS ONE 8 (1): e54572. doi: 10.1371 /journal.pone.0054572
editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 15 de outubro de 2012; Aceito: 12 de dezembro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo major Internacional de projeto de pesquisa conjunta da National Natural Science Foundation da China (30910103909 para DJ Li), Nacional e Shanghai Leading Academic Projeto Disciplina (211XK22 para DJL), Programa de Outstanding Medical líder acadêmico de Shanghai (a DJL) e Nacional Natural Science Foundation da China (81070537 para MRD), National Natural Science Foundation da China (31171437 para MRD), e Xangai PuJiang Programa Talent (10PJ1401600 para MRD) e bolsas de Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-15691 para BKT) e da Universidade World Class programa (WCU), através do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia e financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (R31-10056 para BKT). . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
interesses em conflito: Embora dois dos autores (Miao ele e Chi Chung Chan) são funcionários da empresa WuXi Apptech Co., Ltd., isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. A empresa não tem declarações referentes ao emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados como eles se relacionam com este projecto /manuscrito. Outros autores deste manuscrito (Meirong Du, Qing Qiu, Andree Gruslin, John Gordon, Dajin Li e Benjamin K. Tsang) não têm interesses financeiros ou outros com a empresa e confirmaram a sua declaração de que não têm interesses conflitantes, conforme definido pela PLOS ONE.
Introdução
o câncer de ovário (OVCA) é a neoplasia maligna ginecológica mais fatal que tem frustrado os clínicos e investigadores durante várias décadas. É a quinta maior causa de morte por câncer entre as mulheres, com estimativa de 21,990 novos casos diagnosticados e 15.460 mortes que ocorrem nos Estados Unidos em 2011 (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html). Embora a quimioterapia e cirurgia cytoreductive Atualmente modalidades padrão para o tratamento OVCA, quimio-resistência continua a ser uma das principais causas de falha quimioterápico. Vários mecanismos têm sido implicados em quimiorresistência, incluindo o transporte alterado de drogas, a reparação do ADN aumentada e um aumento da tolerância a danos no ADN [1], [2], [3]. Além disso, as células de mamíferos exibem respostas celulares complexas ao stress genotóxico, incluindo checkpoint do ciclo celular, a reparação de ADN e apoptose, e a activação do gene é um passo inicial crítico durante a resposta celular a danos no ADN. Embora a quimioterapia adjuvante com paclitaxel e cisplatina atinge resposta clínica numa percentagem elevada de casos, a toxicidade sistémica limita severamente a possibilidade de tratamento [4]. Assim, as estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras são urgentemente necessárias para combater esta doença.
A apoptose é caracterizada morfologicamente pelo encolhimento do citoplasma, condensação da cromatina e fragmentação nuclear com chromatinolysis [5], e bioquimicamente pela ativação caspase e permeabilização da membrana mitocondrial externa [6], [7], [8]. catástrofe mitótica é um caso especial da apoptose, e ocorre durante a mitose com uma combinação de pontos de verificação do ciclo celular deficiente e dano celular [9]. danos no DNA ativa checkpoints para atrasar a progressão do ciclo celular. P53 regula o G1 /S de transição (ponto de controlo G1-), enquanto CHK1 impede a entrada de células com DNA danificado em M-fase (G2-ponto de verificação). No caso de quimiorresistência, danos no ADN induzida por agentes quimioterapêuticos falha para prender as células de cancro na fase G1 e para promover a apoptose devido, principalmente, à sinalização de p53 deficiente. No entanto, o dano ao DNA pode activar a via CHK1, induzir S e G2-checkpoints prisão [10], [11] e facilitar o reparo do DNA antes da entrada em mitose (fase M). Assim, é concebível que os agentes capazes de induzir a apoptose convencional (por danos no DNA e activação de p53), e promoção da catástrofe mitótica (através de inactivação e de CHK1 ab-rogação da L /M) de detenção pode oferecer, potencialmente, novas vantagens terapêuticas.
Quimiocinas , uma superfamília de pequenas proteínas de citocina-like, são conhecidos por seu papel central como reguladores na migração celular, comunicações intercelulares e progressão do tumor, oferecendo um microambiente apropriado tumor [12], [13], [14]. CXCR2, um receptor funcional para ELR
+ quimiocinas, é predominantemente expresso em células endoteliais e é um potente promotor de angiogénese em tumores sólidos. As evidências indicam que a transformação celular por ras oncogénicas induz a expressão elevada de todos os ligandos CXCR2, e contribui para o desenvolvimento de tumores múltiplos. Em OVCA, ELR
+ quimioquinas, tais como IL-8, GRO-1 e ENA-78, estão significativamente sobre-regulada [15], [16], [17], [18]. O elevado nível de GRO-1 induz a senescência de fibroblastos e promove a transformação maligna de células epiteliais do ovário e o crescimento celular OVCA [19] SB225002 [N- (2-hidroxi-4-nitrofenil) -N ‘(2-bromofenil) ureia ] acredita-se ser um antagonista potente CXCR2 selectivo não peptídico por inibição da ligação de IL-8 e GRO-1 a CXCR2 [20]. Embora SB225002 foi desenvolvido em primeiro lugar para o tratamento de doenças inflamatórias [20], [21], estudos recentes sugerem que a infecção por retrovírus, tumor de Wilms e doença de Alzheimer podem ser indicações terapêuticas potenciais para os antagonistas de CXCR2 [22], [23], [24 ]. SB225002 tem sido relatado para induzir a apoptose em células de tumor de Wilms, embora o mecanismo subjacente não é claro [23].
No presente estudo, analisamos o efeito de SB225002 sobre a progressão do ciclo celular e indução de apoptose
in vitro
, utilizando linhas celulares OVCA CDDP-sensíveis e resistentes ao com status diferente p53 (tipo selvagem, mutante ou nulo). Descobrimos que SB225002, independente da CXCR2, induziu apoptose clássico através P53 ativação e provocou uma catástrofe mitótica em ambos os P53 de tipo selvagem e as células deficientes via quinase checkpoint 1 (Chk1) inibição e ativação Cdk. Além de sua ação inibitória da angiogênese do tumor através de sinalização celular mediada por CXCR2 (Matsuo
et al
., 2009), nosso estudo demonstra que SB225002 poderia ser um potencial de agentes terapêuticos para OVCA resistente à quimioterapia, através da sua acção sobre o ciclo celular progressão e a apoptose independente de sinalização mediada pelo receptor.
Materiais e Métodos
Reagentes
cis-diaminodicloroplatina (CDDP) e Hoechst 33258 foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EUA). SB265610 foi adquirido a Tocris Bioscience (EUA). SB225002 foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA), pequeno ARN inibitório (siARN) para p53 foram de Cell Signaling Technology (Beverly, CA). ARNsi de controlo foi de Dharmacon Inc. (Lafayette, CO, EUA). Ribojuice siARN reagente de transfecção foi de Novagen Inc. (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos primários de Western blot foram policlonal de coelho anti-PARP, anti-fosfo-Chk1 (S345) e fosfo-p53 (S15; Cell Signaling Technology), monoclonal de ratinho anti-Chk1, anti-caspase 3, anti-fosfo-Histona H3 ( serina 10), e anti-p21
WAF1 /CIP1 (Cell Signaling Technology), anti-p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-IL-8 e GRO-1 (R sistema D, Minneapolis, MN) e anti-GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram de Bio-Rad (Hercules, CA, EUA). Os anticorpos primários foram para imunocitoquímica policlonal de coelho Alexa 488 Fluor®-conjugado anti-fosfo-Histona H3 (Ser 10; Cell Signaling Technology), e conjugado com FITC anti-β-tubulina (clone TUB 2,1, Sigma). O anticorpo monoclonal anti-humano de CXCR2 -PE, IL8 humana recombinante e GRO1 eram de R D sistema. padrões pré-corados de electroforese em gel de poliacrilamida eram de BioRad. Adenovírus do tipo selvagem p53 e cDNA LacZ foram fornecidos pelo Dr. Ruth Slack (Instituto de Pesquisa de Neurociência da Universidade de Ottawa). ELR-CXC CXCL8 antagonista de quimiocinas (3-72) K11R /G31P (G31P) era do Dr. John R. Gordon (University of Saskatchewan, Saskatoon, Canadá).
Cultura de Células
cisplatina células sensíveis (OV2008 e OVCA A2780s) e respectivos homólogos resistentes (C13 * e A2780cp, respectivamente), e células SKOV3 nulos p53 foram cultivados como relatado anteriormente pelo nosso laboratório [25] – [31]. As células, colocadas em placas a uma densidade de 5 x 10
4 células /cm
2, foram infectadas com os vectores de expressão de adenovírus ou transfectadas com ARNsi ou tratadas com SB225002 recentemente preparado sob condições isentas de soro. O meio condicionado (10 ml) foram concentrados com Amicon Ultra-4 filtro de centrífuga (Millipore Corporation, Billerica, MA) para um volume final de 200 ul para análise subsequente.
A extracção de ARN, síntese de ADNc e em tempo real de RT- PCR
o ARN total foi extraído (RNeasy Mini Kit. Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Os ADN complementares foram gerados usando oligo (dT) com iniciadores MMuLV transcriptase inversa (kit de Retroscript; Ambion). PCR quantitativo em tempo real foi realizado com os seguintes iniciadores: GRO-1: F: TGCAGCTGTGTCTCTCTTTCCTCT e R: AAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCC; IL-8: F: AGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCT e R: AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG; CXCR2: F: AGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCA e R: AGTGGAAGTGTGCCCTGAAGAAGA; F: GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT e R: GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT para GAPDH. reacção de amplificação foi realizada utilizando o kit QuantiTect SYBR Green PCR. As condições dos ciclos térmicos incluído um passo inicial de desnaturação (95 °, 15 min) e seguido por PCR (95 ° durante 15 min, 50 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 56 ° durante 20 s, e 72 ° durante 30 seg). Os produtos de PCR foram subsequentemente fundidos a 60 ° C durante 30 seg e abundância de ARNm de IL-8, GRO-1 e CXCR2 foram expressos como uma razão para os valores de GAPDH. Cada valor foi comparado com o de OV2008.
Adenovirus Infecção, interferência de RNA e Tratamento SB225002
células SKOV3 foram infectadas com adenovírus de tipo selvagem p53 ou o controlo LacZ (MOI = 10) [25] . Vinte e quatro horas após a infecção, as células foram tratadas com SB225002 (750 nM, 24 h ou 48 h). células OV2008 e C13 * foram transfectadas com ARNsi de p53 (100 nmol /L; 36 h). ou sequência de encriptação (controlo) [26] e, em seguida, tratada com SB225002
análise de Western
Western blotting foi realizada como descrito anteriormente [25], [26]. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário (anti-p53 1: 10.000; anti-fosfo-p53 (S15) 1:1,000; anti-Chk1 1: 1000; anti-fosfo-Chk1 (S345) 1:1,000; anti-fosfo-Chk1 (S317) 1:1,000; anti-caspase 3 1: 1000; anti-PARP, 1:1,000; anti-fosfo-Histona 3 (S10; 1:1,000), anti-GAPDH, 1:20,000) , seguido de incubação (temperatura ambiente, 1 h) com peroxidase de rábano anti-coelho conjugado ou anticorpo secundário anti-ratinho (1:5,000). A atividade da peroxidase foi visualizado com ECL kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Os resultados foram verificados e analisados utilizando Scion software de imagem (Scion, Inc., Frederick, MD).
iodeto de propídio Coloração e Citometria de Fluxo
flutuante e células aderentes foram coletadas e fixadas em 70% de etanol durante a noite. Eles foram tratados com ARNase A e incubadas com iodeto de propídio (50 ug /ml; PI) e foram analisadas num Beckman Coulter FC500. Para a identificação das células mitóticas, as células foram incubadas (2 h, TA) com H3-anti-fosfo histona (Alexa 488, 1:10, Cell Signaling) e lavada com PBS antes da coloração de PI. Para detectar a expressão de expressão CXCR2 em OVCAs, as células foram colhidas e lavadas em PBS, em seguida, imediatamente coradas por um ensaio de imunofluorescência standard com ficoeritrina (PE) -conjugated CXCR2 mAb anti-humano ou o anticorpo isotipo anti-humano conjugado com PE (BD Pharmingen). A percentagem de células CXCR2-positivas foi determinada por citometria de fluxo.
Imunofluorescência
As células foram fixadas e permeabilizadas, em seguida, bloqueadas com BSA a 2% seguido de incubação (dia para o outro, 4 ° C) com conjugado com FITC de ratinho anti-beta-tubulina (1:50) ou IgG de isotipo conjugado com FITC (controlo negativo). Após lavagem, a mancha nuclear Hoechst (33258) foi adicionado às células, que foram montados com Vectashied (Vector, Burlingame, CA, EUA). imagens Florescence foram capturadas usando um microscópio Leitz DMRX e analisados com o Adobe Photoshop 7,01 (Adobe, Ottawa, Canadá).
Chromosome Espalhe Ensaio
espalha cromossômicas foram preparados usando o protocolo padrão [32] ; DNA foi corado com 0,1% verde SYTOX, e as imagens foram obtidas com um microscópio Leitz DMRX.
Avaliação da apoptose
Em anexo e as células flutuantes foram novamente suspensos em formol neutro tamponado (4%), contendo Hoechst 33258 corante (3,75 ng /mL, 24 h). A percentagem de apoptose foi determinada por meio da morfologia nuclear. Pelo menos 400 células foram contadas em cada grupo com o contador “cegos” para provar a identidade para evitar a polarização experimental [25], [26].
Análise estatística
Todos os resultados são apresentados como média ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias e Bonferroni pós-teste foi utilizado para determinar diferença estatística entre os grupos experimentais (software Prism versão 5.0, GraphPad, San Diego, CA). A significância estatística foi inferida a P . 0,05
Resultados
A expressão de CXCR2 e seus ligantes IL-8 e GRO-1 em células CDDP-sensíveis e resistentes ao OVCA
em primeiro lugar, examinou ARNm e proteína conteúdo de CXCR2 e seus ligandos IL-8 e GRO-1 em dois pares de linhas celulares OVCA CDDP sensíveis e resistentes ao. A citometria de fluxo revelou que CXCR2 foi positiva em 9,08%, 5,87%, 6,66% e 7,63% de OV2008, C13 *, A2780s e células A2780cp, respectivamente, e não mostrou diferença significativa entre as linhas de células. Da mesma forma, não houve diferença significativa na abundância de ARNm de CXCR2 (Fig. 1A). Em contraste, a IL-8 foi expresso principalmente em linhas de células OV2008 e C13 *, enquanto GRO-1 foi predominantemente em células A2780s e A2780cp, tanto a nível de ARNm e de proteína. Secreção de IL-8 foi 5 vezes superior em C13 * do que em OV2008, enquanto GRO-1 secreção foi 5 vezes superior em A2780s do que em células A2780cp (Fig 1B, 1C.)
A:. CXCR2 ARNm e a expressão da proteína em células OVCA quimiossensíveis (OV2008 A2780s) e o seu homólogo resistentes (C13 * A2780cp, respectivamente) foi determinado por qPCR (esquerda) e citometria de fluxo (para a direita, a linha mais escura representa o controlo do isotipo, a linha mais clara representa as células de coloração CXCR2). B C: ARNm e abundância de proteínas de secreção de IL-8 (B) e GRO-1 (C) [Western blot (superior) e qPCR (inferior)]. Os dados estão expressos como médias ± SEM de três experiências. imagens representativas da FCM e Western blot são mostrados.
SB225002 induzida Apoptose e Mitose em ambas as células CDDP-sensíveis e resistentes ao OVCA
Para determinar se o CXCR2 antagonista SB225002 causaria celular morte em células OVCA sensíveis a cisplatina e resistentes ao, nós avaliadas apoptose morfologicamente em OV2008 /C13 * (tanto do tipo p53-selvagem) e A2780s /A2780cp (p53-tipo selvagem e mutante p53, respectivamente), as células seguintes SB225002 ou CDDP tratamento para 24 h. Como esperado, a CDDP induziu apoptose (evidentes por encolhimento citoplásmico, condensação de cromatina e fragmentação nuclear) em células sensíveis à quimioterapia (OV2008 e A2780s), mas não nas células resistentes (C13 * e A2780cp). Em contraste, a apoptose induzida SB225002 em todas as linhas celulares de um modo dependente da concentração (Fig. 2A), uma observação suportado por activação da caspase 3 e a clivagem de PARP (Fig. 2B). Interessantemente, as células “flor-like” com cromossomas condensados e maiores eram evidentes após a exposição a SB225002 (≥500 nM; Fig. 2C)., Que está associada com o aumento da acumulação de células em G2 /M e sub-G1 fases (Figura 2D – superior). A maioria da população aumentada fase G2 /M foi de células positivas H3-fosfo-histona (Fig. 2D-baixo), o que sugere que SB225002 aumenta o número de células mitóticas, possivelmente por qualquer promover a mitose entrada prematura ou atrasar a saída da mitose.
a: CDDP (0-10? M, 24 h) induziu apoptose em OV2008 sensíveis à quimioterapia e A2780s mas não os seus homólogos resistentes C13 * e A2780cp, enquanto SB225002 (0-1000 nM, 24 h) induziu apoptose em todas as células linhas. Os OVCAs foram tratadas com diferentes concentrações de ou SB225002 de CDDP, durante 24 h. O ligado (viável) e flutuante células (apoptose) foram reunidas, lavadas e ressuspensas em formalina neutra tamponada (4%) contendo corante Hoechst 33258 (3,75 ng /mL, 24 h). A percentagem de apoptose foi determinada com base na morfologia nuclear. Pelo menos 400 células foram contadas em cada grupo e o contador de “cego” para provar a identidade para evitar viés experimental. B: SB225002 induzida ativação caspase 3 e clivagem PARP (Western blot) em todas as células OVCA examinados. C: SB225002 induzida características morfológicas de apoptose em OV2008, que foi acompanhada por mitose de células do tipo. A análise por citometria de fluxo da distribuição do ciclo celular de OV2008 após o tratamento SB225002 a várias concentrações (0, 250, 500, 750 e 1000 nM) durante 24 h: D. As células na fase M, foram identificados com anticorpos anti-fosfo-Histona H3 (P-H3), como mostrado nos gráficos de pontos (inferior). As imagens são representativos de pelo menos três experiências.
SB225002 Apoptose Induzida em células do tipo selvagem através OVCA P53 p53 A activação
P53 é essencial para a indução de apoptose em células OVCA, e é um determinante de sensibilidade CDDP [25]. Como mostrado na Fig. 3A, SB225002 (≥500 nM) significativamente up-regulamentado p53 total e fosfo-p53 (Ser15) em todas as linhas de células examinadas. Silenciamento de p53 por ARNsi regulada negativamente a apoptose induzida por ambos os SB225002 em OV2008 e C13 * células (Fig. 3B), o que sugere que SB225002 induz a apoptose através da activação de p53. Em contraste, o número de células positivas H3-fosfo-histona não foi afectada por p53 siRNA (Fig. 3C), sugerindo o papel de p53 na apoptose induzida por SB225002 não é dependente da acumulação de células mitóticas.
a: SB225002 (0-1000 nM, 24 h), aumento do nível de fosfo-p53 (S15) C- total e em OV2008, C13 *, células A2780s e aumento da fosfo-p53 em células A2780cp. SB225002 aumentou a razão fosfo-p53 /p53-total em todas as linhas celulares (Western blot). B: Silenciando p53 [p53 siRNA (100 nM, 36 h, ou embaralhar siRNA (controle)] diminuiu SB225002 (750 nm, 24 h) induzida por apoptose, mas não mitose em OV2008 e C13 * células C:. Silenciando p53 não teve efeito sobre o número de células de entrar em mitose em células OV2008 e C13 * tratados com SD225002 a 750 nm. celular na mitose foram identificados por FCM, utilizando anti-fosfo-histona H3 (P-H3).
SB225005 Induced acumulação de pré-madura mitose a apoptose subsequente em p53 do tipo selvagem e deficiente OVCA Cells
Desde SB225002 induzida acumulação mitose em ambas-wild-type p53 e células OVCA deficientes, nós ainda determinado se o SB225002 acumulação de células mitóticas induzida contribuiu para a apoptose. SB225002 tratamento causou um aumento dependente do tempo na percentagem de células mitóticas (fosfo-Histona H3 positivo), que começou às 6 h, e aumentando a duração de 24 h, em seguida a diminuir subsequentemente. SB225002 induziu um aumento no final de população celular na fase sub-G1 (apoptose), com início às 12 h e atingindo um máximo de 48 h. A perda dependente do tempo em células mitóticas após 24 h de exposição de SB225002 foi associada com um aumento acentuado em células apoptóticas, sugerindo que SB225002 causada células OV2008 a prender na mitose antes de progredir para apoptose (Fig. 4A)
.
a: indução dependente do tempo da mitose (círculos a cheio) e, subsequentemente, a apoptose (quadrados a cheio) em células OV2008 por SB225002. B: 24 h após o tratamento SB225002, fusos mitóticos foram visualizados com um Fluor® Alexa conjugado com anti-α-tubulina (verde) e contra-coradas com Hoechst (azul). Nas células de controlo, fuso bipolar normal foi bem organizado com cromossomas condensados altamente alinhadas ao longo das placas equatoriais durante cromatídeos meta-fase e irmã segregados no estabelecimento da anafase (B-1). células tratadas com SB225002 exibida aberrações mitóticas. As frequências de material cromossómico de retardamento, fusos mitóticos multipolares e núcleos múltiplos foram todos aumentados em células tratadas com SB225002 (B-2, B-3). C:. Cromossoma espalha mostrando induzida por SB225002 aneuploidia /poliploidia
A morfologia das células que sofrem mitose induzida por SB225002 foi ainda confirmada por formação do fuso, a condensação da cromatina, e β-tubulina e separação do ADN. Nas células de controlo, fuso bipolar normal foi bem organizada de uma forma oval, cromossomas condensados altamente alinhadas ao longo das placas equatoriais durante cromatídeos meta-fase e irmã segregados no estabelecimento da anafase. SB225002 aumentou a formação de determinados tipos de fusos multipolares, como em pseudobipolar, tripolar e células multinucleadas. Não havia qualquer condensação dos cromossomos durante a prófase, ou os cromossomas condensados não conseguiu alinhar corretamente ao longo das placas equatoriais durante a metáfase mas em vez se espalhar por todas as células. Celular anaphase entrar mostraram atraso cromossomo óbvio, indicativo de segregação cromossômica anormal em células mitóticas SB-225002-presos. SB225002 também induziu o aparecimento de múltiplos núcleos, que foi mais freqüente com uma exposição mais longa (Fig. 4B). mitose anormal foi associada com células aneuploidia /polyploidy, como verificado por espalhar cromossomo ensaio (Fig. 4C). Colectivamente, os nossos dados mostraram que SB225002 causada fusos mitóticos anormais, segregação cromossoma alterada em células mitóticas presos, e resultou em divisão anormal de células e formação de múltiplos núcleos, os quais eram indicativos da mitose prematuro, um evento levou a catástrofe mitótica.
induzida por SB225002 mitótico Catástrofe é através de Chk1 Down-regulação e Cdk1 Activation
resultados de danos ao DNA na ativação Chk1, o que leva à degradação CDC25, diminuição da atividade Cdk1 e paragem G2 [10]. Nós demonstramos que as células tratadas com SB225002 OVCA saiu fase G2 e entrou fase M, e foram submetidos a mitose prematura, sugerindo G2 /M, a desregulação da barreira da fase. Portanto, nós investigamos se Chk1 inactivação e activação Cdk1 foi envolvido na ação SB225002. SB225002 diminuição total e fosfo-Chk1 (S345) os níveis de uma forma dependente da concentração (Fig. 5A), sugerindo que a promoção da entrada prematura mitose por SB225002 está associada com a inibição de Chk1 e activação prematura Cdk1. Esta ideia foi suportada pela observação de que o pré-tratamento com o inibidor de Cdk1 roscovotine impedido acumulação celular induzida por mitótico SB225002 e apoptose (Fig. 5B). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que SB225002 é capaz de promover a apoptose através de catástrofe mitótica muito provavelmente através da activação Cdk1
A:. SB225002 (0-1000 nM, 24 h) reduziu total e fosfo-Chk1 (S317 e S345 ), os níveis em células OV2008. B: Pré-tratamento de células OV2008 com roscovotine (12 h) atenuado SB225002 (750 nM, 24 h) induzida pela acumulação de fase M e subsequente apoptose reduzida. * P . 0,05 (em comparação com somente SB225002)
Reconstituição de tipo selvagem P53 em OVCA celular atenuada mitótico Catastrophe induzida por SB225002 p53
Para determinar se p53 está envolvido em mitótico catástrofe induzida por SB225002, a linha celular de cancro do ovário SKOV3 p53 nulo foi tratada com SB225002. SB225002 induziu uma acumulação, dependente da concentração de células mitóticas e apoptose em células SKOV3 (Fig 6A . 6B). O aumento em apoptose e temporalmente foi relacionada com a mitose induzida por SB225002 (Fig. 6 C), dependente do tempo, o que sugere que a p53 é desnecessária para a catástrofe mitótica induzida por SB225002. Para avaliar ainda mais a acção da p53 em catástrofe mitótica induzida por SB225002, nós examinamos se a reconstituição de p53 de tipo selvagem em células deficientes em p53 poderia alterar mitótico acumulação induzida por SB225002 e apoptose. células SKOV3 foram infectadas com adenovirus de tipo selvagem p53 (confirmada por Western blot; a Fig. 6D). Como esperado, a exposição de SB225002 sozinho induzida nomeadamente mitose às 24 h, e marcada apoptose às 48 h. Reconstituição de p53 de tipo selvagem marcada impediu a mitose induzida por SB225002 às 24 h, e atenuou a apoptose induzida por subsequente SB225002 às 48 h (Fig. 6D, 6E). A apoptose foi ainda confirmada por clivagem de PARP às 24 h por Western blot (Fig. 6D). Os nossos resultados indicam que a p53 induzida atenua-SB225002 tarde apoptose através de suprimir a acumulação prematura de células em mitose. Em conjunto, esses resultados sugerem que a p53 desempenha papel oposto na apoptose induzida por SB225002 de células OVCA, induzindo a apoptose clássico através da activação p53 e prevenir a apoptose através de catástrofe mitótico
A:. SB225002 (0-1000 nM, 24 h) apoptose induzida em células SKOV3 (superior). B: SB225002 aumentou células SKOV3 na fase sub-G1 (celular por apoptose) e mitose (fosfo-histona H3-positivos; dot parcelas). C: Time-curso de induzida por SB225002 a mitose (círculos preenchidos) e apoptóticos (preenchido quadrados) [citometria de fluxo]. D E: infecção de p53 de tipo selvagem Adenviral (MOI = 10; LacZ adenoviral para equalizar total de MOI em cada grupo experimental) de SKOV3 atenuada SB225002 (750 nM; DMSO como controlo) e a apoptose induzida por mitose subsequente. conteúdo p53 e clivagem PARP foram avaliados em 24 h (Western blot). a progressão do ciclo celular foi avaliada por citometria de fluxo. Os valores são média ± SEM. * P ≤ 0,05 (comparado com o controlo DMSO-).
# P ≤ 0,05 (em comparação com células tratadas com SB225002).
induzida por SB225002 apoptose e catastrófico mitose não foi através do bloqueio CXCR2 Receptor Signaling
Desde SB225002 é um específico antagonista não peptídico de CXCR2, nós então investigado se a acção de SB225002 é mediada através de CXCR2. Em primeiro lugar, pré-tratado células OV2008 e C13 * com diferentes concentrações de IL-8, durante 2 h antes da sua cultura com SB225002 (750 nM) durante um adicional de 24 h. Inesperadamente, o pré-tratamento com IL-8, GRO-1, ou não conseguiu inibir a mitose induzida por SB225002 ou apoptose (Fig. S1A), indicando que a mitose e a apoptose induzida por SB225002 não podem ser mediadas através de CXCR2. Além disso, o pré-tratamento das células com anticorpo neutralizante de CXCR2 e outro antagonista de /CXCR2-G31P [33] CXCR1 teve nenhum efeito sobre a basal ou a apoptose induzida por SB225002 e mitose em OV2008 e C13 * (Fig. S1B e S1C). Além disso, outro inibidor específico de CXCR2, SB265610 teve nenhum efeito sobre a basal e a apoptose induzida por SB225002 e paragem da mitose (Fig S2A . B C) e inibição de activação de p53 e de Chk1 em OV2008 (Fig S2D.). Juntos, estes resultados suportam a noção de que SB225002 induz a apoptose ea catástrofe mitótico em células OVCA independentes do CXCR2.
Discussão
No presente estudo, nós demonstramos que SB225002, um não-peptídeo antagonista CXCR2, é eficaz na indução de apoptose em interphases checkpoint e mitose em ambas as linhas celulares OVCA CDDP-sensíveis e resistentes ao com status de p53 diferente. O tratamento das células cancerosas com SB225002 resultou em apoptose mediada por p53 clássica mas também desencadeada catástrofe mitótica em p53 do tipo selvagem e deficientes em células OVCA. SB225002 induzida mitótico catástrofe através da promoção de fusos mitóticos anormais, alterando cromossomo segregação nas células mitóticas presos, e causou a divisão celular anormal e formação de múltiplos núcleos. Estas alterações foram revogados pelo roscovotine, sugerindo que a ciclina B /CDK1 tinha sido activado através de sub-regulação da cinase Chk1 do ponto de verificação. Os efeitos de SB225002 não foram modulados por pré-tratamento com ligandos de CXCR2 ou seu anticorpo neutralizante, nem mimetizado por outro CXCR2 antagonista SB265610 ou G31P. Nosso estudo fornece a primeira demonstração de que SB225002 morte celular induzida não só através de apoptose convencional, mas também uma catástrofe mitótico através de um modo independente de CXCR2.
Nosso estudo mostrou que ambos p53 do tipo selvagem e as células OVCA deficientes são sensíveis a SB225002 na indução de apoptose, apesar de através de diferentes mecanismos. P53 tanto pode desencadear apoptose através da activação de intrínseca (mitocondrial) e extrínseca (morte do receptor) através da via apoptótica genómico [33], [34] e não genómicos [27], [28] mecanismos.